Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

O objetivo geral desta técnica de microinjeção é gerar peixes esgana-gata transgênicos e editados pelo genoma para testar a função do gene e do intensificador. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na genética do desenvolvimento e evolutiva, como como os genes e intensificadores funcionam para gerar padrões corporais. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera peixes transgênicos de forma eficiente para análise genética funcional.

Depois de preparar dois plasmídeos e mRNA de acordo com o protocolo de texto, puxe pelo menos quatro agulhas de micropipeta do vidro borossilicato. Armazene verticalmente em um frasco de armazenamento capilar com as pontas afiadas voltadas para baixo. Para fertilizar até cem óvulos esgana-gata, adicione 50 microlitros de solução de esperma e use uma ponta de pipeta para mexer suavemente para garantir que todos os óvulos sejam fertilizados.

Enquanto trabalha no gelo, preencha pelo menos três agulhas pipetando 0,5 microlitros de solução de injeção na extremidade cega da agulha e deixe-a escorrer. Enquanto isso, acenda a luz de transiluminação do microscópio de dissecação e coloque uma placa de vidro de 13 centímetros quadrados na base da luz do microscópio com uma lâmina de serra de gesso de 15 centímetros em cima da placa de vidro. Oriente a serra perpendicularmente ao aparelho de injeção com as reentrâncias voltadas para o porta-agulhas, ligue a caixa de controle e certifique-se de que a pressão esteja ajustada para aproximadamente 175 quilopascais.

Defina a duração da injeção para 180 milissegundos. Em seguida, afrouxe o porta-agulha e, em seguida, insira uma agulha cheia no porta-agulha até que a resistência do porta-borracha possa ser sentida e aperte o porta-agulha até que esteja apertado com os dedos. Em seguida, ajuste o ângulo da agulha para aproximadamente 45 graus.

Use os controles do micromanipulador para ajustar a agulha de modo que a extremidade fique centralizada no campo de visão. Aumente o zoom para uma ampliação de aproximadamente 40x e concentre-se na ponta da agulha, que não deve tocar o vidro abaixo. Com a pinça do relojoeiro, segure a ponta da agulha a duas a três larguras da pinça da extremidade e quebre suavemente a ponta em um ângulo de 60 graus.

Em seguida, pressione o pedal de injeção várias vezes para testar se a agulha está quebrada. Depois de alguns toques, pequenas gotículas vermelhas devem começar a sair do final. Use uma pipeta de transferência descartável para colocar algumas gotas de água esgana-gata na placa de vidro.

Abaixe suavemente a agulha na água e, em seguida, aumente a contrapressão até que um leve fluxo de líquido rosa saia da agulha. Retraia a agulha o máximo possível para que não seja danificada durante a preparação dos embriões. Aproximadamente 25 minutos após a fertilização, use duas pontas de pipeta de 10 microlitros para remover cinco a 10 embriões da ninhada e transfira para a placa de vidro.

Com as pontas da pipeta, separe suavemente os embriões em reentrâncias individuais da lâmina de serra com cuidado e não perfure os embriões. Em seguida, com uma pipeta de transferência, adicione água esgana-gata suficiente para cobrir os embriões. Então, após três a cinco segundos, remova a maior parte da água, deixando apenas um pequeno volume cobrindo cada embrião.

Começando com o embrião mais distante, deslize a placa de vidro e amplie o embrião para que ele preencha aproximadamente 25% do campo de visão. Abaixe a agulha no campo de visão e, em seguida, use uma ponta de pipeta de 10 microlitros para girar suavemente o embrião para identificar o blastômero, uma protuberância granulada, ligeiramente amarela e elevada de citoplasma na parte superior da gema. Gire o embrião de modo que o blastômero fique diretamente perpendicular à extremidade da agulha.

Abaixe a agulha aplicando pressão lenta e uniformemente para perfurar o córion e insira a agulha no citoplasma sem empurrá-la através da gema subjacente. Pressione o pedal três a quatro vezes para injetar, de modo que um bolo vermelho com bordas ligeiramente difusas preencha aproximadamente 1/8 do diâmetro do citoplasma. Ter uma agulha afiada perpendicular ao córion facilitará esta etapa.

Limitar a quantidade de água adicionada ajudará a manter o corion macio. E, finalmente, direcionar o citoplasma aumentará a probabilidade de obter um animal transgênico. Use os controles do micromanipulador para retrair a agulha e, com a ponta da pipeta de 10 microlitros, segure o embrião se ele grudar na agulha.

Depois de retrair a agulha, deslize a placa de vidro para alinhar o próximo embrião com a agulha e repita a injeção. Quando todos os embriões tiverem sido injetados, use a pipeta de transferência com a extremidade cortada para adicionar água à placa. Em seguida, use uma pipeta de transferência para coletar os embriões e coloque-os em uma placa de Petri de 150 milímetros cheia de água esgana-gata.

Incubar os embriões a 18 graus Celsius. Um dia após a injeção, despeje suavemente a água esgana-gata e substitua por água doce. Verifique se há embriões mortos ou malformados e remova-os para evitar contaminação.

Conforme ilustrado aqui, para transgenes que possuem atividade intensificadora, a injeção bem-sucedida resulta em expressão celular específica do transgene. Por exemplo, nas barbatanas peitorais e medianas e na notocorda. Os peixes injetados podem então ser cruzados para produzir linhas estáveis, como esta linha estável que impulsiona a expressão de GFP no coração embrionário quatro dias após a fertilização.

Para um intensificador ativo, 40 a 50 por cento dos embriões mostrarão expressão transgênica específica do tecido, por exemplo, nas nadadeiras mediana e peitoral. Até 100% dos peixes F0 positivos para GFP que expressam dois transgenes de plasmídeo toll produzem descendentes transgênicos. No entanto, a porcentagem de descendentes portadores do transgene varia amplamente de menos de um por cento a 72 por cento.

Salvar apenas embriões injetados positivos para GFP geralmente aumenta a eficiência da transmissão. Apenas até 10% dos embriões esgana-gata injetados em F0 mostram fluorescência nos tecidos esperados. Além disso, a taxa de transmissão das costas é menor do que a das construções de plasmídeo.

Com apenas até 14% dos esgana-gatas transmitindo as costas. Em contraste com a baixa eficiência da transgênese nas costas, 70 a 100 por cento dos peixes injetados com garras têm lesões em mosaico. Aqui, um amplicon de PCR sem cortes em cada um dos embriões injetados indica que algumas células em cada embrião carregam lesões no locus alvo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em pouco mais de uma hora para uma ninhada de 100 embriões, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que prática e paciência são necessárias para melhorar a técnica e a sobrevivência do embrião. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia confocal, podem ser usados para responder a outras perguntas sobre padrões detalhados de expressão do intensificador.

Além disso, peixes editados pelo genoma podem ser cultivados em cruzamento para estudar fenótipos resultantes de mutações induzidas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da genética evolutiva e do desenvolvimento estudarem a regulação e a função gênica em esgana-gata. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar embriões esgana-gata para transgênese e edição do genoma.