Formando polymersomes de tamanho gigante usando hidratação Gel-assistida

O objetivo geral deste método de reidratação assistida por gel é formar de forma robusta vesículas de polímero gigantes unilamelares intactas nas quais a distribuição do tamanho da vesícula pode ser facilmente controlada. Este método oferece uma alternativa robusta para a formação de vesículas poliméricas, que podem ser usadas para investigar as propriedades físicas da membrana e, em seguida, integrar essas vesículas em aplicações de bioengenharia. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de produzir facilmente centenas de vesículas de polímero gigantes intactas muito mais rapidamente e de maneira menos trabalhosa do que as técnicas tradicionais.

Então, a ideia para isso surgiu quando aprendemos sobre a técnica de reidratação assistida por gel para formar vesículas lipídicas gigantes. Nossos métodos atuais para formar polimerossomos gigantes, no entanto, são desafiadores e muitas vezes de baixo rendimento, então decidimos usar essa metodologia como uma abordagem alternativa. Comece a preparação da solução de polímero agitando cinco miligramas de copolímero dibloco PEO-PBD em um mililitro de clorofórmio em um frasco de vidro até dissolver completamente.

Adicione uma solução de cinco miligramas por mililitro de polímero e clorofórmio e uma solução de um miligrama por mililitro de lipídio e clorofórmio marcados com fluorescência a um novo frasco até que uma concentração final de 99,5 por cento de polímero molar e 0,5 por cento de lipídio seja obtida. Para minimizar a evaporação, transfira a solução de polímero para um frasco hermético com tampa resistente ao clorofórmio e armazene-o a 20 graus Celsius para uso posterior. Para iniciar a preparação do filme de agarose, adicione 50 mililitros de água e 0,5 gramas de agarose padrão a um frasco Erlenmeyer de 250 mililitros.

Ferva por um minuto no micro-ondas. Antes de continuar, resfrie a solução de agarose entre 65 e 75 graus Celsius para evitar má aderência ou aglomeração. Em seguida, corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1000 microlitros e use-a para pipetar 300 microlitros da solução de agarose em uma lamínula de vidro quadrada de 25 mililitros.

Enquanto estiver usando luvas, segure a borda da lamínula e espalhe a agarose uniformemente por toda a superfície usando a borda longa de outra ponta de pipeta de 1000 microlitros. Coloque a lamínula com a agarose voltada para cima no parafilme e incube-a a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Continue pipetando 30 microlitros da solução de polímero previamente preparada na lamínula revestida com filme de agarose.

Segure a borda da lamínula com os dedos enluvados e espalhe a solução de polímero sobre o filme de agarose em movimentos circulares usando a borda longa de uma agulha de calibre 18. Termine colocando a lamínula com o lado do polímero voltado para cima em uma placa de Petri de plástico dentro de um dessecador a vácuo. Evacuar o exsicador durante, pelo menos, uma hora para remover qualquer solvente residual.

Para formar polimerossomos, primeiro cole bem uma tampa no lado do polímero da lamínula revestida, pressionando suavemente até formar uma vedação hermética. Em seguida, adicione 200 a 500 microlitros de solução de reidratação à câmara. Em seguida, coloque um lenço umedecido ao longo da borda interna de uma placa de Petri de vidro para formar uma câmara de umidade.

Coloque a lamínula com a tampa colada bem no prato e cubra-a com uma tampa. Cubra a placa de Petri com papel alumínio para minimizar o branqueamento fotográfico e, em seguida, coloque-a em uma placa quente a 40 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para completar a formação do polimerossomo. Para iniciar o processo de imagem FRAP, coloque a lamínula com a tampa aderida bem no stage de um microscópio de fluorescência invertida equipado com um condensador ajustável.

Em seguida, selecione um conjunto de filtros com base no lipídio fluorescente usado e para obter imagens dos polimerossomos na superfície superior da lamínula usando uma objetiva de óleo 100X. Para caracterizar a fluidez da membrana usando FRAP, primeiro concentre-se em um polimerossomo e, em seguida, feche o condensador do microscópio em uma pequena abertura e certifique-se de que as bordas do polimerossomo estejam dentro do campo da imagem. Em seguida, aumente a exposição da câmera, remova todos os filtros de densidade neutra e deixe a região de interesse descolorir por 30 a 60 segundos.

Por fim, desligue a lâmpada e abra totalmente o condensador. Diminua a exposição para as configurações iniciais e capture imagens a cada 30 segundos por três minutos. Abra o software de análise de imagem no computador do microscópio e carregue as imagens adquiridas dos polimerossomos.

Defina a escala para a medição abrindo o menu suspenso Analisar e selecionando a opção Definir escala. Insira as unidades de calibração apropriadas para distância em pixels, distância conhecida e unidade de comprimento e selecione ok. Em seguida, use a caixa de ferramentas de linha e desenhe uma linha abrangendo o diâmetro de um polimerossomo selecionado.

Meça o diâmetro do polimerossomo abrindo o menu suspenso Analisar e selecionando Medir. Para auxiliar na análise, use control plus D para imprimir a linha de medição na imagem antes de passar para o próximo polimerossoma. Continue medindo os polimerossomos usando o procedimento acima e adicionando cada medição à janela de dados até concluir.

Por fim, salve os dados clicando em Arquivo e Salvar como.Clique em Salvar na janela que se abre e abra o arquivo de resultados como uma planilha para analisar os dados. Os polimerossomos formados a partir de filmes de polímero PEO-PBD reidratados com vários tampões foram fotografados usando microscopia de fluorescência. As imagens mostram que os polimerossomos não são homogêneos em tamanho sob as diferentes condições de reidratação, com o diâmetro normalmente abaixo de 10 micrômetros.

Imagens de epifluorescência de polimerossomos formados na água em diferentes temperaturas mostram que, à medida que a temperatura de reidratação aumenta, polimerossomos maiores são formados. Foram calculados os diâmetros médios para mais de 100 polimerossomos formados em água em diferentes temperaturas de reidratação. A 24 graus Celsius, o diâmetro médio era de 2,93 micrômetros, aumentando até 14,04 micrômetros a 70 graus Celsius.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente uma hora se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter os polimerossomos em solução o tempo todo. Certifique-se de que o poço da tampa esteja bem preso à lamínula para evitar vazamento da solução de reidratação e ressecamento dos polimerossomos.

Seguindo este procedimento, métodos como a microscopia eletrônica podem ser usados para entender as propriedades estruturais adicionais dos polimerossomos. Esta técnica abre caminho para a pesquisa em biologia sintética e bioengenharia para explorar os polimerossomos como uma alternativa robusta e quimicamente adaptável às membranas lipídicas para pesquisa e interface abiótico-biótica, pesquisa de entrega de medicamentos e sistemas protocelulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como formar polimerossomos gigantes de forma robusta usando reidratação assistida por gel, ajustar o tamanho geral das vesículas e caracterizar sua integridade de membrana.

Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio ou agarose e agulhas pode ser perigoso. Preste muita atenção ao realizar esses procedimentos. Tome precauções como trabalhar em uma hotte e use óculos e luvas o tempo todo.