Name: Formando polymersomes de tamanho gigante usando hidratação Gel-assistida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a formar polymersomes gigantes usando hidratação assistida por gel com PEO-PBD. Este método rápido permite controlar a distribuição de tamanhos e produzir centenas de vesículas intactas para estudos de membranas e aplicações em bioengenharia.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez e Dr. Walter F. Paxton por sua experiência técnica, conselhos e ajuda neste trabalho. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciências Básicas de Energia, Divisão de Ciências e Engenharia de Materiais (BES-MSE). ACG, DYS e GDB foram apoiados pelo BES-MSE. Este trabalho foi realizado, em parte, no Centro de Nanotecnologias Integradas, um Escritório de Instalações de Usuário de Ciência operado para o Escritório de Ciência do Departamento de Energia dos EUA (DOE) (número do projeto do usuário RA2015A0004, PI: ACG).

1. Polímeros e agarose Preparação Nota: Luvas e um jaleco deve ser usado em todos os momentos ao longo deste protocolo. óculos de segurança também são necessários durante o trabalho com qualquer solvente orgânico ou em qualquer fase com possibilidade de respingos. <ol><li> Prepara-se uma solução / ml 5 mg de polímero em clorofórmio. Adicionar 1 ml de clorofórmio a 5 mg de poli sólido (óxido de etileno) - poli B- (butadieno) (PEO-PBD, 22 EO -BD 37) copolímero dibloco num frasco de vidro e agitar para dissolver totalmente. Executar todas as etapas usando clorofórmio em um exaustor química. </li><li> Misturar num lípido marcado por fluorescência (adquirido já dissolvido em clorofórmio), a uma concentração final de 0,5% mol em 99,5 mole% de polímero não marcado. <ol><li> Por exemplo, pipeta ~ 12 ul de 1 mg / ml de lípido marcado por fluorescência em clorofórmio num 997,58 ul de PEO-PBD, 22 EO -BD 37 de polímero em clorofórmio (com um peso molecular de 2.950 Daltons) para uma concentração final de 0.5% molar de lípido marcado misturado e 99,5% de polímero mole. </li><li> Guardar a solução em um tubo vedado com uma tampa resistente à clorofórmio a -20 ° C. Enrole encanadores fita na borda frasco onde os parafusos tampa sobre o frasco e segura a tampa do frasco. Enrole outro pedaço de fita de canalizadores do lado de fora da tampa e finalmente enrolar Parafilm do lado de fora da fita para assegurar a evaporação mínima. </li></ol></li><li> Adicione um 1% w / v de solução de agarose por mistura de 0,5 mg de agarose padrão em 50 ml de água (ou de sacarose a 50 ml de 100 mM) num balão de Erlenmeyer de 250 mL. Ferva a solução de agarose no microondas padrão para ~ 1 min (ou até completamente dissolvido como observou o clearing da solução). Nota: A solução de agarose pode ser utilizado depois de alguns minutos de arrefecimento ou deixada solidificar, armazenadas e re-fundidos, usando o mesmo procedimento. </li></ol> 2. Preparação de Cinema de agarose <ol><li> Corte a extremidade fora de uma ponta de pipeta de 1000 mL para evitar o entupimento. Usando a ponta de corte, pipeta 300 ml de solução de agarose derretido sobre um quadrado lamela de vidro 25 milímetros diretamente do fabricante. </li><li> Permitir que a agarose-se arrefecer a ~ 65-75 ° C antes da deposição. Se a agarose é muito legal, ele vai começar a se acumular na superfície durante o processo de propagação. Por outro lado, se a agarose é muito quente, que vai exigir mais espalhando a aderir a agarose para a superfície. </li><li> Mantenha apenas a borda da lamela com os dedos enluvados e usar a borda longa de outra ponta da pipeta de 1000 mL de espalhar a agarose uniformemente em toda a superfície da lamela. Mova a ponta da pipeta e para trás através da lamela até que a agarose adere totalmente ao e cobre a lamela. </li><li> Coloque a lamela revestida de agarose para um pedaço de Parafilm com a agarose voltado para cima. Uma vez que o número desejado de lamelas são revestidos, colocar o Parafilm com as lamelas em uma incubadora a 37 ° C para se desidratar a agarose para a superfície durante pelo menos 1 h. Nota: A desidrataçãoé determinada pelo desaparecimento de a camada visível de agarose; a lamela deve olhar plana e clara. Uma vez que os filmes são totalmente desidratada, loja de lamelas com a superfície da agarose para cima em um plástico descartável placa de Petri. </li></ol> Formação 3. Polymer Film <ol><li> Pipetar 30 ul de solução de polímero preparada sobre a película de agarose. </li><li> Mantenha apenas a borda da lamela com os dedos enluvados e usar a borda longa de uma agulha de 18 G para espalhar a solução através dos filmes de agarose usando um movimento de difusão circular. Continuar até espalhando a solução é evaporada. Nota: Tenha cuidado com a ponta da agulha. </li><li> Coloque as películas de polímero no lado polímero placa de Petri de plástico um virado para cima e colocar a placa de Petri num exsicador de vácuo casa padrão coberta em folha de alumínio (para evitar a fotodegradação do lípido marcado) durante pelo menos 1 h para remover inteiramente qualquer solvente residual. </li></ol> 4. Formação de Polymersomes <ol><li> Aderir a coverwell, seja um polidimetilsiloxano caseira (PDMS) bem (um ~ 0,5 centímetros de espessura bloco de PDMS curado com ~ 1 cm de diâmetro de meio socou para fora) ou um disponível comercialmente bem à lamela revestida com a película de polímero. Pressionar a coverwell suavemente sobre a lamela recoberta com o polímero com o polímero virada para cima até uma vedação hermética é formada entre a coverwell e a lamela. Tenha cuidado para não pressionar demasiado duro e quebrar a lamela. </li><li> Adicionar solução de re-hidratação 200-500 ul (água é bom, mas uma variedade de tampões ou meios também funciona) para a câmara (volume de rehidratação depende do tamanho do coverwell aderido). </li><li> Criar uma câmara de humidade para reduzir a evaporação da solução de re-hidratação. Coloque, um Kimwipe molhada rolou ao longo das bordas de uma placa de Petri de vidro. Colocar o filme de polímero com a coverwell aderida para dentro da câmara de humidade e cobrir com uma tampa. Cubra o prato de Petri com papel de alumínio para minimizar a fotodegradação. Lugara placa de Petri sobre uma placa quente a 40 ° C durante pelo menos 30 min. </li><li> Ajustar a temperatura da placa quente durante a re-hidratação 24-70 ° C para ajustar o tamanho das vesículas formadas (Figura 5). 70 ° C é perto da Tm da agarose por isso deve ser tomada precaução quando procedendo para além desta temperatura. </li></ol> 5. Caracterização do polymersomes por recuperação de fluorescência após Fotodegradação (FRAP) <ol><li> Mova a lamela com o respeitado coverwell diretamente a um microscópio invertido para a imagem latente. </li><li> Escolha do conjunto de filtros apropriado com base no lípido fluorescente incluído na solução de polímero. Para lipídios Rodamina-rotulados dopado para as soluções de polímero, use uma 560/25 nm filtro de excitação e um filtro de 607/36 nm de emissão ou conjuntos de filtros comparáveis. </li><li> Usar uma objectiva em óleo de 100X para se concentrar na superfície superior da lamela onde os polymersomes será aderido. Se os polymersomes são especialmentegrandes (&gt; 20 um) ou se a película de polímero é muito grosso, um objectivo de alimentação inferior (por exemplo, 40X) deve ser utilizado para visualizar melhor as polymersomes. </li><li> Identificar os polymersomes usando microscopia de fluorescência. Identificar polymersomes pela vesícula característica oca, esférica, com um diâmetro&gt; 5 mm. </li><li> Caracterizar a fluidez da membrana utilizando recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) num microscópio de fluorescência contendo um condensador ajustável. Devido à natureza aderente de embalagem e apertado de polymersomes sobre os substratos, o movimento natural das polymersomes é limitado, aumentar a qualidade de imagem FRAP. <ol><li> Concentre-se o microscópio sobre a polymersome de interesse. Feche o condensador a uma pequena região e garantir que a aresta de um polymersome está dentro da região da imagem de interesse. </li><li> Aumentar a exposição da câmara e garantir que todos os filtros de densidade neutros são removidos de forma eficaz photobleach da região de interesse. Permitir que a membrana FL<html> uorescência intensidade para photobleach durante 30-60 segundos ou até que a intensidade de fluorescência é significativamente diminuída. </li><li> Desligue a lâmpada e abrir totalmente o condensador. Diminuir a exposição volta para as configurações iniciais e começar imediatamente a captura de imagens a cada 30 seg por 3 min. </li><li> Calcular coeficientes de difusão de membrana usando métodos padrão de 12. Se a região branqueada recupera a intensidade de fluorescência dentro de 3-5 min, isto indica que a membrana é fluido. </li></ol></li></ol> 6. Caracterização de Polymersome Tamanho <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Figura 6. Processo para a análise do tamanho de polymersomes usando software de imagem. Passo-a-passo sobre como medir o diâmetro das vesículas formadas. O usuário deve conhecer as unidades de calibração em pixels / mm do microscópio usado.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol><li> Abra as imagens adquiridas de polymersomes na imagem software de análise 13. </li><li> Defina a escala para a imagem clicando na caixa de analise cair para baixo e a &quot;escala set&quot; clicando. <ol><li> Calibrar a escala para o microscópio, utilizando métodos convencionais (isto é, um micrómetro). </li><li> Preencha das unidades de calibragem e clique em &quot;ok&quot;. </li></ol></li><li> Clique na caixa de ferramentas da linha e desenhar uma linha que mede o diâmetro de uma vesícula. </li><li> Recolher as medidas de comprimento, clicando na caixa de analise suspensa e clicar em &quot;medida&quot;. </li><li> Continuar a medir vesículas individuais após o procedimento acima e cada nova medição será adicionado à janela de dados medições. </li><li> Pressione &quot;Ctrl + D&quot; depois de desenhar cada linha e medição do comprimento para imprimir a linha traçada sobre oimagem, tornando mais fácil para controlar quais vesículas foram analisadas. </li></ol>

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O Sandia National Laboratories é um laboratório multiprograma gerenciado e operado pela Sandia Corporation, uma subsidiária integral da Lockheed Martin Corporation, para a Administração Nacional de Segurança Nuclear do Departamento de Energia dos EUA sob o contrato DE-AC04-94AL85000.

Polymersomes estão sendo amplamente explorados como mímicos de membranas biológicas. As propriedades robustas e versáteis de polímeros torná-los amplamente atraente para estudos que necessitem de funcionalização da membrana, longevidade e capacidade de resposta atento. Os métodos tradicionais de formação de tamanho gigante polymersomes 9,10 (&gt; 4 mm) são de trabalho intensivo e exigem equipamentos caros e especializados. Aqui, nós apresentamos pela primeira vez, um método rápido, versátil e robusto para formar polymersomes tamanho gigante utilizando reagentes de laboratório padrão de baixo custo e equipamentos. Usando reidratação assistida-gel, polymersomes unilamelares podem ser formados rapidamente (&lt;30 min), em uma variedade de soluções de re-hidratação (incluindo meios de cultura de células) e com uma variedade de polímeros diferentes (dados não mostrados). A formação de vesículas multilamelares ou assimétricas não foi observada usando esta técnica. Ao longo deste trabalho, utilizou-se poli (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, 22 EO -BD 37) copolímero dibloco neutro. Muitas composições poliméricas diferentes (incluindo copolímeros de dibloco carregadas) funcionam bem utilizando este método (não mostrado). No entanto, alguns copolímeros tribloco disponíveis comercialmente e copolímeros de dibloco de peso molecular mais elevado (~&gt; 5,000 daltons) não formam polymersomes distintas. Para todas as experiências neste manuscrito, uma baixa concentração de lípido marcado foi dopada para as soluções de polímero, apenas para fins de visualização. Outros métodos para a visualização, incluindo polímeros funcionalizados directamente com um corante fluorescente também pode ser usado. Polymersomes podem também ser visualizados com microscopia de campo claro, embora a microscopia de fluorescência oferece maior resolução. A maioria das pequenas modificações para o protocolo normalmente não alterar os resultados. Por exemplo, pequenas diferenças na concentração da solução de polímero espalhada sobre as lamelas não alteram a formação do polímero de film formado. Enquanto o intervalo completo de concentração não foi determinada, formação polymersome ocorrerá com sucesso com uma grande gama de concentrações de película de polímero (por exemplo, 1-10 mg / ml). No entanto, existem algumas alterações de protocolo que não afectam negativamente a formação polymersome. O mais notável é que lamelas de vidro redondas (em vez de quadrado) resultam em muito pobre formação de polymersomes. Atribuímos isso ao mesmo extremamente camada de agarose no vidro que realmente impede a formação de polymersomes. Um dos desafios mais notáveis ​​da presente técnica é a capacidade de recuperar os polymersomes a partir da superfície com um rendimento elevado. Existem certos casos em que a remoção dos polymersomes a partir da superfície original pode ser vantajosa. Devido ao elevado ruído de fundo de fluorescência do filme de polímero desidratado, removendo polymersomes individuais e aderindo-lhes para limpar lamelas irá aumentar a qualidade de imagem e caracterização (particularmente durante a análise FRAP). Para fazer isso, pipetagem suave com uma pipeta de ponta na qual a extremidade tem sido cortada irá dessorver os polymersomes a partir da superfície (embora o número de vesículas recuperados é significativamente mais baixa do que aqueles originalmente formado). Polymersomes pode então ser colocado em superfícies lamela modificados, permitindo que o polymersome para interagir com a nova lamela. Tipicamente, para neutras polymersomes PEO-PBD, lamelas tratadas com ozono durante 15 min permitir que os polymersomes a cair para baixo para a superfície para imagiologia. Modificação de superfície diferente é necessária para composições polymersome diferentes (por exemplo, negativa ou positivamente carregada polímeros). A maioria dos materiais utilizados neste protocolo são armazenados com sucesso e usado para dias ou semanas. A agarose solidificada pode ser reboiled e reutilizado até que a agarose começa a ter agregados mesmo após a ferver, ou a agarose solidificada começa a secar. As lamelas com películas de agarose secas podem ser armazenadas e a utilizaçãod indefinidamente (por exemplo, meses). O polímero foi dissolvido em clorofórmio pode ser armazenado a -20 ° C durante vários meses. Uma vez que o filme de polímero é seco sobre os filmes de agarose, no entanto, os filmes devem ser armazenadas sob vácuo e utilizado no prazo de duas semanas (armazenamento a longo prazo não foi determinada directamente, mas há diferenças apreciáveis ​​em polymersomes formados a partir de películas de polímero mais de dois semana). Usando o protocolo de re-hidratação assistida-gel apresentado aqui, centenas de polymersomes em forma de uniforme são formados rapidamente com apenas algumas horas de trabalho por meio de equipamentos padrão e reagentes de laboratório de baixo custo. Além disso, polymersomes pode ser formada numa variedade de soluções tampão fisiológico e a partir de composições poliméricas diferentes (não mostrado). Pequenas alterações ao método não alteram negativamente a formação de polymersomes, tornando reidratação assistida-gel de uma técnica versátil e acessível para cientistas com variando e técnicaxpertise. A capacidade de criar facilmente polymersomes gigantes na escala de tamanho das células é essencial para a construção de sistemas de células-like artificiais. A facilidade de utilização e a versatilidade de reidratação assistida-gel para fazer essas polymersomes oferece um grande avanço no campo biomiméticos para a criação de imitadores de células-membrana robustos. Por exemplo, utilizando esta técnica, as estratégias para a encapsulação de diferentes componentes intracelulares, a funcionalização do polímero com proteínas e incorporação de proteínas transportadoras de membrana da membrana celular, só para citar alguns, pode ser concebido para construir células artificiais à base de polymersome.

Criação de vesículas, sintéticos de tamanho de células gigantes unilamelares (GUVs) é de interesse crescente na reconstrução in vitro de diferentes processos celulares para construir uma estrutura para a geração de um sistema de célula de 1,2-como artificial. Enquanto GUVs compostos de membranas lipídicas são excelentes imitadores de membranas naturais, biológicos, eles são instáveis ​​contra flutuações ambientais e têm uma vida útil relativamente curta. Devido a estas limitações, copolímeros em bloco anfifílicos têm sido usados ​​como mímicos de lípidos de modo a formar vesículas de polímero, ou polymersomes. Dentro deste contexto, polymersomes são vantajosas no desenvolvimento de sistemas de células de biomiméticos devido à sua estabilidade aumentada 3, versatilidade química 4,5 e características físicas modificáveis ​​6 - 8. Os métodos atuais para formar polymersomes tamanho gigante incluem eletroformação 9 e reidratação modelada 10, ambos which são demorados, equipamentos de trabalho intensivo, exigem especializada e produzir baixos rendimentos de polymersomes gigantes intactas. Um método de re-hidratação assistida-gel simples foi recentemente desenvolvido para a produção de lípidos GUVs 11. Aqui, nós descrevemos uma adaptação da técnica de hidratação assistida-gel para criar polymersomes gigantes com composições poliméricas diferentes, de tamanho controlado e, em várias composições de tampão. Resumidamente, 1% w / v de gel de agarose de ADN filmes electroforese padrão são desidratados para uma lamela de vidro. As soluções de polímero preparadas em clorofórmio, em seguida, são distribuídos através da película de agarose desidratado e deixou-se evaporar. Após a remoção do solvente total, películas de polímero são re-hidratadas em tampão de escolha do com aquecimento moderado (40-70 ° C) e gigante (&gt; 4 mm) polymersomes tamanho são formados dentro de 30 min. Este método produz rapidamente centenas de totalmente intactas, polymersomes bem formadas utilizando equipamentos de laboratório padrão e Reagents a custos mínimos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que descreve o método de re-hidratação assistida-gel. Polymersomes gigantes compostas de um copolímero dibloco são formados após a ~ 30 min de re-hidratação. O bloco hidrofílico é indicado em magenta e o bloco hidrofóbico é indicado em verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Balão Erlenmeyer de 125 ml</td><td>VWR</td><td>89000-360</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de calibre 18</td><td>VWR</td><td>BD-305196</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas quadradas de 25 mm</td><td>VWR</td><td>48366-089</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Uma agarose padrão para eletroforese em gel de DNA</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>288306-2L</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura</td> <td>comercialCiências de Microscopia Eletrônica</td><td>70336</td><td>Isoladores de Silicone Press-to-Seal</td></tr><tr><td>Fiji Image Analysis Software</td> Download Gratuito do <td>ImageJ</td><td></td>: <td>http://fiji.sc/Fiji&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco de vidro com tampa de teflon</td><td>VWR</td><td>66009-556</td><td>Capacidade de 1,9 ml, caixa de 144</td></tr><tr><td>Lipídios de Liss-rodamina B PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td>1 mg de lipídio na concentração de 1 mg/ml em clorofórmio</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td>10,2 cm x 38,1 m</td></tr><tr><td>poli(óxido de etileno)-b-poli(butadieno) ou PEO-PBD (com peso molecular de 2.940)Fonte de</td> <td>polímero</td><td>P2904-BdEO</td><td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td></tr><tr><td>Pastic Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Fita de teflon</td><td>VWR</td><td>300001-057</td><td>1/2" de largura</td></tr></tbody></table>

formando polymersomes de tamanho gigante usando hidratação gel-assistida

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

As vesículas poliméricas, ou polimerossomos, estão sendo amplamente exploradas como análogos sintéticos de vesículas lipídicas com base em sua estabilidade, robustez, propriedades de barreira, versatilidade química e características físicas sintonizáveis. Os métodos típicos usados para preparar vesículas gigantes (> 4 μm), no entanto, são intensivos em tempo e trabalho, produzindo um baixo número de polimerossomos intactos. Aqui, apresentamos pela primeira vez o uso de reidratação assistida por gel para a formação rápida e de alto rendimento de vesículas poliméricas gigantes (>4 μm) (polimerossomos). Usando este método, os polimerossomos podem ser formados a partir de uma ampla gama de soluções de reidratação, incluindo vários tampões fisiologicamente compatíveis e meios de cultura de células completos, tornando-os prontamente úteis para estudos de biomimética. Essa técnica também é capaz de produzir polimerossomos de forma confiável a partir de diferentes composições de polímeros com rendimentos muito melhores e muito menos dificuldade do que os métodos tradicionais. O tamanho do polimerossomo é facilmente ajustável alterando a temperatura durante a reidratação ou adicionando fluidificadores de membrana à membrana do polímero, gerando polimerossomos de tamanho gigante (>100 μm).

Polymersomes foram formados utilizando o procedimento descrito acima (Figura 1) e o equipamento de laboratório corrente mostrado na Figura 2. Polymersomes foram re-hidratadas com água desionizada (Figura 3) e visualizados num microscópio invertido em epifluorescência utilizando uma objectiva em óleo de 100X. Note que se polymersomes não são visíveis, eles podem ter se formado em tamanhos muito grandes para capturar com um objetivo em óleo de 100X; um objectivo potência menor pode precisar de ser utilizado. Uma das vantagens da utilização de reidratação assistida-gel é a versatilidade de formar polymersomes em uma variedade de soluções de re-hidratação. Polymersomes foram formados com sucesso em água desionizada, um meio de cultura de células de mamífero completa, as soluções de sacarose e as duas soluções tampão f isiologicamente relevantes (solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina tamponada com Tris (TBS)), como mostrado na Figura 4. Sob condições normais (reidrataçãocom água a 40 ° C durante 1 hora), maior do que 70 ~ polymersomes são normalmente encontradas por 40 x 40 um 2 o campo de visão. Enquanto a produção superfície da polymersomes não é homogêneo, há dezenas de campos de visão com este rendimento representativo. Além disso, polymersomes eram estável em solução durante pelo menos 24 h. tamanho polymersomes foi facilmente sintonizado através da hidratação filmes de polímeros a temperaturas variadas. Polymersomes formados em água desionizada a temperatura ambiente tinha um diâmetro médio de 2,9 ± 0,7 um. Medida que a temperatura aumenta durante a re-hidratação, o tamanho médio das polymersomes também aumenta (Quadro 1). A temperaturas elevadas (&gt; 60 ° C), polymersomes formados com tamanhos ainda maior do que 100 um (figura 5). Todo o processamento de imagem foi concluída usando software de imagem de código aberto (Figura 6).Imagens coletadas foram abertas no programa de software. O tamanho do pixel calibrada foi inserido na caixa escala definida. Usando a ferramenta de linha, linhas foram desenhadas entre os diâmetros. Depois de cada linha individual foi elaborado, o comprimento calibrado foi medido e adicionado à caixa de resultados. Os dados podem então ser representados graficamente no software matemático de escolha (por exemplo, Excel, prisma, origem, etc.) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Figura 2. Imagem dos materiais de laboratório comuns e baratos necessários para a formação de polymersomes os itens necessários são: Parafilm, 18,5 g de uma agulha, de polímero em clorofórmio ou outro solvente adequado, uma ponta de pipeta de 1.000 ul, num balão de Erlenmeyer, pinças, agarose, 25 mm lamelas quadrados, poços de imagem PDMS e uma placa de Petri de vidro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para</a>ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens do método de re-hidratação assistida-gel. Dissolvido agarose é espalhada sobre uma lamela quadrado 25 milímetros até um até mesmo filmes de revestimento toda a lamela. Lamelas são então colocados em um 37 ° C incubadora e filme é desidratado. Uma solução de polímero é depositada sobre a película de agarose desidratado e espalhado utilizando uma agulha num movimento circular. A lamela é então colocar num exsicador O / N para evaporar totalmente quaisquer resíduos de solventes. Finalmente, e câmara de imagem é aderida ao substrato e polímeros são re-hidratados com uma solução de escolha e colocado numa placa de Petri a 40 ° C durante pelo menos 25 minutos para permitir a formação de polymersomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da presente figura.</a> </p<html> &gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Figura 4. polymersomes pode formar numa variedade de diferentes tampões. Filmes de polímeros PEO-PBD foram re-hidratadas com o tampão indicado a 40 ° C durante 1 h. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Figura 5. O aumento da temperatura durante a re-hidratação aumenta o tamanho das polymersomes. Imagens de epifluorescência representativos de polymersomes formados em água às temperaturas indicadas reidratação. O aumento da temperatura resulta na polymersomes maiores. Barra de escala = 10 mm._blank &quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temperatura (° C) </td><td> Tamanho médio (uM) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2,93 ± 0,7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5,76 ± 2,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6,65 ± 2,4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11,46 ± 5,8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14,04 ± 7,0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. O aumento da temperatura durante resultados de reidratação em tamanho aumentado polymersome. Diâmetros média para mais de 100 polymersomes na água por condições de temperatura diferentes foram calculados e são descritos aqui. Erro é o desvio padrão.

Apresentamos um protocolo para formar rapidamente vesículas poliméricas gigantes (pGVs). Resumidamente, as soluções poliméricas são desidratadas em filmes secos de agarose aderidos a lamínulas. A reidratação dos filmes poliméricos resulta na rápida formação de pGVs. Este método avança muito na preparação de vesículas gigantes sintéticas para aplicações diretas em estudos biomiméticos.

Formando polymersomes de tamanho gigante usando hidratação Gel-assistida

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

O objetivo geral deste método de reidratação assistida por gel é formar de maneira robusta vesículas poliméricas gigantes unilamelares intactas, nas quais a distribuição de tamanho das vesículas pode ser facilmente controlada. Este método oferece uma alternativa robusta para a formação de vesículas poliméricas, que podem ser usadas para investigar as propriedades físicas da membrana e, em seguida, integrar essas vesículas em aplicações de bioengenharia. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de produzir facilmente centenas de vesículas poliméricas gigantes intactas de forma muito mais rápida e com menor esforço do que as técnicas tradicionais.Assim, a ideia surgiu quando tomamos conhecimento da técnica de reidratação assistida por gel para formação de vesículas lipídicas gigantes. Nossos métodos atuais para formar polimerossomos gigantes, no entanto, são desafiadores e muitas vezes de baixo rendimento, por isso decidimos utilizar essa metodologia como uma abordagem alternativa. Inicie o preparo da solução polimérica girando cinco miligramas de copolímero dibloco PEO-PBD em um mililitro de clorofórmio em um vial de vidro até completa dissolução.Adicione uma solução de polímero em clorofórmio a cinco miligramas por mililitro e uma solução de lipídio marcado fluorescentemente em clorofórmio a um miligrama por mililitro a um novo frasco, até se obter uma concentração final de 99,5 por cento molar de polímero e 0,5 por cento de lipídio. Para minimizar a evaporação, transfira a solução de polímero para um frasco hermético com tampa resistente ao clorofórmio e armazene-a a 20 graus Celsius para uso posterior. Para iniciar a preparação da película de agarose, adicione 50 mililitros de água e 0,5 gramas de agarose padrão a um erlenmeyer de 250 mililitros.Ferva por um minuto utilizando um micro-ondas. Antes de prosseguir, resfrie a solução de agarose para uma temperatura entre 65 e 75 graus Celsius para evitar má aderência ou formação de grumos. Em seguida, corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 1000 microlitros e utilize-a para pipetar 300 microlitros da solução de agarose sobre uma lamínula quadrada de vidro de 25 mililitros.Usando luvas, segure a borda da lamínula e espalhe a agarose uniformemente por toda a superfície utilizando a borda longa de outra ponta de pipeta de 1000 microlitros. Coloque a lamínula com o lado da agarose voltado para cima sobre parafina e incube-a a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, pipete 30 microlitros da solução polimérica previamente preparada sobre a lamínula revestida com filme de agarose.Segure a borda da lamínula com os dedos enluvados e espalhe a solução polimérica sobre a película de agarose em movimento circular, utilizando a borda longa de uma agulha de calibre 18. Conclua colocando a lamínula com o lado do polímero voltado para cima em uma placa de petri de plástico dentro de um dessecador a vácuo. Evacue o dessecador por pelo menos uma hora para remover qualquer solvente residual.Para formar polimerossomos, adicione primeiro um poço de cobertura ao lado do polímero da lamínula revestida pressionando suavemente até que um selo firme seja formado. Em seguida, adicione de 200 a 500 microlitros de solução de reidratação à câmara. Depois, coloque uma toalha de laboratório umedecida e enrolada ao longo da borda interna de uma placa de Petri de vidro para formar uma câmara de umidade.Coloque a lamínula com o poço aderido no interior da placa e cubra com a tampa. Cubra a placa de Petri com papel alumínio para minimizar o desbotamento fotônico e, em seguida, coloque-a sobre uma placa aquecedora a 40 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para completar a formação de polimerossomos. Para iniciar o processo de imagem FRAP, coloque a lamínula com o poço aderido sobre a platina de um microscópio de fluorescência invertido equipado com um condensador ajustável.Em seguida, selecione um conjunto de filtros com base no lipídio fluorescente utilizado e visualize os polímerossomos na superfície superior da lamínula usando uma objetiva de imersão em óleo de 100X. Para caracterizar a fluidez da membrana utilizando FRAP, primeiro foque um polímerossomo, depois feche o condensador do microscópio até uma abertura pequena e certifique-se de que as bordas do polímerossomo permaneçam dentro do campo de imagem. Posteriormente, aumente a exposição da câmera, remova todos os filtros neutros de densidade e permita que a região de interesse sofra fotobranqueamento por 30 a 60 segundos.Por fim, desligue a lâmpada e abra completamente o condensador. Reduza a exposição às configurações iniciais e capture imagens a cada 30 segundos durante três minutos. Abra o software de análise de imagens no computador do microscópio e carregue as imagens adquiridas dos polímerosomas.Defina a escala para a medição abrindo o menu suspenso Analisar e selecionando a opção Definir Escala. Insira as unidades de calibração apropriadas para a distância em pixels, a distância conhecida e a unidade de comprimento, e então selecione OK. Em seguida, use a caixa de ferramentas de linha e desenhe uma linha que percorra o diâmetro de um polímero selecionado.Meça o diâmetro do polímero abrindo o menu suspenso Analisar e selecionando Medir. Para auxiliar na análise, use Ctrl + D para imprimir a linha de medição na imagem antes de passar para o próximo polímero. Continue medindo polímeros usando o procedimento descrito acima e adicionando cada medição à janela de dados até concluir.Por fim, salve os dados clicando em Arquivo e Salvar como. Clique em Salvar na janela que abrir e, em seguida, abra o arquivo de resultados como uma planilha para analisar os dados. Polímerosomas formados a partir de filmes poliméricos de PEO-PBD reidratados com diversos tampões foram visualizados usando microscopia de fluorescência. As imagens mostram que os polímerosomas apresentam tamanho não homogêneo sob as diferentes condições de reidratação, com diâmetro geralmente inferior a 10 micrômetros.Imagens de epifluorescência de polímeros formados em água a diferentes temperaturas mostram que, com o aumento da temperatura de reidratação, formam-se polímeros maiores. Os diâmetros médios de mais de 100 polímeros formados em água a diferentes temperaturas de reidratação foram calculados. A 24 graus Celsius, o diâmetro médio foi de 2,93 micrômetros, aumentando até 14,04 micrômetros a 70 graus Celsius.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente uma hora, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter os polímeros em solução o tempo todo. Certifique-se de que o poço da tampa esteja firmemente preso à lamínula para evitar vazamento da solução de reidratação e secagem dos polímeros.Após este procedimento, métodos como microscopia eletrônica podem ser utilizados para compreender propriedades estruturais adicionais dos polímerossomos. Esta técnica abre caminho para pesquisas em biologia sintética e bioengenharia, explorando os polímerossomos como uma alternativa robusta e quimicamente ajustável às membranas lipídicas, para investigações em interfaces abióticas-bióticas, entrega de fármacos e sistemas de protocélulas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como formar de maneira robusta polímerossomos gigantes utilizando a reidratação assistida por gel, ajustar o tamanho geral das vesículas e caracterizar a integridade de suas membranas.Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio, agarose ou agulhas pode ser perigoso. Preste muita atenção ao realizar esses procedimentos. Tome precauções, como trabalhar em uma câmara de fluxo laminar e usar sempre óculos e luvas.

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Bioengenharia

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