Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste protocolo é medir o dióxido de carbono produzido por moscas-das-frutas intactas, definir substratos radiomarcados, como ácido palmítico ou glicose. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para os pesquisadores de Drosophila, como se uma determinada mutação pode afetar o metabolismo energético. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite medições quantitativas, sensíveis e reprodutíveis da oxidação do combustível em um pequeno número de moscas-das-frutas.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de montagem da cápsula de mosca exigem manipulação rápida de peças pequenas para garantir a construção adequada do aparato experimental antes que as moscas se recuperem da anestesia. O carbono-14 é um emissor beta de baixa energia e tem um curto alcance no ar, mas ainda é preciso tomar cuidado para evitar o derramamento de moléculas radiomarcadas ou ingestão acidental pelo experimentador. Misture um a dois substratos radiomarcados com microcurie com 15 microlitros de corante alimentar azul FD&C Number One e água para obter um volume total de 25 microlitros.

Canalize todo o substrato radiomarcado e a mistura de corante azul no fundo de um frasco vazio de comida para moscas. Como os frascos de comida para moscas tombam facilmente, certifique-se de abrigá-los em um recipiente que evite que tombem. Aqueça a comida padrão para moscas em um forno de micro-ondas até que a comida esteja liquefeita.

15 a 20 segundos em um nível de potência alto geralmente são suficientes para um frasco contendo 10 mililitros de comida. Adicione 975 microlitros do alimento fundido ao substrato radiomarcado e à mistura de corante azul e gire rapidamente enquanto monitora a uniformidade da cor azul para garantir a mistura completa. As pontas da cabeça do tubo podem precisar ser cortadas com a tesoura para alargar a extremidade estreita, permitindo assim o direcionamento preciso do tubo do alimento fundido da víscera.

Deixe os alimentos esfriarem e solidificar completamente em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Um aparelho anestésico de dióxido de carbono composto por polietileno poroso fundido a uma base de acrílico e conectado a um tanque de dióxido de carbono com um regulador de pressão é usado para anestesiar moscas adultas. Fluxo de dióxido de carbono para o aparelho anestesiante a cinco litros por minuto.

Transfira as moscas anestesiadas para frascos contendo alimentos tingidos de azul marcados radioativamente. Tampe cada frasco com uma rolha de espuma e descanse-o horizontalmente até que as moscas acordem. Transfira os frascos para um recipiente de acrílico com tampa.

Para alimentação de curto prazo, as moscas famintas por 18 a 24 horas antes de serem transferidas para alimentos radiomarcados para garantir que comam durante a etapa de alimentação de duas a três horas. Para alimentação a longo prazo ao longo de cinco a sete dias, as moscas não precisam morrer de fome, mas o experimentador deve monitorar o teor de água do alimento radiomarcado nos frascos e usar uma agulha e seringa para adicionar água aos frascos com alimentos secos. Quando o período de alimentação com substrato radiomarcado terminar, transfira as moscas para alimentos não rotulados, colocando-as em um novo frasco.

Um período inicial de perseguição de duas a quatro horas permite que as moscas limpem as partículas de alimentos radiomarcados de suas cutículas e permite a digestão dos alimentos radiomarcados que permanecem no intestino. Monitore o progresso dos alimentos através do intestino por meio de inspeção visual das moscas para procurar abdômen azul. Posteriormente, transfira as moscas para diferentes tipos de alimentos ou temperaturas ambientes.

A duração desse período de perseguição varia de acordo com o experimento que está sendo realizado. Antes de fazer o aparelho de coleta de dióxido de carbono, monte materiais para construir cápsulas de mosca, que são tubos com tampa de malha que conterão moscas marcadas com glicose C-14 ou ácido palmítico C-14 e permanecerão abertas à atmosfera. Prenda uma lâmina de barbear com um hemostático, aqueça-a na chama de um bico de Bunsen até ficar bem quente e use a lâmina aquecida para cortar os 50 milímetros superiores de tubos de polipropileno de 12 milímetros por 75 milímetros, deixando tubos de fundo redondo de 25 milímetros de comprimento.

Prepare quadrados de 35 milímetros por 35 milímetros de malha de náilon de 130 mícrons. Corte vários pedaços de fita transparente de uma polegada e meia a duas polegadas de comprimento. Em seguida, monte materiais para o aparelho de coleta de dióxido de carbono.

Para cada vagem de mosca, monte um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros, uma rolha com cobertura de borracha com um orifício fora do centro, um poço central e papel de filtro de microfibra de vidro GFB de grau. Insira o poço central através do orifício na rolha superior. Prepare hidróxido de potássio a 5% fresco no dia do uso.

Pouco antes de anestesiar as moscas para transferência para a cápsula de mosca, dobre e coloque o papel de filtro GFB circular no poço central que é enfiado no orifício da rolha superior de borracha e sature-o com 100 microlitros de hidróxido de potássio a 5%. A transferência de moscas anestesiadas para as vagens de moscas é a etapa mais difícil deste protocolo. Para garantir o sucesso, tenha todos os materiais necessários ao seu alcance e trabalhe rapidamente para limitar a exposição das moscas ao dióxido de carbono e evitar que as moscas acordem e escapem antes que a malha tenha sido fixada com segurança ao tubo.

Após as incubações em meios não rotulados, anestesiar as moscas com dióxido de carbono. Escove as moscas anestesiadas no tubo de polipropileno cortado, tampe com a malha de náilon e use fita transparente para aderir a malha ao tubo. Um número igual de moscas deve ser usado em cada vagem de mosca para um experimento específico.

10 a 20 moscas por vagem produzem dióxido de carbono radiomarcado suficiente para medição por contagem de cintilação. Transfira a vagem para o frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros. Tampe o frasco de vidro com a rolha de borracha, segurando um poço central contendo papel de filtro GFB saturado com hidróxido de potássio.

Dobre a parte superior larga da rolha com tampa de borracha sobre a borda do frasco para injetáveis de cintilação de vidro. Coloque os frascos de vidro contendo as moscas em um recipiente de acrílico com tampa e incube por períodos de tempo variados. No final da incubação, destampe o frasco de vidro e transfira o papel de filtro GFB saturado com hidróxido de potássio para um frasco de cintilação de plástico de seis mililitros contendo 4 mililitros de coquetel de cintilação.

Prepare frascos de cintilação adicionais, um contendo papel de filtro GFB não utilizado para servir de fundo e um a dois outros frascos contendo 0,1 a 0,5 substrato radiomarcado com microcurie para determinar as contagens por minuto por microcurie. Usando um contador de cintilação, meça as contagens por minuto para cada amostra de acordo com o protocolo do fabricante. Posteriormente, calcule a produção total de dióxido de carbono conforme descrito no texto do protocolo.

As moscas foram colocadas em jejum por 18 horas, alimentadas com ácido palmítico radiomarcado por duas horas e, em seguida, testadas para a produção de dióxido de carbono radiomarcado em grupos de 12 ou 25 animais por incubações de três ou seis horas. Conforme mostrado neste gráfico, a quantidade de dióxido de carbono produzida por 25 moscas foi quase o dobro da quantidade produzida por 12 moscas, e a quantidade de cada grupo dobrou quando o tempo de incubação foi aumentado de três para seis horas. O dióxido de carbono radiomarcado picomolar por mosca por hora foi quase equivalente em cada grupo.

Como o jejum estimula a quebra de ácidos graxos pela oxidação beta, a produção de dióxido de carbono a partir da oxidação de ácidos graxos deve ser elevada em animais em jejum em comparação com animais alimentados. Para testar isso, moscas em jejum de 18 horas foram alimentadas com ácido palmítico radiomarcado por duas horas, divididas em dois grupos e transferidas para comida de mosca não marcada, ou 1% de ágar. Em dois experimentos separados, as moscas perseguidas em ágar produziram significativamente mais dióxido de carbono radiomarcado do que as moscas perseguidas nos alimentos, indicando que a oxidação beta foi aumentada nos animais em jejum.

Após este procedimento, métodos complementares, como medição da produção total de dióxido de carbono e consumo total de oxigênio e cálculo da taxa de troca respiratória, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual é a fonte de combustível preferida. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar este protocolo para determinar o efeito de uma determinada mutação ou manipulação experimental na capacidade de usar um combustível específico como fonte de energia. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser perigoso, e precauções como usar luvas, jalecos e óculos de proteção e usar proteção adequada devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.