Name: Geração de mídia e aplicativos Organ-condicionado para o Estudo Influências específicas do órgão em cancro da mama metastático Comportamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a gerar meios condicionados de órgãos de camundongos para estudar fatores solúveis que influenciam o comportamento metastático de células de câncer de mama.

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Este trabalho foi apoiado por doações da Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, da Canada Foundation for Innovation (nº 13199) e do apoio de doadores de John e Donna Bristol por meio da London Health Sciences Foundation (para A.L.A.). O apoio à bolsa de estudos e bolsas de estudo foi fornecido pelo programa de Bolsas de Pós-Graduação de Ontário (Província de Ontário, para GMP e JEC), o programa de Bolsa de Pós-Graduação do Canadá - Mestrado (para MMP), o Programa de Treinamento Estratégico dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (para MMP, GMP e JEC) e a Unidade Translacional de Pesquisa de Câncer de Mama Pamela Greenaway-Kohlmeier no Programa Regional de Câncer de Londres (para MMP, G.M.P., J.E.C. e Y.X.). A.L.A. é apoiado por um Prêmio CIHR de Novo Investigador e um Prêmio de Pesquisador Inicial do Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário.

Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care, no âmbito de protocolos aprovados pelo Uso de Animais Subcomissão Western University. 1. Isolamento de órgãos (pulmão, cérebro, ossos, gânglios linfáticos) <ol><li> Prepare quatro tubos de 50 ml estéreis cónicos (um para cada órgão a ser isolado) contendo aproximadamente 30 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Pré-pesam cada tubo de PBS utilizando uma balança eletrônica. </li><li> Eutanásia 6-12 semana rato velho por inalação de CO 2. Os ratos devem ser deixada na câmara de CO 2, durante cerca de 1 - 2 minutos ou até que o rato para de se mover e de respiração. eutanásia bem sucedida pode ser ainda confirmada pela falta de batimentos cardíacos quando verificados manualmente com um dedo. Evite deslocamento cervical como este método pode romper vasos sanguíneos do pescoço levando a dificuldade em retirar os gânglios linfáticos axilares. Nota: Os trabalhos anteriores usado especificamenteratinhos nus femininos saudáveis, Hsd: atímicos Nude- Foxn1 nu 13. </li><li> Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, coloque o mouse sobre as suas costas em uma almofada de espuma de poliestireno, espalhar os membros e usar pinos para mantê-los no lugar. </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras estéreis, cortar a pele abdominal na linha média na genitália e cortar para cima em direção à boca. Gentilmente puxar para trás a pele abdominal dos músculos abdominais e pinos no local no bloco de espuma de poliestireno. </li><li> Localize a axilar, braquial, e linfonodos inguinais. Nota: Os linfonodos são geralmente rodeado por tecido adiposo. Os nódulos linfáticos inguinais são os mais fáceis de localizar como eles são encontrados superficialmente na junção de dois vasos sanguíneos na pele abdominal puxado para trás. Axilares e linfáticos braquial nós estão localizados mais profundamente no tecido e exigem manobras suave de tecido. <ol><li> Depois de ter localizado os gânglios linfáticos, use a tesoura para cortar suavemente e com cuidado a linfa nãodes longe da pele, a gordura e os vasos e removê-los do rato. Para confirmar dissecção adequada, rolar a pinça sobre o tecido removido. Se um nódulo duro existe quando rolar a pinça sobre o tecido, em seguida, um nó de linfa tem provavelmente foi removido com sucesso. </li><li> Coloque linfonodos removidos em PBS gelado. </li></ol></li><li> Usando os fórceps e tesouras, abrir a cavidade abdominal, cortando através da parede abdominal exposta em um movimento ascendente em direcção ao peito. Cuidadosamente cortar o esterno, expondo a cavidade torácica. </li><li> Localize o diafragma abaixo dos pulmões e corte do diafragma. Ele deve puxar para as costelas devido à tensão. </li><li> Levante os pulmões de baixo e cortar o tecido subjacente para a traqueia. Isto permite que os pulmões para ser removida livremente a partir da cavidade torácica. Retire o coração e os pulmões em bloco e coloque em PBS gelado. O coração pode ser removido dos pulmões aqui ou apenas antes da pesagem no Passo 2. </li><li> Remova opinos, mantendo o mouse no lugar sobre a almofada de espuma de poliestireno. Vire o mouse e cortar a pele da parte inferior das costas todo o caminho através de flanco para flanco. </li><li> Usando um pedaço estéril de gaze para manter o torso do mouse, tirar a pele de trás do mouse sobre as pernas e os pés do mouse. </li><li> Usando o mesmo pedaço de gaze estéril, segure a perna no lugar, cuidadosamente quebrar a articulação do tornozelo do pé mouse e descascar a pele sobre a articulação proximal para a articulação do joelho. </li><li> Com uma tesoura, retire a tíbia livre da articulação do joelho e coloque em PBS gelado. </li><li> Repita os passos de 1,11) a 1,12) com o membro oposto. </li><li> Utilizando uma pinça, segure o fêmur no lugar, cortar o tecido circundante muscular usando a tesoura e remova o fêmur, colocando-o em PBS gelado. </li><li> Repita o passo 1.14) com o membro oposto. </li><li> Usando um novo pedaço de gaze estéril, segure a cabeça do rato no lugar. Utilizando uma pinça e tesouras, remover suavemente a pele para expor as skull. Com uma tesoura, corte cuidadosamente o crânio occipital do centro da parte superior em uma linha reta e para baixo para expor o cérebro posterior. </li><li> Usando fórceps, escavar por debaixo do cérebro para o anterior e remover todo o cérebro. Coloque o cérebro em PBS gelado. </li><li> Repita os passos 1.1) a 1,17) durante pelo menos quatro ratos. </li></ol> 2. Órgão Pesando <ol><li> A seguir ao isolamento de órgãos, pesam cada tubo PBS contendo pulmão e tecido do cérebro utilizando uma balança electrónica. </li><li> Calcula-se a diferença de peso, subtraindo o peso pré-isolamento (apenas PBS) a partir do peso do tubo de PBS + órgãos (pulmão e cérebro). </li><li> Determinar a quantidade de meios necessários para ressuspender os fragmentos de tecido a partir da diferença de peso calculado. Nota: de pulmão e tecido cerebral são em peso normalizada, por re-suspensão em uma mistura 4: 1 de meios: proporção tecido (vol / peso). </li></ol> 3. Geração de Mídia Lung- e cérebro-condicionado <ol><li> Num t estérilemissão cultura capô, inverter tubos PBS contendo pulmão ou cérebro três vezes para remover o sangue residual de órgãos e aspirado PBS contendo sangue. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue. </li><li> Coloque pulmões e cérebros em separado 60 milímetros 2 pratos de petri de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, pulmões moer ou cérebros por várias vezes cortar e para trás até fragmentos de tecido são aproximadamente ~ 1 mm3 de tamanho. </li><li> Ressuspender fragmentos de tecido num volume apropriado (previamente determinado no passo 2.3) de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): F12 suplementado com suplemento concentrada 1x penicilina e mitogénio (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml). </li><li> Adicionar fragmentos pulmonares ou tecido cerebral ressuspensos para um poço de uma placa de 6 poços. </li><li> Incubar fragmentos de tecidos em meio, durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Após a incubação, recolher meios condicionados para cada tecido e fUTRAS diluir pela adição de três volumes equivalentes de meio fresco em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg em meios condicionados diluídos para cada órgão a 4 ° C durante 15 min para remover grandes restos de tecido. Recolher o sobrenadante de mídia e filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 mM. </li><li> Piscina meios condicionados de cada órgão (ie., Pulmão com pulmão e cérebro com cérebro) a partir de vários ratos para explicar a variabilidade do mouse-a-mouse. Alíquotas e armazenamento de meios condicionados à temperatura de -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 4. geração de mídia de Medula Óssea condicionado <ol><li> Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, aparar o excesso de tecido do osso e remover epífises (peças finais) dos ossos com uma tesoura. </li><li> Usando uma agulha G 27 ½, cavidade medular dos ossos descarga, empurrando 1 ml de PBS através do centro de cada osso. Isso permitirá que você para coletar células do estroma da medula óssea (BMSC) para um tubo fresco contendo PBS. </li><li> Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C e lava-se duas vezes com PBS BMSC. Ressuspender as células do estroma da medula óssea em 20 ml de meio de crescimento de células de estroma ósseo (DMEM: F12 suplementado com 1x concentrada mitogénio suplemento, penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) e 10% de soro Boven fetal (FBS) ). </li><li> Placa 10 ml de células estromais de medula óssea ressuspensas em um frasco T75. Nota: Combine e células da placa de cada 2 ratos em cada frasco T75; por quatro camundongos, dois frascos T75 são necessários (cerca de 1 x 10 7 células / frasco). </li><li> Incubar as células do estroma da medula óssea em meio de crescimento de células de estroma ósseo durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Após a incubação, remover a mídia de ambos os frascos T75 e colocar em novo frasco T75, rotular este frasco como &quot;Floater Flask&quot;. Adicionar meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo para frascos anteriores 2 e incuba-se todos os frascos de 3 a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Depois de células atingirem aproximadamente 70% de confluência (aproximadamente 5-7dias), as células de passagem. Para fazer isso, remover o meio e lavar as células duas vezes com PBS (3 mL cada lavagem). Remover PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina / EDTA, assegurando que a tripsina cobre toda a superfície do frasco. Depois de células retire o frasco (~ 2-3 min), pare tripsinização reacção por adição de 3 ml de osso meio de crescimento de células do estroma). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar meios de comunicação, e ressuspender as células em 10 ml de meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo. </li><li> Células de associação de todos os frascos e a passagem 1: 5 em três novos frascos T75 e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. Depois de as células mais uma vez chegar a 70%, repita o passo 4.6 e piscina e de passagem todas as células aderentes uma segunda vez. Re-placa de todas as células para frascos T75 e quatro incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. meios de crescimento celular de estroma ósseo deve ser utilizado para todos os passos. </li><li> F12 + 1x mitogen concentrada su: permitir que as células para alcançar a confluência, lavar as células três vezes com PBS e adicionar estromal meios de recolha de células ósseas (DMEMpplement + penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml); 10 ml / T75), certificando-se que esta mídia é livre de FBS. Recolha de meio condicionado de medula óssea de 72 horas mais tarde, filtra-se através de um filtro de 0,22 um, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Se desejado, confirmar o fenótipo das células do estroma da medula óssea (BMSC) isolados utilizando anticorpos contra a Sca-1 de rato, CD105, CD29, e CD73, CD44, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente 13. </li></ol> 5. geração de mídia Linfonodo condicionado <ol><li> Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, inverter tubo PBS contendo nódulos linfáticos três vezes para remover o sangue residual de nódulos linfáticos e aspirado sangrenta PBS. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue. </li><li> Coloque os gânglios linfáticos em placas de Petri de 60 mm2 de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, gânglios linfáticos picada por várias vezes cortar e para trás até tissue fragmentos são aproximadamente 1 mm 3 de tamanho. </li><li> Num tubo de cónico, fragmentos de tecido ressuspender em 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) meio suplementado com penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M estéril β-mercaptoetanol ( 1,75 ul / 500 ml de meio) e 10% de FBS. </li><li> Centrifuga-se a 900 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar todas as células em 30 ml de meio. Adicionar 5 ml de meio / poço numa placa de 6 poços e incubar durante 7 dias a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Após a 7 dias de incubação, descartar meios, lavar as células aderentes com 5 ml de PBS morno e adicione 5 ml de meio fresco a cada poço. Permitir que as células crescer até à confluência (aproximadamente 5 - 7 dias), trypsinize, reunir todas as células, e passagem tal como descrito no passo 4.6. células re-placa para placa de 6 poços. Repita este passo três vezes. </li><li> Depois de três passagens, permitir que as células crescer até à confluência, lavar os poços três vezes com PBS e adicionar 2 ml / poço de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / mL), assegurando que este suporte é livre de FBS. Recolha meios condicionados-linfonodos após 72 horas, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até o uso. </li><li> Se desejado, confirmar o fenótipo das células dos nodos linfáticos do estroma isoladas (LNSC) utilizando anticorpos contra CD45 e gp38 de rato, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente 13. </li></ol> 6. Uso de Mídia Organ-condicionado para ensaios a jusante relacionadas com o comportamento metastático das células cancerosas <ol><li> Uma vez que os meios condicionados por órgão foi gerada tal como descrito nos passos 1 - 5, utilizá-lo para levar a cabo a jusante da célula diferente e ensaios de biologia molecular, a fim de determinar a influência de factores derivada de órgãos solúveis sobre o comportamento metastático de células cancerosas. Exemplos de ensaios normalizados descritos noutro local (na literatura) incluem matrizes de proteína 13, ensaios de crescimento celular &lt;sup&gt; 13, a migração celular Ensaios 13, tumorsphere formação 14, e RT-PCR 15. Os meios de base original utilizado para gerar o meio condicionado de órgão (ou seja, não condicionado DMEM:. Meio F12 suplementado com 1x concentrada suplemento mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) deve ser usado como um controlo negativo . </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A metástase é um processo complexo pelo qual uma série de eventos celulares são responsáveis ​​por invasão de tecido e tumor distante estabelecimento 4,30,31. O sistema modelo ex vivo aqui apresentada pode ser utilizada para estudar dois aspectos importantes da progressão metastático: homing célula de cancro ou de migração de um órgão específico ( &quot;chegar&quot;) e o crescimento neste órgão ( &quot;crescendo lá&quot;). Muitos estudos têm focado anteriormente na identificação de características mo...

O câncer de mama é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em mulheres ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer 1. alta taxa de mortalidade do câncer de mama é principalmente devido à falha da terapia convencional para reduzir e eliminar a doença metastática; aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer é atribuída a metástases 2. A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes da cascata metastática é fundamental para o desenvolvimento de terapias eficazes, tanto precoce e cancro da mama de fase tardia. A pesquisa passada ajudou a elucidar a natureza de várias etapas de metástase do câncer de mama e é a hipótese de que o resultado de ambos progressão e metástase do câncer é em grande parte dependente das interações entre células cancerosas e o ambiente host 3. As observações clinicas indicam que muitos cancros mostrar tropismo de órgãos, isto é., A tendência para metastizar preferencialmente a organs.In específica do CASe de cancro da mama, doença de um paciente geralmente se espalha ou metástases para 5 locais principais, incluindo o osso, pulmões, nódulo linfático, fígado, cérebro e 06/04. Muitas teorias têm sido desenvolvidas para explicar esse processo, mas apenas alguns têm resistido ao teste do tempo. A teoria de Ewing de metástase, proposto na década de 1920, a hipótese de thatthe de distribuição de metástase era estritamente devido a fatores mecânicos; pelo qual as células de tumor são realizadas por todo o corpo por padrões de fluxo sanguíneo fisiológico definidos normais e simplesmente prender no primeiro leito capilar encontram 7. Em contraste, a &quot;semente e solo&quot; hipótese de Stephen Paget 1889 sugeriu que as interações moleculares adicionais foram responsáveis ​​pela sobrevivência e crescimento de metástases, através do qual as células cancerosas ( &quot;sementes&quot;) só pode estabelecer-se e microambientes órgãos proliferatein que produzem factores moleculares apropriados ( &quot;solo &quot;) 8. Quase um século depois, Leonard Weiss sobtomou uma meta-análise dos dados da autópsia confirmou anteriormente publicados e predição de Ewing que muitos tumores metastáticos detectados na altura da necropsia foram encontrados nas proporções esperadas, que seria de esperar se o tropismo órgão metastática foi determinada por padrões de fluxo sanguíneo sozinho. No entanto, em manyinstances havia menos ou mais metástases formadas em certos locais, então seria de esperar por um projecto de factores mecânicos de Ewing 9. Estas contas e teorias sugerem que microambientes de órgãos específicos desempenham um papel fundamental nos padrões de divulgação e subsequente crescimento e sobrevivência de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama. Os esforços de investigação anteriores têm focado principalmente em fatores derivados de células do tumor e sua contribuição para o tropismo órgão observado na metástase do câncer de mama 10-12, fatores no entanto pouca pesquisa tem explorado derivados do microambiente órgão que pode fornecer um nicho favorável para o estabelecimentode metástases de cancro da mama. Esta é em grande parte atribuível aos desafios técnicos de estudar os componentes do microambiente do órgão in vitro. O presente artigo descreve um sistema abrangente vivo ex modelo para estudar a influência dos componentes solúveis do nó de linfa, osso, pulmão, cérebro e no comportamento metastático de células de cancro da mama humano. Estudos anteriores validaram este sistema de modelo, demonstrando que as linhas celulares de cancro da mama diferentes exibir comportamento maligno específica de órgãos-específico da linha de células e em resposta a meio condicionado de órgãos que corresponde ao seu potencial metastático in vivo 13. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar os factores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e outros tipos de células cancerosas, incluindo influências sobre o crescimento, a migração, caule-como o comportamento, e a expressão do gene, , bem como a identificação depotenciais novos alvos terapêuticos para o cancro. Este é o primeiro sistema ex vivo modelo que pode ser utilizado para estudar o comportamento metastático específico do órgão em pormenor e para avaliar o papel de factores solúveis derivados de órgãos na condução do processo de metástase do cancro.

<table><tbody><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Mantenha estéril</td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Mantenha os camundongos nus estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>Use às 6 - 12 semanas de idade Almofada de</td></tr><tr><td>espuma de poliestireno</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>A tampa descartada (~ 4 x 8 polegadas ou maior) de um contêiner de espuma de poliestireno pode ser usada para essa finalidade. Esterilize limpando com etanol.</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Mantenha a tesoura estéril</td></tr><tr>Ferramentas<td>de</td><td>Fine Science</td><td>14058-11</td><td>Mantenha as compressas de gaze estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Mantenha estéreis</td></tr><tr><td>placas de Petri de vidro de 60 mm2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td> Mantenha as lâminas de bisturi <td>estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Mantenha o DMEM estéril</td></tr><tr><td>:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar, manter estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Extensor de Soro</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>Referido como "suplemento mitógeno concentrado" no manuscrito. Mantenha a</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina estéril (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Mantenha estéril</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar, manter estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Mantenha a solução estéril</td></tr><tr><td>de tripsina/EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar, manter estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Mantenha estéril</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtros de seringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>Manter frascos de</td></tr><tr><td>cultura de tecidos T75</td> estéreis <td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>Manter estéreis</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>Manter estéril, usar para ensaios</td></tr><tr><td>de migração Anti-mouse Sca-1</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1226P</td><td>uso em 10 &micro; células l/106</td></tr><tr><td>anti-rato CD105 R</td><td>& D Sistemas</td><td>FAB1320P</td><td>uso em 10 &micro; células l/106</td></tr><tr><td>anti-rato CD29 R</td><td>& D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>uso em 10 &micro; células l/106</td></tr><tr><td>anti-rato CD73 R</td><td>& D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>uso em 10 &micro; l/106 células</td></tr><tr><td>Anti-rato CD44 R</td><td>& D Systems</td><td>MAB6127-SP</td><td>uso em 0,25 &micro; g/106 células</td></tr><tr><td>Anti-rato CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>uso em 5 &micro; células l/106</td></tr><tr><td>anti-rato gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>use em 10 &micro; L/106 células</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Manter estéril</td></tr><tr><td>Matrizes de proteínas</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>Use 1 matriz por condição de mídia (incluindo controle negativo), em triplicado</td></tr></tbody></table>

geração de mídia e aplicativos organ-condicionado para o estudo influências específicas do órgão em cancro da mama metastático comportamento

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

O câncer de mama metastatiza preferencialmente para linfonodos, ossos, pulmão, cérebro e fígado em pacientes com câncer de mama. Esforços de pesquisa anteriores se concentraram na identificação de fatores inerentes às células de câncer de mama que são responsáveis por esse padrão metastático observado (denominado tropismo de órgãos), no entanto, muito menos se sabe sobre os fatores presentes em órgãos específicos que contribuem para esse processo. Isso se deve em parte à falta de sistemas de modelos in vitro que recapitulem com precisão o microambiente do órgão. Para resolver isso, foi estabelecido um sistema modelo ex vivo que permite o estudo de fatores solúveis presentes em diferentes microambientes de órgãos. Este modelo consiste na geração de meios condicionados a partir de órgãos (linfonodos, ossos, pulmão e cérebro) isolados de camundongos nus atímicos normais. O sistema modelo foi validado demonstrando que diferentes linhagens celulares de câncer de mama exibem comportamento maligno específico de linhagem celular e específico de órgão em resposta a meios condicionados por órgãos que correspondem ao seu potencial metastático in vivo. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar fatores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e de outros tipos de células cancerígenas, incluindo influências no crescimento, migração, comportamento semelhante ao tronco e expressão gênica, bem como a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos para o câncer. Este é o primeiro sistema modelo ex vivo que pode ser usado para estudar o comportamento metastático específico de órgãos em detalhes e avaliar o papel de fatores solúveis derivados de órgãos específicos na condução do processo de metástase do câncer.

Geração de mídia com ar-Organ Um diagrama / esquemática descrição geral do processo de isolamento de órgãos e geração de meios condicionados é apresentado na Figura 1, com imagens fotográficas representativos do processo mostrado na Figura 2. Deve notar-se que, quando este protocolo foi a primeira fase de desenvolvimento, fígado foi incluído em nossa análise, porque é um local...

Este manuscrito descreve um sistema modelo ex vivo composto de meios condicionados por órgãos derivados do linfonodo, osso, pulmão e cérebro de camundongos. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos no tropismo de órgãos e no comportamento metastático das células cancerígenas.

Geração de mídia e aplicativos Organ-condicionado para o Estudo Influências específicas do órgão em cancro da mama metastático Comportamento

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar meios condicionados utilizando linfonodos, ossos, pulmões e cérebros de camundongos para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos sobre o comportamento metastático de células cancerígenas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de metástase, como, por exemplo, como fatores específicos de órgãos influenciam o crescimento, a migração e a expressão gênica de células cancerígenas? Esta técnica fornece uma plataforma simples ex vivo, representativa dos fatores solúveis específicos de órgãos in vivo que influenciam o fenótipo e o comportamento de células cancerígenas.Para isolar os linfonodos, comece colocando um camundongo com idade entre seis e doze semanas sobre uma placa de espuma de poliestireno em uma câmara de cultura tecidual estéril e fixe as patas em posição estendida. Em seguida, use pinça e tesoura para fazer uma incisão mediana na pele abdominal, da genitália até a boca. Depois, puxe suavemente a pele dos músculos abdominais e fixe-a no suporte de dissecação.Usando tesouras, remova cuidadosamente os linfonodos da pele, gordura e vasos, colocando os linfonodos em 30 mililitros de PBS gelado conforme forem sendo coletados. Quando todos os linfonodos tiverem sido recolhidos, use a pinça e a tesoura para cortar cuidadosamente a parede abdominal exposta em movimento ascendente através do esterno, expondo a cavidade torácica. Corte o diafragma.Levante os pulmões por baixo e corte o tecido subjacente em direção à traqueia. Em seguida, transfira os pulmões para um novo recipiente contendo PBS gelado. O coração pode ser removido dos pulmões nesta etapa ou antes da pesagem do órgão.Para coletar os ossos das patas, posicione o camundongo em decúbito ventral e corte a pele na região inferior das costas de um flanco ao outro. Em seguida, use um pedaço estéril de gaze para segurar o tronco e a pele sobre as patas e os pés. Usando o mesmo pedaço de gaze, segure a pata traseira enquanto quebra cuidadosamente a articulação do tornozelo de uma das patas e puxe a pele sobre a articulação em direção proximal ao joelho.Em seguida, com o auxílio de uma tesoura, remova a tíbia da articulação do joelho e coloque o osso da perna em PBS gelado. Após a coleta da segunda tíbia, segure o fêmur com pinça e use a tesoura para remover o tecido muscular ao redor. Em seguida, coloque o osso da perna em PBS gelado.Para colher o cérebro, use um novo pedaço de gaze estéril para segurar a cabeça e remova suavemente a pele com tesoura e pinça para expor o crânio. Em seguida, use a tesoura para cortar cuidadosamente o osso occipital a partir do centro superior do crânio em uma linha reta e descendente para expor a região posterior do cérebro. Depois, introduzindo a pinça sob o tecido em direção à parte anterior do crânio, transfira todo o cérebro para PBS gelado.Para gerar o meio condicionado de pulmão, inverta os tubos de tecido pulmonar três vezes para remover qualquer resíduo sanguíneo dos órgãos. Em seguida, substitua a lavagem por PBS frio fresco e repita até que a solução salina esteja livre de sangue. A seguir, transfira os pulmões para uma placa de Petri de vidro de 60 milímetros quadrados por camundongo e use duas lâminas de bisturi estéreis para picar os tecidos com cortes repetidos de vai e vem.Quando os fragmentos de tecido tiverem aproximadamente um milímetro cúbico de tamanho, re-suspenda as peças no volume apropriado de meio DMEM:F12 suplementado com antibióticos e incube os tecidos em uma cavidade de uma placa de seis poços por camundongo a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. Após 24 horas, transfira todo o conteúdo de cada poço para tubos cónicos individuais de 50 mililitros e dilua o meio condicionado com três volumes equivalentes de meio DMEM:F12 fresco por tubo. Centrifugue os tubos para remover quaisquer fragmentos grandes de detritos teciduais.Em seguida, reúna os meios condicionados através de uma peneira de seringa de 0,22 mícron em um único tubo cônico de 50 mililitros. Para gerar o meio condicionado de medula óssea, transfira os ossos para uma cabine de cultura tecidual estéril e remova os tecidos residuais do osso. Utilize uma tesoura para remover as epífises.Em seguida, utilize uma agulha de calibre 27 e meio para lavar um mililitro de PBS através da cavidade medular de cada osso em um tubo contendo PBS fresco. Quando todas as células estromais da medula óssea tiverem sido coletadas, lave as células três vezes em PBS. Após a última lavagem, re-suspenda o pellet em 20 mililitros de meio de crescimento para células estromais ósseas suplementado com 10% de soro bovino fetal e semeie 10 mililitros de células por frasco T75.Quando as células atingirem aproximadamente 70% de confluência, lave as culturas duas vezes com três mililitros de PBS. Em seguida, desprenda as células com três mililitros de solução de tripsina/EDTA 0,025%, tomando o cuidado de garantir que a tripsina cubra toda a superfície do frasco. Após dois a três minutos, interrompa a reação enzimática com três mililitros de meio de crescimento de células estromais ósseas e reúna as células em um tubo de 50 mililitros.Centrifugar as células. Em seguida, re-suspender o pellet em 10 mililitros de meio fresco. Agora, repartir os cultivos na proporção de um para cinco em três novos frascos T75 até atingirem confluência de 70%.Em seguida, lave as células três vezes com PBS conforme acabou de ser demonstrado e alimente os cultivos com meio de coleta de células estromais ósseas sem soro, suplementado com mitógeno e antibióticos, por 72 horas. Após o terceiro dia de cultivo, reúna os meios através de uma peneira de 0,22 mícron. As células estromais devem ser aderentes em cultivo, apresentando uma morfologia alongada e fibroblástica observada nos cultivos de células estromais de linfonodo, e uma morfologia menor e mais arredondada exibida pelos cultivos de células estromais da medula óssea.A análise por citometria de fluxo confirma que as células estromais do linfonodo são majoritariamente negativas para CD45 e positivas para gp38. As células estromais da medula óssea devem ser positivas para CD-44 e CD-29, fracamente positivas para CD-105 e Sca-1, e negativas para CD-73. Células de câncer de mama humanas com diferentes origens genéticas exibem padrões diferenciados de migração e crescimento em direção a condições específicas de órgãos.Por exemplo, neste experimento representativo, a variante 231-BoM com afinidade por osso migra preferencialmente para o meio condicionado da medula óssea em vez dos meios condicionados do cérebro e do pulmão. Da mesma forma, a variante 231-LM2 com afinidade por pulmão migra preferencialmente para o meio condicionado do pulmão em vez dos meios condicionados da medula óssea e do cérebro. Além disso, a análise por RT-qPCR demonstra que a exposição de células parentais de câncer de mama MDA-MB-231 ao meio condicionado de osso ou pulmão induz uma superexpressão dos genes associados às metástases específicas de osso ou pulmão dessas células de câncer de mama in vivo.Uma vez dominadas, as etapas de coleta do tecido e de preparo do meio condicionado podem ser concluídas em duas a três horas, se realizadas corretamente. Os passos de subcultivo nos dias subsequentes levam de 15 a 30 minutos por dia. Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar-se de manter tudo estéril.Após a geração do meio condicionado, outros métodos como arranjos de proteínas, ensaios de crescimento e migração celular, formação de tumoresferas e RT-PCR podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o efeito de fatores específicos de órgãos no comportamento das células cancerígenas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa do câncer de mama explorarem o comportamento metastático específico de órgãos em um sistema de modelo ex vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar meios condicionados utilizando os ossos, pulmões e cérebros de camundongos.Não se esqueça de que trabalhar com ferramentas de dissecação afiadas pode ser perigoso, e que precauções, como o uso de técnica de dissecação precisa e cuidadosa, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve um método de geração de um meio condicionado por órgãos derivado do fígado de camundongo. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos no tropismo de órgãos e no comportamento metastático das células cancerígenas.

Meio Condicionado por Órgãos: Meio Gerador de Células de Órgãos Colhidas para Estudos de Câncer Metastático

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Aprenda a gerar meios condicionados de órgãos de camundongos para estudar fatores solúveis que influenciam o comportamento metastático de células de câncer de mama.

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