Um passo de purificação cromatográfica de Negativo

O objetivo geral dessa purificação é obter a proteína ativadora de neutrófilos de Helicobacter pylori, ou HP-NAP, em sua forma nativa, com alta pureza e alto rendimento, utilizando cromatografia em batelada no modo negativo com resina de troca iônica di-etil amino-etil. A principal vantagem dessa técnica é que a HP-NAP pode ser purificada em sua forma nativa em um único passo, com alta pureza e alto rendimento. A purificação negativa da HP-NAP começa com um procedimento de ligação em batelada, no qual a fração proteica solúvel de lisados bacterianos é adicionada à resina DEAE.

A mistura é incubada para permitir que as proteínas se liguem à resina. A HP-NAP presente na fração não ligada é então obtida por centrifugação ou fluxo gravitacional. As implicações desta técnica são a prevenção, o tratamento e o prognóstico de doenças associadas ao Helicobacter pylori, bem como a terapia contra o câncer, na proporção de 10:1.

Devido às propriedades imunogênicas e imunomoduladoras da HP-NAP. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades. Porque a HP-NAP se agrega facilmente durante a esterilização.

Demonstrará o procedimento Zhi-Wei Hong, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Trabalhando a quatro graus Celsius, suspendemos 50 mililitros da pasta celular preparada conforme descrito no protocolo textual em 20 mililitros de tampão tris com baixo teor de sal, pH 9,0, contendo uma mistura de inibidores de protease. É fundamental manter a amostra a quatro graus Celsius para permitir que o procedimento evite a agregação proteica.

Desintegre as células bacterianas passando a suspensão bacteriana por um homogeneizador de alta pressão operado na faixa de 15.000 a 20.000 PSI por sete vezes a quatro graus Celsius. Após a lise bacteriana, a amostra deve ser centrifugada imediatamente. Transfira as amostras homogeneizadas para um tubo de centrífuga.

Centrifugue imediatamente o lisado celular a 30.000 × g a quatro graus Celsius por uma hora para separar as frações proteicas solúvel e insolúvel utilizando uma ultracentrífuga. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante como fração proteica solúvel para um béquer. Meça a concentração proteica da fração solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial com albumina sérica bovina como padrão, de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, adicione 177,6 microlitros de HCl 1 N a 20 mililitros da fração proteica solúvel para ajustar seu valor de pH de pH 9,0 para pH 8,0. Adicione Tris-HCl 20 milimolar, pH 8,0, e 50 mililitros de cloreto de sódio à solução proteica para obter uma concentração final de proteína de 0,5 miligrama por mililitro. Para preparar 15 mililitros de resina DEAE, suspenda 0,6 gramas de pó seco de resina DEAE em 30 mililitros de tampão Tris-HCl à temperatura ambiente por pelo menos um dia.

Centrifugue a resina a 10.000 × g a quatro graus Celsius por um minuto e, em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Adicione então 15 mililitros de tampão Tris-HCl. Após repetir os passos de centrifugação e ressuspendimento mais quatro vezes, armazene os 15 mililitros de resina sedimentada a quatro graus Celsius para uso posterior.

Trabalhando a quatro graus Celsius, adicione 45 mililitros das proteínas solúveis preparadas aos mililitros da resina e transfira para um béquer de 100 mililitros com barra de agitação. Agite a suspensão de proteína-resina usando uma placa de agitação a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, despeje a suspensão de proteína-resina em uma coluna de plástico ou vidro equipada com torneira e deixe a resina sedimentar por gravidade.

Abra a torneira para permitir que a solução proteica escoe pela coluna por fluxo gravitacional até que o nível do líquido na coluna esteja logo acima da resina. Colete o fluxo que passa como a fração não ligada, a qual contém a proteína ativadora de neutrófilos purificada. Adicione 15 mililitros do tampão Tris-HCl gelado à coluna.

Abra novamente a torneira para permitir que o tampão de lavagem atravesse a coluna por fluxo gravitacional até que o nível do líquido na coluna esteja logo acima da resina. Colete o fluxo que passa como a fração de lavagem. Repita a lavagem com tampão frio em gelo mais quatro vezes para coletar as frações de lavagem adicionais.

Em seguida, adicione 15 mililitros de Tris-HCl 20 milimolares, pH 8,0, com cloreto de sódio a 1 mol, gelado, à coluna. Colete o fluxo de saída como as frações de eluição, como anteriormente. Repita os passos de eluição mais quatro vezes para coletar as frações de eluição adicionais.

O efeito do pH sobre a solubilidade da HP-NAP no lisado de E. coli é mostrado aqui. A quantidade de HP-NAP detectada nesta fração solúvel aumentou acentuadamente entre pH 7,5 e 9,5. A HP-NAP recombinante foi quase totalmente recuperada na fração solúvel após a lise celular em pH 9,0.

Aqui, é mostrado o efeito do pH na purificação negativa da HP-NAP recombinante expressa em E.coli por resinas DEAE em modo lote. Em pH 8,0, apenas uma pequena quantidade de HP-NAP estava presente na fração de eluição. A quantidade de HP-NAP presente nas frações não ligadas foi a mais alta em pH 8,0.

A quantidade otimizada de proteínas carregada na resina DEAE é de 1,5 miligrama de proteína por mililitro de resina, para atingir a capacidade máxima da resina de absorver as impurezas provenientes de E.coli. Em pH 8,0, pouquíssimas proteínas além da HP-NAP em sua forma nativa são recuperadas na fração não ligada utilizando resinas DEAE em modo descontínuo. A pureza da HP-NAP foi superior a 95 por cento.

O HP-NAP purificado se dobra em um multímero com uma estrutura secundária de alfa-hélice, conforme revelado pelo cromatograma de gelifiltração e pelo espectro de dicroísmo circular na região do ultravioleta distante. Um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol revela que o HP-NAP purificado é capaz de desencadear a produção de espécies reativas de oxigênio pelos neutrófilos. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser realizadas em até cinco horas, se executadas corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar HP-NAP funcional na sua forma nativa com alto rendimento e pureza, utilizando cromatografia em modo negativo com resina DEAE e troca iônica. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar de usar tampões no pH apropriado na etapa de esterilização na cromatografia em batelada. Tivemos a ideia inicial para este método quando tentamos aplicar outras abordagens cromatográficas em vez da filtração para purificar HP-NAP na sua forma nativa.

Embora este método seja projetado para se ligar à HP-NAP recombinante expressa em E. coli. Ele também pode ser aplicado a outros sistemas de expressão bacteriana, como per-sida sep-tidas. A demonstração visual desta medida é um código rápido.

Além disso, os passos de esterilização e cromatografia em lote são difíceis de aprender, pois essas etapas devem ser realizadas a quatro graus Celsius sem qualquer atraso. Se uma proteína projetada para purificação for adequada para nossa cromatografia de troca em modo negativo, este procedimento também poderá ser adaptado como ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa clínica explorarem a possibilidade de utilizar a HP-NAP na terapia contra o câncer, bem como no desenvolvimento de vacinas, medicamentos e diagnósticos para doenças associadas ao Helicobacter pylori.