Name: Um passo de purificação cromatográfica de Negativo Helicobacter pylori Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em Escherichia coli Em Modo Batch (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a purificar a proteína HP-NAP de Helicobacter pylori com alta pureza usando cromatografia negativa em modo batch com resina DEAE. Este método eficiente de uma etapa facilita pesquisas em vacinas e diagnósticos.

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Agradecemos ao Dr. Chao-Sheng Cheng da National Tsing Hua University, Taiwan, por realizar a medição do dicroísmo circular. Também agradecemos aos Drs. Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov da Mayo Clinic, EUA, por fornecerem o anticorpo monoclonal anti-HP-NAP. Agradecemos aos Drs. Han-Wen Chang e Chung-Chu Chen do Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, por fornecer conselhos para a aplicação do IRB, ao Sr. Te-Lung Tsai do Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, por supervisionar a análise de neutrófilos isolados, e à Sra. Ju-Chen Weng da National Tsing Hua University, Taiwan, por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 e NSC98-2311-B-007-006-MY3), o Programa Conjunto de Pesquisa da Universidade Nacional de Tsing Hua e do Hospital Memorial Mackay (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) e o programa de pesquisa da Universidade Nacional de Tsing Hua (104N2052E1).

O sangue humano foi coletado de voluntários saudáveis ​​com o consentimento informado por escrito antes e aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional Tsing Hua, Hsinchu, Taiwan. 1. Expressão Recombinante de HP-PNA em E. coli <ol><li> Prepara-se o plasmídeo pET42a-PNA contendo a sequência de ADN de HP-NAP de H. pylori 26695 estirpe como descrito anteriormente 16. Prepare os plasmídeos contendo a sequência de ADN de HP-NAP com as mutações pontuais desejadas como descrito (ver protocolo, passo 8). </li><li> Transformar 10 ng dos plasmídeos de DNA acima referidas em E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, as células raia no caldo de lisogenia (LB) agar contendo 50 ug / ml de canamicina, e incubar as placas a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Inocular colónias individuais em tubos individuais contendo 5 ml de caldo de LB com 50 ug / ml de canamicina e crescem-los como pré-culturas em três7 ° C durante 16 horas com agitação a 170 rpm. </li><li> Inocular 2 ml de células de pré-cultura acima em 200 ml de caldo LB contendo 50 ug / ml de canamicina num balão de 1 L. Incubar o balão de cultura inoculado a 37 ° C durante 2 horas com agitação a 170 rpm até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 0,4-0,5 detectado por um UV / VIS. </li><li> Adicionar 80 ul de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura acima, para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão de HP-NAP. Incubar a cultura durante 3 h até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 1,6-1,7. </li><li> Centrifugar as células a 6000 xg, a 4 ° C durante 15 minutos para remover o sobrenadante. Armazenar o sedimento de células à temperatura de -70 ° C até à purificação. </li></ol> 2. Preparação da fracção de proteína solúvel contendo HP-NAP Nota: Todos os passos seguintes são realizados a 4 ° C. <ol><li> Ressuspender 50 ml da célula pEllet preparado no protocolo passo 1.6 em 20 mL de Tris-HCl a 20, pH 9,0, NaCl 50 mM contendo 0,13 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM de N-alf a-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), e 0,03 mM de N-tosil-L-f enilalaninil-clorometilcetona (TPCK), a 4 ° C como previamente descrito 16. </li><li> À dissociação das células das bactérias fazendo passar a suspensão bacteriana por meio de um homogeneizador de alta pressão operado a uma gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 vezes a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado celular a 30000 x g a 4 ° C durante 1 h para separar as fracções proteicas solúveis e insolúveis usando uma ultracentrífuga. Transferir o sobrenadante como a fracção de proteína solúvel para uma proveta. </li><li> Medir a concentração de proteína da fracção da proteína solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial, com albumina de soro de bovino (ASB) como o padrão de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicionar 177,6 mL de HCl 1 N em 20 ml de the fracção de proteína solúvel obtida a partir de 2,3 protocolo passo para ajustar o valor de pH a partir de pH 9,0 para pH 8,0. </li><li> Adicionar Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à solução de proteína acima para fazer a concentração de proteína final seja 0,5 mg / ml. </li></ol> 3. A purificação do recombinante HP-NAP a partir de E. coli por Cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas de permuta iónica <ol><li> Preparar 15 ml de resinas DEAE. <ol><li> Pesar 0,6 g de pó seco de resinas DEAE e suspendê-lo em 30 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 dia. </li><li> Centrifugar a resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min. </li><li> Retirar e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 15 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM. </li><li> Repita os passos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 quatro vezes mais. </li><li> Armazenar as 15 ml de resina assente (pasta a 50% em 30 ml de tampão de Tris) a 4 ° C para utilização subsequente. Nota: Todo o passo seguintes são realizados a 4 ° C. </li></ol></li><li> Adicionar 45 ml de as proteínas solúveis preparadas de protocolo passo 2,6-15 ml da resina e agita-se a pasta de proteína / resina com um agitador magnético a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Verter a pasta de proteína / resina para uma coluna de plástico ou de vidro equipado com uma torneira de passagem. Permitir que a resina se contentar por gravidade. </li><li> Abrir a torneira para permitir que a solução de proteína para correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção não ligada, que contém o HP-NAP purificada. </li><li> Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 50 mM para a coluna. </li><li> Abrir a torneira para permitir que o tampão de lavagem para ser executado através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de lavagem. </li><li> Repita Protocolo passos 3.5 a 3.6 mais quatro vezes para recolher as fracções de lavagem adicionais. </li><li> Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 1 M em uma coluna. </li><li> Abrir a torneira para permitir que o tampão de eluição de correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de eluição. </li><li> Repita os passos Protocolo de 3.8 a 3.9 mais quatro vezes para recolher as fracções de eluição adicionais. </li></ol> 4. Tampão do Exchange e endotoxina remoção do HP-NAP purificado por cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas Nota: O purificada HP-NAP expressa em E. coli tem de ser sujeita a troca de tampão e a remoção de endotoxina antes de estimular os neutrófilos. <ol><li> Executar a diálise para mudar o tampão do HP-NAP purificada a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizando tubo de diálise com corte de peso molecular de 14 kDa, tal como previamente descrito 24. </li><li> Filtrar a HP-NAP dialisada através de uma syringe filtro com uma membrana carregada positivamente, hidrófila ligada a uma seringa descartável de 20 ml com caudais que vão de 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C para remover a endotoxina. </li></ol> 5. Caracterização das propriedades moleculares do Purificada Recombinante HP-NAP por Sodium Dodecyl de poliacrilamida eletroforese em gel (SDS-PAGE), Western Blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatography, e Dicroísmo Circular Spectroscopy <ol><li> Analisar o HP-NAP recombinante purificada por SDS-PAGE e Western blotting com sobrenadantes de cultura de hibridoma contendo anticorpo monoclonal de rato MAb 16F4 25 como previamente descrito 24. </li><li> Analisar o HP-NAP purificada por PAGE nativa e cromatografia de filtração em gel para examinar o seu estado oligomérico como descrito anteriormente 26. </li><li> Analisar o recombinante HP-NAP purificada por espectroscopia de dicroísmo circular para examinar a sua estrutura secundária, como anteriormente descrito 26. </li></ol> 6. Avaliação da Pureza de HP-NAP por coloração com prata de um gel de SDS-PAGE <ol><li> Preparar a solução de fixação, solução, solução de prata, a solução de desenvolvimento de sensibilização, solução de paragem, e a solução de lavagem de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata. </li><li> Realização da coloração de prata de um gel de SDS-PAGE de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata. </li><li> Obter a imagem do gel com um sistema de imagem. </li></ol> 7. Medição de ROS produção a partir de neutrófilos induzida por HP-NAP <ol><li> Isolar os neutrófilos humanos a partir de sangue humano heparinizado por sedimentação de dextrano seguido por centrifugação em gradiente de densidade, como previamente descrito 24. </li><li> Medição da produção de ROS por neutrófilos estimulados com HP-NAP usando um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol. <ol><li> Ligar um leitor de placas e ajustar a temperatura a 37 ° C. coloque umplaca vazia de fundo plano de 96 poços branca dentro da câmara de leitor de placas, permitindo-a aquecer até 37 ° C. </li><li> Preparar as misturas de estímulo em D-PBS, pH 7,2, contendo 0,9 mM de CaCl 2, MgCl 2 0,5, e 13,3 uM de 5-amino-2,3-di-hidro-1,4-phthalazinedione (luminol), com a presença e ausência de 0,67 mM removido-endotoxina HP-NAP preparada a partir de protocolo passo 4.2. </li><li> Ajustar a concentração de neutrófilos humanos preparados a partir de protocolo passo 7.1 a 2 x 10 6 células / ml em D-PBS, pH 7,2, contendo 5 mM de glucose. </li><li> Adicionar 50 ul de suspensão de neutrófilos em cada cavidade de 96 poços enquanto o prato. </li><li> Adicionar 150 ul das misturas preparadas a partir de estímulo Protocolo passo 7.2.2 em neutrófilos bem contendo em um intervalo de tempo de 5 segundos por poço. </li><li> Medir a emissão da quimioluminescência durante 5 segundos por poço durante um período de três horas, utilizando um leitor de placas. </li></ol></li></ol> 8.Construção de DNA plasmídeos contendo HP-NAP Mutantes por Polymerase Chain Reaction (PCR) à base de mutagênese Site-direta Nota: mutagénese sítio-directa baseada em PCR foi gerado, basicamente, como descrito anteriormente 27, excepto que os locais de restrição &quot;silenciosas&quot; foram introduzidas para os iniciadores de mutagénese por mutagénese dirigida (SDM) de software -assist 28. <ol><li> Realizar a reacção de PCR. <ol><li> Adiciona-se 10 ng de plasmídeo pET42a-PNA, 1 | iM de pares iniciadores de mutagénese listados na Tabela 1, 200 uM de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), e 3 unidades de alta fidelidade-PCR mistura de enzima para um tubo de PCR contendo água desionizada, dando uma última volume de 25 ul. </li><li> Iniciar os ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturar o ADN modelo, e seguir com 12 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 1 minuto, a T m nenhum -5 ° C durante 1 minuto, e 72 ° C durante 6 min. </li><li> Terminar os ciclos de PCR comum passo de recozimento a T m pp -5 ° C durante 1 minuto e um passo de extensão a 72 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Tratar 15 ul do produto de PCR com 0,4 ul de enzima de restrição Dpnl a 37 ° C durante 2 h e, em seguida, analisar 2 uL do produto de PCR Dpnl-tratada por electroforese em gel de agarose. </li><li> mutantes tela. <ol><li> Transformar 2 uL do produto de PCR em E. coli DH5a células competentes por choque térmico para 45 seg a 42 ° C. </li><li> Espalhe as células transformadas em uma placa de LB contendo 50 ug / ml de canamicina e Incubar a placa a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Isolar o ADN plasmídico a partir das colónias bacterianas utilizando um kit comercial de lise alcalina de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Tratar o DNA de plasmídeo isolado no passo 8.3.3 Protocolo com a enzima de restrição Xhol para verificar a presença das mutações silenciosas desejado de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> sequência doDNA do plasmídeo verificada por passo 8.3.4 Protocolo com o iniciador do promotor de T7 para confirmar a correcção das sequências de codificação mutantes de HP-NAP de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li></ol>

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<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
</ol>

HWF e YCY são inventores das patentes TW I 432579 e US 8.673.312 para o método de purificação em uma etapa da proteína ativadora de neutrófilos Helicobacter pylori . Todos os materiais descritos no manuscrito estarão disponíveis para fins de pesquisa. Os autores confirmam que isso não altera sua adesão a todas as políticas do JoVE sobre compartilhamento de dados e materiais.

A cromatografia em lote modo negativo com resinas de permuta aniónica DEAE aqui apresentado é adequado para a purificação do recombinante HP-NAP sobre-expressos em E. coli. Os valores dos tampões utilizados nos passos de lise de células e purificação de pH são muito crítica para assegurar a solubilidade de HP-PNA em E. Os lisados ​​de E. coli e a separação eficiente de recombinante HP-NAP a partir de impurezas da célula hospedeira, respectivamente. As células bacterianas lisadas deve ser a pH ...

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das principais causas de gastrite e úlcera péptica. Esta bactéria também foi classificado como cancerígeno em humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, parte da Organização Mundial da Saúde, em 1994. Estima-se que a prevalência de H. pylori é de 70% nos países em desenvolvimento e 30-40% nos países industrializados 1. Mesmo que a taxa de infecção de H. pylori está diminuindo nos países industrializados, a taxa de infecção de H. pylori em países em desenvolvimento ainda é alto 2. O tratamento padrão para erradicar H. pylori consiste na administração de um inibidor da bomba de protões, IPP, e dois antibióticos, amoxicilina ou claritromicina mais metronidazole 3. No entanto, o aumento da resistência aos antibióticos em H. pylori relacionados com a terapia de úlcera insta o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir oR curar a infecção. O desenvolvimento de vacina preventiva e / ou terapêutica contra o H. pylori pode proporcionar uma abordagem alternativa para controlar H. pylori. Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP), um importante fator de virulência do H. pylori, foi identificado pela primeira vez em extratos aquosos de H. pylori com a capacidade de activar os neutrófilos a aderir às células endoteliais e produzem espécies reactivas de oxigénio (ROS) 4. A infiltração de neutrófilos na mucosa gástrica encontrada em H. pylori pacientes infectados com gastrite ativa pode resultar em inflamação e danos nos tecidos do estômago. Assim, HP-PNA pode desempenhar um papel patológico através da activação de neutrófilos para induzir a inflamação gástrica, o que provoca ainda mais úlcera ou H. pylori -associated doenças gástricas. No entanto, HP-NAP é um candidato potencial para aplicações clínicas 5,6. Devido à pró imunogénica e imunomoduladorpriedades de HP-PNA, esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de vacinas, agentes terapêuticos, e ferramentas de diagnóstico. Um ensaio clínico foi conduzido para a utilização recombinante HP-NAP como um dos componentes de uma vacina contra a proteína H. pylori. Esta vacina consiste de recombinante HP-PNA, associado citotoxina-gene A (CagA), e proteínas citotoxina vacuolar A (VacA) formulado com hidróxido de alumínio e ainda tem sido demonstrado ser segura e imunogénica em humanos 7. Além disso, a HP-NAP actua como um potente imunomodulador para desencadear T auxiliar tipo 1 (Th1) -polarized respostas imunitárias para a terapia do cancro e 8 para regular negativamente as respostas imunitárias mediadas por Th2 provocadas por reacções alérgicas e infecções parasitárias 9,10. Como para o diagnóstico, com base ELISA-HP-NAP recombinante tem sido utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA em H. pylori pacientes infectados 11. Um estudo mostrou que o nível de anticorpos específicos de HP-NAP em soros de H. pyLori pacientes infectados com carcinoma gástrico foi significativamente mais elevada do que a partir de pacientes com gastrite crónica 12. Outro estudo também mostrou que os anticorpos séricos contra HP-PNA estão associados com a presença de não-cárdia adenocarcinoma gástrico 13. Assim, ELISA baseado em HP-NAP recombinante pode ser utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA para o prognóstico do cancro gástrico em H. pylori pacientes infectados. Tomados em conjunto, o HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro. Entre os vários métodos utilizados para a purificação do HP-NAP recombinante expressa em Escherichia coli (E. coli) na sua forma nativa relatados até agora, uma cromatograf ia de filtração em gel segundo passo de purificação envolvendo é necessária para se obter elevada pureza HP-NAP 14-16 . Aqui, um método utilizando a cromatografia modo descontínuo com negativodietilaminoetilo (DEAE) resinas de permuta iónica é descrito para a purificação do HP-PNA sobre-expresso em E. coli com elevado rendimento e elevada pureza. Esta técnica de purificação foi baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP são recuperados a partir da fracção livre. Esta abordagem purificação utilizando cromatografia de troca iônica DEAE no modo negativo é simples e economia de tempo, permitindo a purificação do recombinante HP-NAP através de cromatografia de uma etapa, através da recolha da fracção livre. Além de HP-PNA, várias outras biomoléculas, tais como vírus 17, Imunoglobulina G (IgG) 18, hemoglobina 19, fosfatase de proteína 20, e factor de virulência flagelina 21, também tem sido relatado para ser purificado por cromatografia de permuta iónica em negativo modo. O modo negativo é o preferido para a cromatografia de permuta iónica se as impurezas são o menorcomponentes presentes na amostra submetida a ser purificada 22. A aplicação de cromatografia negativa em purificação de biomoléculas naturais ou recombinantes foi recentemente revista 23. O presente relatório fornece um passo a passo de protocolo para a expressão de recombinante HP-NAP em E. coli, a lise das células, e a purificação do HP-PNA utilizando cromatografia lote modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE. Se uma proteína desejada para a purificação é adequada para cromatografia de permuta iónica em modo negativo, o protocolo descrito também pode ser adaptado como um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>preparado conforme descrito em Dados suplementares do Referente 15&nbsp; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20</td></tr><tr><td>fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Inibidor de protease</td><td>10837091001</td> <td>Sigma-Aldrich</td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</tr><tr><td>N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK)</td><td>Inibidor de protease Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalaninil-clorometilcetona (TPCK)</td><td>Inibidor de protease Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Padrão de proteína (albumina de soro bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp;</td><td>uma proteína padrão para Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>MORTE&ndash; Sephadex &nbsp; Forma de cloreto A-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>tubo de diálise Spectrum/Por</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>com corte de peso molecular de 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Unidades Acrodisc&reg; com Mustang&reg; Membrana E</td><td></td><td>Pall MSTG25E3</td><td>para remoção de endotoxinas; operado a caudais que variam entre 1 e 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal de ratinho MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>levantado contra o HP-NAP purificado da estirpe NCTC 11637 de H. pylori, conforme descrito no Referente 23; &nbsp; Um presente dos Drs. Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov na Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td> 28989335 <td>para cromatografia de filtração em gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de prata PlusOne, proteína</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>para centrifugação com gradiente de densidade para purificação de neutrófilos humanos http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>Placa branca de fundo plano de 96 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protegido da luz http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Expandir &nbsp; sistema de PCR de modelo longo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>fonte de mistura enzimática de PCR de alta fidelidade http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do Produto</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV/VIS de feixe duplo U-2800</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>N/A</td><td>fora do mercado e atualizado para um novo modelo http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>homogeneizador de alta pressão EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX ultracentrífuga geral</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>para a separação das fracções proteicas solúveis e insolúveis dos lisados de E. coli http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>para cromatografia de filtração em gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv modelo 62ADS Espectrofotômetro de CD</td><td>Aviv Biomedical N</td><td>/A</td><td>fora do mercado e atualizado para um novo modelo http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>sistema de imagem LAS-3000</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>descontinuado e substituído http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>contador multilabel Wallac 1420 (Victor2)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>para detecção de quimioluminescência http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

um passo de purificação cromatográfica de negativo<em&gt; helicobacter pylori</em&gt; neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; escherichia coli</em&gt; em modo batch

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP) é um importante fator de virulência de Helicobacter pylori (H. pylori). Ela desempenha um papel crítico em H. pylori induzida por inflamação gástrica, activando vários leucócitos inatas, incluindo neutrófilos, monócitos, mastócitos e células. As propriedades imunogênicas e imunomoduladores da HP-NAP torná-lo um candidato potencial de diagnóstico e vacinas para H. pylori e uma nova droga candidatos para a terapia do cancro. A fim de obter quantidades substanciais de HP-NAP purificada utilizada para as suas aplicações clínicas, um método eficiente para purificar esta proteína com elevado rendimento e grau de pureza deve ser estabelecida. Neste protocolo, nós descrevemos um processo para um passo de purificação cromatográfica negativa recombinante de HP-PNA sobre-expresso em Escherichia coli (E. coli) usando dietilaminoetilo resinas de permuta iónica (DEAE) (por ex., Sephadex) iModo lote n. Recombinante HP-NAP constitui quase 70% do total de proteínas em E. coli e é quase totalmente recuperada na fracção solúvel após a lise celular, a pH 9,0. Sob a condição óptima a pH 8,0, a maioria dos HP-NAP é recuperada na fracção não ligada enquanto as proteínas endógenas da E. coli são eficientemente removida pela resina. Este método de purificação utilizando cromatograf ia em lotes modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE produz funcional HP-NAP a partir de E. coli, na sua forma nativa com elevado rendimento e pureza. A HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

O diagrama esquemático do processo experimental de purificação negativa recombinante de HP-NAP expressa em E. coli, usando resinas de permuta iónica em DEAE em modo de lote é mostrado na Figura 1. Esta técnica de purificação é baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP na sua forma nativa são recuperados a partir da fracção não ligada (Fi...

Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças.

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

O objetivo geral dessa purificação é obter a proteína ativadora de neutrófilos de Helicobacter pylori, ou HP-NAP, em sua forma nativa, com alta pureza e alto rendimento, utilizando cromatografia em batelada no modo negativo com resina de troca iônica di-etil amino-etil. A principal vantagem dessa técnica é que a HP-NAP pode ser purificada em sua forma nativa em um único passo, com alta pureza e alto rendimento. A purificação negativa da HP-NAP começa com um procedimento de ligação em batelada, no qual a fração proteica solúvel de lisados bacterianos é adicionada à resina DEAE.A mistura é incubada para permitir que as proteínas se liguem à resina. A HP-NAP presente na fração não ligada é então obtida por centrifugação ou fluxo gravitacional. As implicações desta técnica são a prevenção, o tratamento e o prognóstico de doenças associadas ao Helicobacter pylori, bem como a terapia contra o câncer, na proporção de 10:1.Devido às propriedades imunogênicas e imunomoduladoras da HP-NAP. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades. Porque a HP-NAP se agrega facilmente durante a esterilização.Demonstrará o procedimento Zhi-Wei Hong, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Trabalhando a quatro graus Celsius, suspendemos 50 mililitros da pasta celular preparada conforme descrito no protocolo textual em 20 mililitros de tampão tris com baixo teor de sal, pH 9,0, contendo uma mistura de inibidores de protease. É fundamental manter a amostra a quatro graus Celsius para permitir que o procedimento evite a agregação proteica.Desintegre as células bacterianas passando a suspensão bacteriana por um homogeneizador de alta pressão operado na faixa de 15.000 a 20.000 PSI por sete vezes a quatro graus Celsius. Após a lise bacteriana, a amostra deve ser centrifugada imediatamente. Transfira as amostras homogeneizadas para um tubo de centrífuga.Centrifugue imediatamente o lisado celular a 30.000 × g a quatro graus Celsius por uma hora para separar as frações proteicas solúvel e insolúvel utilizando uma ultracentrífuga. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante como fração proteica solúvel para um béquer. Meça a concentração proteica da fração solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial com albumina sérica bovina como padrão, de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, adicione 177,6 microlitros de HCl 1 N a 20 mililitros da fração proteica solúvel para ajustar seu valor de pH de pH 9,0 para pH 8,0. Adicione Tris-HCl 20 milimolar, pH 8,0, e 50 mililitros de cloreto de sódio à solução proteica para obter uma concentração final de proteína de 0,5 miligrama por mililitro. Para preparar 15 mililitros de resina DEAE, suspenda 0,6 gramas de pó seco de resina DEAE em 30 mililitros de tampão Tris-HCl à temperatura ambiente por pelo menos um dia.Centrifugue a resina a 10.000 × g a quatro graus Celsius por um minuto e, em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Adicione então 15 mililitros de tampão Tris-HCl. Após repetir os passos de centrifugação e ressuspendimento mais quatro vezes, armazene os 15 mililitros de resina sedimentada a quatro graus Celsius para uso posterior.Trabalhando a quatro graus Celsius, adicione 45 mililitros das proteínas solúveis preparadas aos mililitros da resina e transfira para um béquer de 100 mililitros com barra de agitação. Agite a suspensão de proteína-resina usando uma placa de agitação a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, despeje a suspensão de proteína-resina em uma coluna de plástico ou vidro equipada com torneira e deixe a resina sedimentar por gravidade.Abra a torneira para permitir que a solução proteica escoe pela coluna por fluxo gravitacional até que o nível do líquido na coluna esteja logo acima da resina. Colete o fluxo que passa como a fração não ligada, a qual contém a proteína ativadora de neutrófilos purificada. Adicione 15 mililitros do tampão Tris-HCl gelado à coluna.Abra novamente a torneira para permitir que o tampão de lavagem atravesse a coluna por fluxo gravitacional até que o nível do líquido na coluna esteja logo acima da resina. Colete o fluxo que passa como a fração de lavagem. Repita a lavagem com tampão frio em gelo mais quatro vezes para coletar as frações de lavagem adicionais.Em seguida, adicione 15 mililitros de Tris-HCl 20 milimolares, pH 8,0, com cloreto de sódio a 1 mol, gelado, à coluna. Colete o fluxo de saída como as frações de eluição, como anteriormente. Repita os passos de eluição mais quatro vezes para coletar as frações de eluição adicionais.O efeito do pH sobre a solubilidade da HP-NAP no lisado de E. coli é mostrado aqui. A quantidade de HP-NAP detectada nesta fração solúvel aumentou acentuadamente entre pH 7,5 e 9,5. A HP-NAP recombinante foi quase totalmente recuperada na fração solúvel após a lise celular em pH 9,0.Aqui, é mostrado o efeito do pH na purificação negativa da HP-NAP recombinante expressa em E.coli por resinas DEAE em modo lote. Em pH 8,0, apenas uma pequena quantidade de HP-NAP estava presente na fração de eluição. A quantidade de HP-NAP presente nas frações não ligadas foi a mais alta em pH 8,0.A quantidade otimizada de proteínas carregada na resina DEAE é de 1,5 miligrama de proteína por mililitro de resina, para atingir a capacidade máxima da resina de absorver as impurezas provenientes de E.coli. Em pH 8,0, pouquíssimas proteínas além da HP-NAP em sua forma nativa são recuperadas na fração não ligada utilizando resinas DEAE em modo descontínuo. A pureza da HP-NAP foi superior a 95 por cento.O HP-NAP purificado se dobra em um multímero com uma estrutura secundária de alfa-hélice, conforme revelado pelo cromatograma de gelifiltração e pelo espectro de dicroísmo circular na região do ultravioleta distante. Um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol revela que o HP-NAP purificado é capaz de desencadear a produção de espécies reativas de oxigênio pelos neutrófilos. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser realizadas em até cinco horas, se executadas corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar HP-NAP funcional na sua forma nativa com alto rendimento e pureza, utilizando cromatografia em modo negativo com resina DEAE e troca iônica. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar de usar tampões no pH apropriado na etapa de esterilização na cromatografia em batelada. Tivemos a ideia inicial para este método quando tentamos aplicar outras abordagens cromatográficas em vez da filtração para purificar HP-NAP na sua forma nativa.Embora este método seja projetado para se ligar à HP-NAP recombinante expressa em E. coli. Ele também pode ser aplicado a outros sistemas de expressão bacteriana, como per-sida sep-tidas. A demonstração visual desta medida é um código rápido.Além disso, os passos de esterilização e cromatografia em lote são difíceis de aprender, pois essas etapas devem ser realizadas a quatro graus Celsius sem qualquer atraso. Se uma proteína projetada para purificação for adequada para nossa cromatografia de troca em modo negativo, este procedimento também poderá ser adaptado como ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa clínica explorarem a possibilidade de utilizar a HP-NAP na terapia contra o câncer, bem como no desenvolvimento de vacinas, medicamentos e diagnósticos para doenças associadas ao Helicobacter pylori.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Fonte: Kuo, T., et al. Purificação cromatográfica negativa em uma etapa da proteína ativadora de neutrófilos Helicobacter pylori superexpressa em Escherichia coli em modo de batelada. J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra uma técnica de cromatografia negativa para purificar uma proteína associada à virulência de um lisado bacteriano. Ao usar uma resina carregada positivamente em uma solução tamponada, as proteínas da célula hospedeira são retidas seletivamente, enquanto a proteína-alvo quase...

Purificação seletiva de uma proteína bacteriana por cromatografia de troca iônica negativa

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução...

 Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Este vídeo mostra a purificação de nanopartículas de proteínas automontadas marcadas com histidina ou SAPNs usando cromatografia líquida de afinidade. As frações SAPN purificadas resultantes são adequadas para o desenvolvimento de vacinas, prometendo potenciais aplicações imunoterapêuticas.

Purificação de nanopartículas de proteínas automontáveis usando cromatografia de afinidade

Polipeptídeos Elastina-like são biopolímeros de estímulo-responsivo com aplicações que vão desde a purificação da proteína recombinante para a entrega da droga. Este protocolo descreve a purificação e caracterização de polipeptídeos elastina semelhantes e suas fusões de péptido ou proteína a partir de Escherichia coli utilizando o seu comportamento crítico de transição de fase inferior temperatura da solução como uma alternativa simples, a cromatografia.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

Um adaptador de placa de várias colunas permite que as colunas de cromatografia sejam interfaceadas com placas de coleta multi-poços para afinidade paralela ou purificação de troca de íons, proporcionando um método econômico de purificação de proteínas de alto rendimento. Pode ser usado sob gravidade ou vácuo produzindo quantidades de miligramas de proteína através de instrumentação acessível.

Um sistema econômico e versátil de purificação de proteínas de alto rendimento usando um adaptador de placa de várias colunas

Neste estudo, uma técnica de detecção em sanduíche baseada em anticorpos duplos foi desenvolvida para detecção rápida de antígenos fecais infectados com Helicobacter pylori.

Detecção rápida de antígeno fecal da infecção por Helicobacter pylori com base na tecnologia de detecção de sanduíche de anticorpo duplo

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Este protocolo descreve um método rápido e reprodutível de extração e precipitação à base de solvente orgânico para purificar polipeptídeos semelhantes a elastina (ELP) de Escherichia coli, oferecendo uma alternativa potencialmente escalável aos métodos convencionais de purificação de ELP.

Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

Aprenda a purificar a proteína HP-NAP de Helicobacter pylori com alta pureza usando cromatografia negativa em modo batch com resina DEAE. Este método eficiente de uma etapa facilita pesquisas em vacinas e diagnósticos.

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo Helicobacter pylori Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em Escherichia coli Em Modo Batch (Vídeo) | JoVE Journal

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo

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