Name: A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown Listeria monocytogenes Em macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a purificar ARN de Listeria monocytogenes em macrófagos murinos. Este método enriquece ARN bacteriano minimizando a contaminação do hospedeiro e permite estudar a expressão gênica durante a infecção intracelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A pesquisa no laboratório Herskovits é apoiada por 335400 ERC e R01A/109048 bolsas do NIH.

Nota: Durante toda a experiência, as células de macrófagos foram incubadas a 37 ° C numa incubadora de CO2-ar forçado 5% e levado para fora da incubadora apenas para manipulações experimentais, que são realizadas numa câmara de segurança biológica de Classe II. Trabalhando com L. bactérias monocytogenes é de acordo com o nível de segurança biológica 2 regulamentos. 1. Preparação de células e infecção bacteriana (Dia 1 e 2) <ol><li> Dia 1 <ol><li> Semente de medula 2,0 x 10 7 células de osso derivadas de macrófagos (BMDM) sobre um prato de 145 milímetros em 30 ml BMDM + meios Pen-Strep (Tabela 2). Seed 3 placas para cada estirpe bacteriana a ser analisado. Incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora de CO2-ar forçado 5%. </li><li> Iniciar uma cultura bacteriana durante a noite de tipo selvagem (WT) L. monocytogenes 10403S estirpe em 10 ml de meio de infusão de cérebro e coração (BHI), a 30 ° C numa incubadora padrão. Colocar os tubos de cultura inclinada sem agitação. Nota:Estas condições de crescimento sobre-regular a expressão dos genes de flagelos, que promove a infecção eficiente. </li></ol></li><li> Dia 2 <ol><li> Pré-forma quente BMDM (sem antibióticos Pen-Strep) (Tabela 2) e fosfato tamponado salino (PBS) a 37 ° C. </li><li> Lavar monocamada de macrófagos duas vezes com 25 ml de PBS pré-aquecido para remover os antibióticos. Adicionar 30 ml de meio BMDM fresco. </li><li> Lava-se 1,5 ml de cultura bacteriana durante a noite com PBS, as bactérias por centrifugação a&gt; 14.000 xg durante 1 min, descartando o sobrenadante, e ressuspensão suavemente bactérias em 1,5 ml de PBS por pipetagem. Repita duas vezes. </li><li> Infect cada placa de macrófagos com 0,5 ml de uma cultura durante a noite lavou-se de tipo selvagem L. monocytogenes. Se o uso de vários pratos, infectar cada placa 15 min de intervalo. Este intervalo de tempo irá permitir a colheita cada placa individualmente no final da infecção. Nota: A multiplicidade de infecção (MOI) é ensaiado por diluição em séries da cultura bacteriana utilizada para a infecção em placas de agar BHI e contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) após 24 horas de incubação das placas a 37 ° C. Utilizando-se 0,5 ml de WT L. monocytogenes estirpe resultados 10403S em um MOI de 100 ~ (100 cfu por bactérias celular de macrófagos). Ao analisar bactérias mutantes defeituosos no crescimento intracelular, uma MOI superior deve ser considerada. </li><li> Após 0,5 horas de incubação a 37 ° C, lavar as células infectadas duas vezes com PBS, para remover as bactérias não ligadas, e adicionar 30 ml de meio pré-aquecido BMDM. bactérias aderidas vai internalizar durante a próxima 0,5 hr. </li><li> À 1 h após a infecção, adicionar 30 uL de gentamicina (1: 1000 para atingir uma concentração final de 50 ug / ml) para matar bactérias extracelulares. </li><li> Montar o aparelho de filtro, colocando uma cabeça do filtro sobre um balão de recolha de líquido com um orifício de saída de vácuo. Em seguida, colocar um filtro (0,45 mm) sobre uma cabeça do filtro, seguido de um funil e cilindro de garantir as diferentes partes com um metal clâmpada. Prepare água livre de RNase gelada. </li><li> Às 6 h pós-infecção, as bactérias de colheita a partir de células infectadas como se segue. Trate cada placa individualmente. Nota: Normalmente, L. monocytogenes termina 1-log de ​​crescimento durante 6 hr de infecção em células de macrófagos. incubações mais longas poderia resultar numa proliferação bacteriana e a morte celular dos macrófagos, enquanto que períodos de incubação mais curtos pode resultar em cargas bacterianas consideravelmente inferiores. A MOI e o tempo de infecção pode ser modificado para se alcançar as condições óptimas. <ol><li> Lavar as células infectadas com PBS uma vez. Adicionar 20 ml de água livre de RNase gelada para lisar células de macrófagos. Usando um raspador de células, raspar as células da placa rapidamente, mas com cuidado. </li><li> Recolha de células lisadas para um tubo cónico de 50 ml. Vortex durante 30 seg. Centrifuga-se a 800 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Passar o sobrenadante através do aparelho de filtro, utilizando um sistema de vácuo. Com uma pinça, rolar o filtro e rapidamente transferi-lo para a 15 ml CONItubo de cal. Snap-congelar os tubos com os filtros em azoto líquido. </li><li> Montar o aparelho de filtração com um filtro novo para a amostra seguinte, como descrito no 1.2.7. </li><li> Armazenar os filtros congelados a -80 ° C durante o dia seguinte. Alternativamente, vá diretamente para a extração de ácidos nucléicos. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ácidos Nucleicos Extraction (Dia 3) Nota: Executar todas as manipulações com soluções de fenol e clorofórmio em um exaustor. <ol><li> Prepara-se uma mistura 1: 1 de fenol acidificado: clorofórmio, 400 ul de cada amostra. Misturar em tubos separados, e em seguida, retirar a camada aquosa resultante por aspiração. Adicionar 40 ul de SDS a 10%. </li><li> Descongelar os tubos contendo filtro no gelo para mantê-los frio. Para cada tubo contendo o filtro de adicionar 650 ul de tampão de acetato-EDTA (AE) (Tabela 2). </li><li> Execute os seguintes passos tão rapidamente quanto possível. <ol><li> Vortex vigorosamente o tubo contendo o filtro paraque leva o filtro para a periferia do tubo e o tampão de lava completamente o filtro. Sempre mantenha o frio tubo, colocando-o de volta no gelo. Nota: Pode ser necessário Além disso vortex do tubo enquanto invertido para lavar completamente as bactérias fora do filtro. </li><li> Repita o procedimento para todos os tubos. Pode ser útil para girar para baixo a suspensão breve (1 min a 120 x g), no final do processo. </li></ol></li><li> Transferir o tampão de bactérias contendo a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo SDS e a mistura de fenol / clorofórmio (como foi preparada no ponto 2.1). Repita o procedimento para todos os tubos. Pode ser necessário para rodar os tubos de filtragem contendo (1 min a 120 x g) novamente para obter tampão residual do filtro. </li><li> Colocar todos os tubos de 1,5 ml em um dispositivo de vórtice multi-tubos, e agitar com vortex à velocidade máxima durante 10 min. </li><li> Incubar os tubos num bloco de calor a 65 ° C durante 10 min. Centrifuga-se a velocidade máxima (&gt; 14.000 x g) durante 5 min. </li><li> Transferir a fase aquosa (cerca de 400 ul) de cada tUbe para um novo tubo de 1.5 ml contendo 40 ul de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 1,0 ml de etanol a 100%. Vortex cada tubo completamente. Nota: O glicogénio podem ser adicionados nesta etapa para melhorar a visualização do sedimento precipitado. </li><li> Incubar as amostras a -80 ° C durante 1 h. Alternativamente, incubar as amostras a -20 ° C durante a noite. Em seguida, centrifugar as amostras a 4 ° C durante 20 minutos à velocidade máxima (&gt; 14.000 x g). </li><li> Aspirar cuidadosamente o etanol (camada superior) de cada tubo. Adicionar 500 ul de etanol frio a 70% a cada amostra e vórtice completamente. Centrifugar a 4 ° C durante 20 minutos à velocidade máxima (&gt; 1 4000 xg). </li><li> Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada tubo. Secam-se as amostras durante cerca de 2 min, utilizando um evaporador sob vácuo sem aquecimento. Não excesso de secar as amostras. </li><li> Adicionar 25 mL de água livre de RNase para cada amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Cuidadosamente vórtice e spin-down. </li><li> Medir a concentração de ARN em tele amostras usando um microvolume UV-Vis. Esperar para extrair cerca de 0,5-1 mg de ácidos nucleicos por placa. Nota: repetições técnicas podem ser combinadas nesta fase. </li></ol> 3. DNase Tratamento <ol><li> Defina-se a reacção de acordo com o Quadro 1 num tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 45 min. Adicionar 450 uL de água livre de RNase-e 500 ul de fenol-clorofórmio-IAA mistura (Tabela 2), as fases separadas por centrifugação durante 2 min a velocidade máxima (&gt; 14.000 x g). </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 500 mL de clorofórmio-IAA mistura (Tabela 2), e as fases separadas vórtice por 2 minutos de centrifugação a velocidade máxima (&gt; 14.000 x g). </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 1 ml de etanol e 50 uL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2). Vórtice. Nota: O glicogénio podem ser adicionados nesta etapa para melhorar a visualização do sedimento precipitado. </li><li&gt; Incubar durante 1 hora a -80 ° C. Alternativamente, incubar as amostras a -20 ° C durante a noite. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min, a velocidade máxima. </li><li> Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada tubo. Adicionar 500 ul de etanol frio a 70% a cada amostra e vórtice completamente. Centrifugar a 4 ° C durante 20 minutos à velocidade máxima. Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada tubo. </li><li> Secam-se as amostras durante cerca de 2 min, utilizando um evaporador sob vácuo sem aquecimento. Não excesso de secar as amostras. </li><li> Adicionar 12 ul de água livre de RNase, incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente, vórtice, e girar para baixo. As amostras contêm RNA purificado, mantê-los no gelo. Em alternativa, dissolve-se o ARN em RNase H 2 O com 0,1 mM de EDTA ou tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). </li><li> Medir as concentrações de ARN utilizando um microvolume UV-Vis. Esperar ~ 100 ng de RNA por amostra (se repetições técnicas são combinadas). Nota: RNA extraído de acordo com este protocolo é adequado foanálise de transcrição do gene r por várias técnicas. Nós geralmente empregam análise de RT-qPCR para estudar L. monocytogenes transcrição de genes durante a infecção de células de macrófagos 1-4. </li></ol>

<ol><li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li>
<li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887(2012).</li>
<li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP%2C+which+contribute+to+type+I+interferon+induction%2C+play+a+role+in+cell+wall+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li>
<li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li>
<li>World Health Organization WHO. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/en/">http://www.who.int/en/</a> (2005).</li>
<li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+human+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li>
<li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection%3A+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li>
<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li>
<li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+%28SCOTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li>
<li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li>
<li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34(2015).</li>
<li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+3%27Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323(2015).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li>
<li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito representa um método aperfeiçoado para o isolamento de ARN a partir de bactérias L. monocytogenes bactérias que crescem intracelularmente em células de macrófagos. Este protocolo baseia-se na lise diferencial de células e inclui duas etapas principais para enriquecimento de RNA bacteriana: sedimentação núcleos de macrófagos usando centrifugação e uma recolha rápida de bactérias por filtração. Estes passos são seguidos por um processo de extracção de ARN padrão. Embora este protocolo de...

Patógenos bacterianos intracelulares ─ bactérias que causam doenças infecciosas e capaz de crescer e reproduzir no interior das células de hospedeiros humanos ─ são um importante problema de saúde em todo o mundo 5. Para invadir e replicar dentro de uma célula de mamífero, patogénios intracelulares adquiriram sofisticados mecanismos de virulência e factores. Embora estes mecanismos são fundamentais para a capacidade de causar uma doença, pouco sabemos sobre a sua regulação e dinâmica. Uma vez que os perfis de bactérias cultivadas em meio líquido de expressão de genes não reflectem o ambiente real dentro de células hospedeiras, existe uma necessidade crescente de transcriptoma análises de bactérias cultivadas nos seus nichos intracelulares. Tais análises permitirá a decifração de adaptações bacterianas específicas desencadeadas pelo anfitrião e vai ajudar a identificar novos alvos para o projeto terapêutico. A análise do transcriptoma de bactérias cultivadas intracelularmente é altamente desafiador, uma vez ARN de mamífero superam ARN bacteriana por pelomenos dez vezes. Neste artigo, nós descrevemos um método experimental para isolar RNA bacteriana de Listeria monocytogenes bactérias que crescem no interior das células de macrófagos de murino. O ARN extraído pode ser utilizado para estudar adaptações intracelulares e mecanismos de virulência de bactérias patogénicas através de várias técnicas de análise de transcrição, tais como RT-PCR, o RNA-Seq, microarray e outras tecnologias de hibridação baseada. L. monocytogenes é o agente causador de listeriose em humanos, uma doença com manifestações clínicas dirigidas principalmente indivíduos imunocomprometidos, idosos e mulheres grávidas 6. isto é um agente patogénico intracelular facultativo Gram-positiva que invade uma grande variedade de células de mamíferos que tenham sido utilizados durante décadas como um modelo em interacções hospedeiro-patogénio estuda 7. Após a invasão, ele reside inicialmente em um vacúolo ou fagossoma (no caso de células fagocíticas), a partir do qual ele deve escapar para tele hospedar citosol da célula, a fim de se replicar. Vários factores de virulência foram mostrados para mediar o processo de escape, principalmente a hemolisina de formação de poros, listeriolisina O (LLO) e duas fosfolipases 8 adicionais. No citosol das bactérias utilizam a maquinaria a polimerização de actina hospedeiro para impulsionar-se em filamentos de actina dentro da célula e para espalhar a partir de uma célula para outra (Figura 1). Todos os principais fatores de virulência de L. monocytogenes envolvidas na invasão, a sobrevivência e a replicação intracelular, são activados pelo regulador da transcrição mestre virulência, PrfA. 8-10. Na última década, vários estudos realizados por nós e outros métodos para análise de transcriptoma de bactérias cultivadas intracelularmente aplicado com sucesso dentro das células hospedeiras 2,11-15. Duas abordagens principais são usadas para separar o RNA de bactérias de hospedeiro-ARN que são baseadas em: 1) enriquecimento selectivo de ARN bacteriana e 2) de isolamento de ARN por diferential lise celular. A primeira abordagem depende de hibridização subtrativa de extratos de RNA total de moléculas de RNA de mamíferos (por exemplo, utilizando kits comercialmente disponíveis) ou a captura seletiva de sequências transcritas bacterianas (SCOTS) 11. A segunda abordagem baseia-se na lise diferencial de bactérias e células hospedeiras, em que as células hospedeiras são lisadas, enquanto as células bacterianas permanecem intactos. As células bacterianas são em seguida separados a partir do lisado da célula hospedeira, geralmente por centrifugação, e o ARN é extraído por intermédio de técnicas convencionais. O principal problema com esta abordagem é que, juntamente com as bactérias intactas, as células hospedeiras núcleos também são isoladas, assim, as preparações de ARN ainda contêm ARN de mamífero. Uma maneira de ultrapassar este problema é separar as bactérias intactas a partir de células hospedeiras núcleos utilizando centrifugação diferencial, embora este processo normalmente leva tempo aumentar a preocupação de alterações no perfil de expressão de genes durante a extracção. Neste artigo apresentamos uma ba melhorada e rápidacteria protocolo de extracção de ARN, que é baseado no método de lise celular diferencial. Em primeiro lugar, L. monocytogenes infectados macrófagos são lisados ​​com água fria. Em seguida, os núcleos de macrófagos são removidos por uma breve centrifugação e bactérias intactas são rapidamente recolhidas em filtros, a partir do qual o ARN é isolado usando extracção com fenol quente SDS-de ácidos nucleicos bacterianos.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>20</td></tr><tr><td>Macrófagos derivados da medula óssea preparados a partir de camundongos</td><td></td><td></td> fêmeas C57B/6<td>21</td></tr><tr><td>H2O, livre de RNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>Água tratada com DEPC pode ser usada</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tamponado salino-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Infusão de coração cerebral (BHI)</td><td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Fenol saturado pH 4,3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td></td><td>Fisher BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Álcool iso-amílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>W302406</tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, 5% CO2 incubadora de ar forçado</td><td>Raspadores</td> de células <td>Modelo 3111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>da Thermo Scientific Suporte</td><td>de vidro Nunc 179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes para filtros de 45 mm</td><td>Filtros Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore 45&nbsp; mm, 0,45&nbsp; &micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>sistema SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Modelo G560E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoDrop Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm placas de cultura de células</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 1,7 ml, sem RNase</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 &graus; C incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &deg; Bloco de calor C</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; Centrífuga de mesa C</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estéreis, tubos</td><td>Greiner</td><td></td><td></td>Falcon de 25 ml</tr><tr><td>, nitrogênio</td><td></td> líquido Greiner <td></td><td></td>de 50 ml</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a purificação a partir de arn intracelularmente grown<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; em macrófagos

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

A análise do transcriptoma de patógenos bacterianos durante a infecção de mamíferos é uma ferramenta valiosa para estudar genes e fatores que medeiam a infecção. No entanto, isolar o RNA bacteriano de células ou tecidos infectados é uma tarefa desafiadora, uma vez que o RNA de mamíferos domina principalmente os lisados das células infectadas. Aqui descrevemos um método otimizado para isolamento de RNA de bactérias Listeria monocytogenes que crescem dentro de células de macrófagos derivadas da medula óssea. Após a infecção, as células são levemente lisadas e rapidamente filtradas para descartar a maioria das proteínas e RNA do hospedeiro, mantendo as bactérias intactas. Em seguida, o RNA bacteriano é isolado usando extração de fenol-SDS a quente seguida de tratamento com DNase. O RNA extraído é adequado para análise de transcrição gênica por várias técnicas. Este método é empregado com sucesso em nossos estudos de regulação gênica de Listeria monocytogenes durante a infecção de células de macrófagos 1-4. O protocolo pode ser facilmente modificado para estudar outros patógenos bacterianos e tipos de células.

O sistema de modelo é mostrado na Figura 1 e inclui células de macrófagos infectados com L. monocytogenes bactérias, que se replicam no citoplasma de macrófagos. A Figura 2 representa o esquema experimental. A Figura 3 representa os resultados típicos de tal análise de RT-qPCR de genes de virulência durante WT L. monocytogenes crescimento em macrófagos em comparação com o crescimento em meio laboratorial rico BHI. Os re...

Aqui descrevemos um método para isolamento de RNA bacteriano de bactérias Listeria monocytogenes que crescem dentro de macrófagos murinos. Esta técnica pode ser usada com outros patógenos intracelulares e células hospedeiras de mamíferos.

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

O objetivo geral deste procedimento é extrair RNA de bactérias cultivadas intracelularmente em células de macrófagos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de patogênese bacteriana, como, por exemplo, quais são os fatores em genes que as bactérias ativam para mediar a infecção? A principal vantagem desta técnica é que ela enriquece significativamente o RNA bacteriano, ao mesmo tempo que minimiza a contaminação por ácidos nucleicos do hospedeiro.Demonstrará o procedimento Anna Pasechneck, aluna de doutorado do meu laboratório. Para preparar as células para infecção bacteriana, no dia um, utilize placas de 145 milímetros para semear duas vezes dez à sétima potência de macrófagos derivados de medula óssea, ou células BMDM, em 30 mililitros de meio BMDM acrescido de Pen/Strep. Incube a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono em incubadora com ar forçado durante a noite.Inocule uma cultura bacteriana de bactérias selvagens do tipo L.monocytogenes em 10 mililitros de caldo cérebro-coracão, ou BHI. Coloque os tubos em um incubador em posição inclinada e incube a 30 graus Celsius sem agitação durante a noite. No dia seguinte, pré-aqueça o meio

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve um método para o isolamento e purificação de...

Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

Fonte: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o pré-tratamento de macrófagos com vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila para examinar seu efeito na replicação bacteriana. Ao alterar a sinalização imunológica do hospedeiro, os OMVs tornam os macrófagos mais permissivos à infecção. Contagens de colônias mais altas nas células...

Ensaio da replicação de Legionella pneumophila em macrófagos pré-tratados com vesículas de membrana externa

Fonte: Sigal, N., et al. Purificação de RNA a partir de Listeria monocytogenes Cultivada Intracelularmente em Células Macrófagos.  J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra o isolamento de bactérias patogênicas internalizadas a partir de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) infectados. As bactérias são permitidas a se fixar nas células hospedeiras, e as bactérias não ligadas são levadas pela água. Após a internalização, um antibiótico é adicionado para eliminar bactérias não...

Isolamento de Bactérias Patogênicas Intracelulares de Células Hospedeiras Infectadas

Fonte: Sigal, N., et al. Purificação de RNA a partir de Listeria monocytogenes Cultivada Intracelularmente em Células Macrófagos. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a extração de RNA de Listeria monocytogenes isolada de macrófagos murinos infectados. O protocolo preserva o RNA, lisa células usando fenol–clorofórmio e calor, e separa o RNA por centrifugação. Sal e etanol, combinados com incubação a frio, promovem a precipitação de RNA. O RNA resultante captura a expressão gênica induzida...

Extração de RNA de Listeria monocytogenes colhida de Macrófagos Murinos Infectados

Neste vídeo, quantificamos Listeria monocytogenes intracelulares e extracelulares, uma bactéria patogênica intracelular, após a infecção de macrófagos cultivados in vitro usando citometria de fluxo.

Análise de citometria de fluxo de Listeria monocytogenes intracelular e extracelular emergente in vitro

Este artigo descreve um novo método para a infecção oral de camundongos,...

Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

A Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica gram positiva frequentemente utilizado como um importante modelo para o estudo de parasitismo intracelular. Imagiologia tarde L. monocytogenes fases de infecção dentro do contexto de telas de ARN pequenos interferentes permite o estudo global de vias celulares necessários para a infecção bacteriana de células hospedeiras alvo.

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Aqui, nós descrevemos a purificação de Legionella pneumophila (L. pneumophila) vesículas de membrana externa (OMVs) a partir de culturas líquidas. Estas vesículas purificados são então usados ​​para o tratamento de macrófagos para analisar o seu potencial pro-inflamatória.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

Aprenda a purificar ARN de Listeria monocytogenes em macrófagos murinos. Este método enriquece ARN bacteriano minimizando a contaminação do hospedeiro e permite estudar a expressão gênica durante a infecção intracelular.

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown

Explorar mais vídeos