Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para a produção de tumores metastáticos em camundongos pretos de seis anos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunoterapia, como como os agentes investigativos afetam a resposta imune nos pulmões. A principal vantagem dessa técnica é que ela experimenta metástases.

Portanto, os resultados são confiáveis e relativamente consistentes. Para começar, coloque culturas de células de melanoma B16-BL6, que devem estar em aproximadamente 70% de confluência, em uma capa estéril. Em seguida, adicione um mililitro de 05% de tripsina EDTA a cada prato e deixe as células por um minuto.

Depois de aspirar esta solução, adicione um mililitro de tripsina a cada placa e, em seguida, retorne as células à incubadora. Após 10 minutos, mova as células para um capuz estéril e adicione quatro mililitros de meio RPMI livre de soro a cada placa. Em seguida, colete as células com uma pipeta motorizada estéril.

Para quebrar aglomerados que podem entupir a agulha de ejeção, pressione a ponta da pipeta contra o fundo da placa e expulse as células. Depois de repetir esse processo várias vezes, reúna as células e transfira-as para um tubo cônico de 15 militeres. Em seguida, remova uma amostra da suspensão celular, introduza-a em um hemocitômetro e determine a densidade celular.

Igualmente aloque a suspensão celular em quatro tubos de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue os tubos e depois decanta o sobrenadante. Prossiga para rotular cada um dos tubos com uma densidade celular diferente - 0, 0,063, 0,125, 0,25 ou 0,5 milhão de células por mililitro.

Em seguida, adicione um volume apropriado de RPMI livre sérico a cada cônico para produzir essas concentrações finais. Confirme as densidades celulares desejadas usando um hemocitômetro. Em seguida, aloque 500 microlitros de cada suspensão em tubos rotulados de 1,8 mililitro colocados no gelo.

Depois que todas as suspensões de células B16-BL6 forem preparadas, selecione um mouse. Segurando-o pela cauda, guie a parte traseira do animal primeiro para um sistema de contenção. Quando o torso do rato estiver na câmara principal e sua cauda fora do aparelho, puxe o animal para o final do sistema de contenção.

Em seguida, insira o êmbolo de retenção e continue a empurrar o êmbolo até que o mouse esteja seguro. Assim que o animal estiver no lugar, gire o mouse 90 graus de modo que uma das veias laterais da cauda fique voltada para cima. Em seguida, use uma compressa com álcool para limpar vigorosamente o lado da cauda do rato onde a veia é mais visível.

Para se preparar para a injeção, primeiro colete 300 microlitros da suspensão de 0,5 milhão de células por mililitro em uma seringa. Em seguida, ejete as bolhas da seringa invertendo-a, sacudindo seu lado e empurrando o êmbolo. Depois que as bolhas forem removidas, ejete a cultura de células para obter um volume final de 250 microlitros na seringa.

Prossiga para estender a cauda do rato com a mão não dominante. Segure-o de forma que o dedo indicador eleve a extremidade proximal da cauda e o polegar pressione a porção distal. Com a mão dominante, insira a agulha na veia em direção à extremidade distal da cauda em um ângulo minúsculo para baixo.

Em seguida, insira a agulha ainda mais, ajustando-a para que corresponda ao ângulo da veia da cauda. Depois que a agulha for inserida aproximadamente um centímetro na veia da cauda, comece a empurrar o êmbolo enquanto segura a seringa com firmeza. Pare qualquer sangramento segurando a gaze contra o local de entrada.

Uma vez ejetada a suspensão celular, remova a agulha da veia e descarte-a. Em seguida, remova o êmbolo do limitador e coloque o mouse em uma gaiola receptora. Este protocolo teve como objetivo identificar o número ideal de células B16-BL6 a serem injetadas para criar um modelo útil de melanoma metastático.

Aqui são mostrados focos experimentais indicados por setas formadas nos pulmões duas a três semanas após a injeção de cinco densidades celulares diferentes. Quando 500.000 células por mililitro foram injetadas, os focos cobriram completamente os pulmões. No exemplo mostrado aqui, 102 focos foram contados.

Em contraste, os pulmões estavam apenas escassamente cobertos de focos quando 62.500 células por mililitro ou 125.000 células por mililitro foram injetadas. Respectivamente, essas densidades resultaram em contagens de focos pulmonares de um e 17. Usando este método, foi determinado que a concentração ideal de células a serem injetadas era de 250.000 células por mililitro.

Essa densidade resultou em pulmões com cerca de 65 focos, um número em que os órgãos não estavam completamente cobertos nem muito escassamente cobertos por focos. A enumeração adicional desses dados, quando representados graficamente, demonstra uma relação aproximadamente linear entre os focos pulmonares e a densidade da cultura de células acima de 125.000 células por mililitro, conforme mostrado aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em menos de uma hora, dependendo do número de camundongos, se executada corretamente.

Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de tentar injetar um número equivalente de células por camundongo. Após esse procedimento, outros métodos podem ser realizados, como a administração de medicamentos, para responder a perguntas como como as terapias potenciais afetam vários focos resultantes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do câncer explorarem os constituintes do câncer metastático no melanoma em camundongos pretos seis.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como coletar e preparar células B16-BL6, conter camundongos, preparar agulhas e injetar um número equivalente de células em cada veia da cauda. Não se esqueça de que trabalhar com cultura e agulhas de mamíferos pode ser extremamente perigoso, e precauções como evitar picadas de agulha e usar equipamentos de proteção devem sempre ser tomadas.