Name: Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda microinjeção para transgenese e edição de genoma em peixes stickleback de três espinhos. Este método eficiente permite testar funções de genes e enhancers em biologia evolutiva e do desenvolvimento.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 # DE021475 (CTM), um NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE), e um NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Agradecemos a Kevin Schwalbach para a realização de recombineering BAC e injeções, Nick Donde para gerar dados de sequenciamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari para feedback útil sobre o protocolo de injeção.

<ol><li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. (1994).</li>
<li>Jones, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+basis+of+adaptive+evolution+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks.</a> Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Shapiro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+evolutionary+pelvic+reduction+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks.</a> Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).</li>
<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+regulatory+change+underlying+altered+expression+and+Wnt+response+of+the+stickleback+armor+plates+gene+EDA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA.</a> eLife. , e05290(2015).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. 142, 2442-2451 (2015).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+linkage+disequilibrium+and+parallel+adaptive+divergence+across+threespine+stickleback+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+parallel+adaptation+in+threespine+stickleback+using+sequenced+RAD+tags%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags.</a> PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).</li>
<li>McKinnon, J. S., Rundle, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+in+nature%3A+the+threespine+stickleback+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Speciation in nature: the threespine stickleback model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).</li>
<li>Shao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+feedback+effects+on+LH+and+FSH%2C+and+photoperiodic+control+of+reproduction+in+male+three-spined+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).</li>
<li>Katsiadaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-spined+stickleback%3A+an+emerging+model+in+environmental+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Int.+J.+Environ.+Physiol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption.</a> Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).</li>
<li>Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+local+immunological+adaptation+of+two+stickleback+ecotypes+by+experimental+infection+and+transcriptome-wide+digital+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis.</a> Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).</li>
<li>Barber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticklebacks+as+model+hosts+in+ecological+and+evolutionary+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology.</a> Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+microinjection+protocol+for+making+transgenic+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-Devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Fisher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Kikuta, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgenesis+using+Tol2+transposon+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Moleculario+Biology%3A+Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors.</a> Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li>
<li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genomic+tools+for+molecular+studies+of+evolutionary+change+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).</li>
<li>Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+for+identifying+distant+regulatory+elements+applied+to+the+Gdf6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene.</a> Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice.</a> BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Talbot, J. C., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+CRISPR+pipeline+to+reliably+generate+zebrafish+frameshifting+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles.</a> Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transposon-Mediated+Gene+Trap+Approach+Identifies+Developmentally+Regulated+Genes+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+compatible+vectors+for+analysis+of+gene+function+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3-new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) </a>. , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).</li>
<li>Dale, R. M., Topczewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+evolutionarily+conserved+regulatory+element+of+the+zebrafish+col2a1a%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a.</a> Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+Gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Injectáveis ​​embriões stickleback unicelulares para transgenia ou edição genoma apresenta três desafios principais. Em primeiro lugar, em relação aos embriões de peixe-zebra, o stickleback embrionária córion é difícil e muitas vezes vai quebrar agulhas. Este problema pode ser parcialmente ultrapassada pela utilização de micropipetas de vidro grosso e mais forte e injectando perpendicular ao córion (ver protocolo, a Figura 2). Assegurar que o mínimo possível de água é adicionada aos embriões (apenas o s...

Um componente fundamental de compreensão de como a biodiversidade surge é a determinação das bases genéticas e de desenvolvimento de alterações fenotípicas evoluíram na natureza. O peixe Gasterosteus aculeatus, Gasterosteus aculeatus, emergiu como um excelente modelo para o estudo da base genética da evolução. Sticklebacks sofreram muitas mudanças evolutivas adaptativas como peixes marinhos colonizaram ambientes de água doce incontáveis ​​em todo o hemisfério norte, resultando em morfológica dramática, fisiológicas e alterações comportamentais 1. Os genomas de indivíduos a partir de vinte e um populações stickleback foram sequenciados e montados, e um mapa de ligação de alta densidade foi gerado para melhorar ainda mais a montagem de 2,3. Experiências de mapeamento genético identificaram regiões genómicas subjacente fenótipos evoluídos 4-6, e em alguns casos, os papéis funcionais de genes candidatos específicos foram testados 7,8. Um número de regiões genômicas subjacentes alterações morfológicas foram identificados com genes candidatos promissores, mas estes candidatos ainda não foram testados funcionalmente 9-12. Além disso, sticklebacks são modelos comuns para estudos de genética populacional / genômica 13,14, especiação 15, o comportamento 1, endocrinologia 16, ecotoxicologia 17, imunologia e parasitologia 18 19. Estudos futuros em cada um desses campos serão beneficiados com a capacidade de executar manipulações genéticas funcionais em sticklebacks. Além manipulando as suas sequências de codificação, os papéis dos genes candidatos pode ser avaliada através do estudo as suas sequências -regulatory cis e por funcionalmente aumentando, diminuindo ou eliminando a expressão do gene candidato. Métodos de microinjeção e transgenia em sticklebacks estão bem estabelecidos 7,8,20 e foram inicialmente desenvolvido utilizando uma mediada por meganucleasemétodo 21 descrito pela primeira vez em medaka 22. O método de microinjeção modificado aqui apresentado foi otimizado para ambos transgênese Tol2 mediada e, recentemente, desenvolveu reagentes edição do genoma incluindo TALENS e CRISPR. Mudanças a cis -regulatory elementos são pensados ​​para ser crítico para a evolução morfológica, como cis -regulatory mudanças podem evitar as consequências negativas pleiotrópicos de codificação de mutações 23. Portanto, testando e comparando seqüências -regulatory cis putativos tornou-se um objetivo central de um número crescente de estudos evolutivos. Além disso, a maioria das variantes de doenças humanas são variantes reguladoras 24,25, e sistemas modelo de vertebrados são extremamente necessários para estudar a função elemento -regulatory cis e da lógica. Os peixes que fertilize seus embriões externamente em grandes números oferecem sistemas de vertebrados poderosas para estudar Regulamentação cis. O sistema de transposão Tol2, em que FOREIDNA gn para ser integrado no genoma é ladeado por sites e vinculativo Tol2 transposase co-injectados com mRNA transposase Tol2, trabalha com alta eficiência para integrar com sucesso plasmídeo constrói-se em genomas de peixes 26 - 28. Tipicamente, um intensificador de potencial é clonada a montante de um promotor basal (tais como hsp70l 29) e o gene repórter fluorescentes tais como a EGFP (proteína fluorescente verde melhorada) ou mCherry em uma espinha dorsal Tol2 e injectados com ARNm da transposase 26. Observação de expressão do repórter fluorescente, quer em embriões ou crias com transgenes integrados estavelmente injectados, fornece informação sobre a regulação espaço-temporais da expressão do gene dirigido pelo potenciador putativo. Em experiências adicionais, os potenciadores validados pode ser utilizado para dirigir a sobre-expressão específica de tecido dos genes de interesse. Para a análise das regiões -regulatory cis maiores, de alta qualidade em grande inserção genombibliotecas de IC utilizando cromossomos artificiais bacterianos (BACs) foram construídos para ambas as marinhas e de água doce sticklebacks 30. Estes BACs pode ser recombineered para substituir um gene com um gene repórter fluorescente, no contexto de uma grande (150-200 kb) região genómica 31. O repórter fluorescente é então expresso num padrão espaço-temporal, tal como determinado por sequências reguladoras dentro do BAC. Para os estudos em peixes, locais Tol2 pode ser adicionado ao CCB para facilitar a integração genómica 32,33. Nas fases posteriores de desenvolvimento quando a hibridação in situ é tecnicamente difícil, a leitura de fluorescência do BAC pode ser usado para estudar os padrões de expressão de genes, como tem sido demonstrado para stickleback osso proteína morfogenética 6 (BMP6) 20. Além disso, os padrões de expressão fluorescentes em um indivíduo pode ser rastreados ao longo do tempo, o que não pode ser conseguido com a hibridização in situ. BACs pode também ser usado para adicionar uma additional cópia de uma região genómica de aumentar a dosagem de um gene de interesse. Para o estudo da função do gene, genoma de edição é um campo explosivamente expansão que pode ser utilizado para produzir alterações específicas para sequências genómicas em uma ampla variedade de organismos 34. Transcrição nucleases efetoras ativador-like (TALENS) são nucleases modulares, específicos de sequência originalmente isoladas de patógenos de plantas que podem ser precisamente projetados para ligar directamente a uma sequência genômica de escolha e gerar uma cadeia dupla quebrar 35,36. Agrupamentos regularmente interespaçadas palindrï¿½icas repetições curtas (CRISPR) / CAS sistemas foram originalmente encontrada em bactérias e utilizar um guia de RNA e da proteína Cas9 para gerar um intervalo de uma sequência de ADN alvo complementar para o guia 37. A reparação posterior da quebra de cadeia dupla criada por ambos os TALENS e CRISPR muitas vezes deixa para trás uma pequena inserção ou deleção, o que pode prejudicar a função da sequência alvo35-37. Em sticklebacks, TALENS têm sido utilizados para interromper a expressão do gene por direccionamento um intensificador de 20, e ambos TALENS CRISPR e ter sucesso na produção de mutações em sequências de codificação (dados não publicados). Um protocolo detalhado para a geração de CRISPR para uso em peixes-zebra pode ser utilizada como orientação para desenvolver CRISPR para sticklebacks 38. Transgênicas e genoma experimentos de edição requerem introdução de ácidos nucleicos em um embrião de uma célula recém-fertilizado. Ao introduzir a ferramenta transgene ou genoma de edição no início do desenvolvimento, o número de células filhas geneticamente manipuladas no embrião é maximizada. embriões injectados são então visualmente pesquisadas quanto a fluorescência ou molecularmente rastreados para modificações do genoma. Se as células que contribuem para a linha germinal são orientados com sucesso, o transgene ou a mutação pode ser passada para um subconjunto de prole, mesmo quando letalidade pós-injecção é alta. Os peixes de mosaico pode ser outcrossed ouentrecruzadas e os seus descendentes selecionados para recuperar os alelos mutantes ou um transgene integrado de forma estável de interesse. Este protocolo descreve métodos para a introdução de transgenes e edição de reagentes genoma em embriões stickleback unicelulares e monitoramento para modificações genômicas de sucesso.

<table><tbody><tr><td>Estereomicroscópio com transiluminação</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador manual</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MM33</td><td>Micromanipulador Marzhauser M33</td></tr><tr><td>Sistema de injeção de pressão</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de contrapressão</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Kit de suporte de micropipeta</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de base magnética</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>Base</td><td></td>magnética</tr><tr><td>Interruptor de pé</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ferro (base magnética)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipeta Extrator</td><td>Instrumento</td> <td>SutterP-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0,5% vermelho de fenol em DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>pinça de injeção</td></tr><tr><td>#5, biologie dumoxel&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11252-30</td><td>para quebra de agulhas</td></tr><tr><td>Micropipeta Jarra de Armazenamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>comporta agulhas</td></tr><tr><td>6", 6 dentes por polegada serra de gesso para drywall</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>segura ovos para injeção</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm placa de vidro</td><td>qualquer loja de ferragens-Capilares</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de vidro borosilicato, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*vidro mais duro do que capilares de injeção de peixe-zebra</td></tr><tr><td>150 x 15mm Fisher</td><td></td><td>FB0875714</td><td>cria embriões de esgana-gata</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Fisher</td><td></td><td>08-757-100A</td><td>armazena ovos pré-injeção</td></tr><tr><td>Sal Instantâneo</td><td>Ocean Instantâneo Oceano</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr> Kit de transcrição de <tr><td>tricaína metanossulfonato/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>para peixes</td></tr><tr><td></td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Para transcrição de TALENs e transposase mRNA</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purifica transposase ou TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick Kit de limpeza de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>limpa plasmídeos para injeção</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>para preparação de DNA BAC</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polimerase</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contém tampão de enxágue de endotoxina</td></tr><tr><td>Extração de Gel QIAQuick</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>para sequenciamento de mutações induzidas</td></tr><tr><td>Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (grau de biologia molecular)</td> <td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-acetato-EDTA tampão</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0,5-10 Kb escada</td> <td>de RNAThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&nbsp; Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb mais escada de DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td> Tubo de PCR de 12 <td>tiras Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjeção para transgénese e genoma edição na threespine sticklebacks

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

O peixe Gasterosteus aculeatus emergiu como um poderoso sistema para o estudo da base genética de uma larga variedade de características morfológicas, fisiológicas e comportamentais fenótipos. Os notavelmente diferentes fenótipos que evoluíram como populações marinhas se adaptar a ambientes de água doce incontáveis, combinados com a capacidade de atravessar formas marinhas e de água doce, fornecer um sistema de vertebrados rara em que a genética pode ser usada para mapear as regiões genômicas controlar evoluiu características. Excelentes recursos genômicos estão agora disponíveis, facilitando a análise genética molecular das alterações evoluídos. Enquanto experimentos de mapeamento gerar listas de genes candidatos interessantes, manipulações genéticas funcionais são necessários para testar o papel destes genes. regulação do gene pode ser estudada com plasmídeos repórter transgénicos e BACs integrado no genoma usando o sistema de transposase Tol2. Funções de genes candidatos específicos e elementos cis -regulatory pode ser avaliada através da indução de alvomutações com reagentes de edição genoma TALEN CRISPR e / Cas9. Todos os métodos requerem a introdução de ácidos nucleicos em embriões stickleback uma célula fertilizada, uma tarefa feita desafiador pelo córion espessura de embriões stickleback eo relativamente pequeno e fino blastomere. Aqui, um protocolo detalhado para microinjecção de ácidos nucleicos em embriões stickleback é descrita para aplicações transgénicos e de edição de genoma para estudar a expressão e função do gene, bem como técnicas para avaliar o sucesso de transgénese e recuperar linhas estáveis.

Para transgenes de gene repórter que têm actividade potenciadora, injecção bem sucedido resultará na expressão específica, celular do transgene (Figura 4A, 4C). Peixes podem então ser injectados outcrossed para produzir linhas estáveis ​​(exemplo de uma linha estável BAC mostrado na Figura 4B). ADN em embriões stickleback injectando tipicamente resulta em letalidade muito mais elevado do que o RNA sozinho. É típico para ver até 50% (por ...

Manipulações transgénicas e edição genoma são críticos para testar funcionalmente o papel dos genes e elementos -regulatory cis. Aqui, um protocolo detalhado para microinjecção a geração de modificações genómicas (incluindo construções Tol2 mediadas repórter fluorescentes transgene, TALENS, e CRISPR) é apresentada para o peixe modelo emergente, a Gasterosteus aculeatus.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

O objetivo geral dessa técnica de microinjeção é gerar peixes espinhel transgênicos e com edição genômica para testar a função de genes e enhancers. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na genética do desenvolvimento e evolutiva, como a forma pela qual genes e enhancers funcionam para gerar padrões corporais. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera eficientemente peixes transgênicos para análise genética funcional.Após preparar os dois plasmídeos e o mRNA de acordo com o protocolo descrito, puxe pelo menos quatro agulhas de micropipeta a partir de vidro de borossilicato. Armazene-as verticalmente em um frasco de armazenamento de capilares com as pontas afiadas voltadas para baixo. Para fertilizar até cem ovos de espinhel, adicione 50 microlitros de solução de esperma e use uma ponteira de pipeta para misturar suavemente, garantindo que todos os ovos sejam fertilizados.Enquanto trabalha no gelo, preencha ao menos três agulhas injetando 0,5 microlitros da solução de injeção na extremidade romba da agulha e permita que escorra. Enquanto isso, ligue a luz de transiluminação do microscópio estereoscópico e coloque uma placa de vidro de 13 centímetros quadrados s

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Fonte: Chen, S., et al., Cirurgia Estereotáxica para Manipulação Genética em Células Estriatais de Cérebros de Camundongos Neonatais. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vetor viral que codifica a Cre recombinase e a proteína de fluorescência verde ou GFP no estriado de um filhote de camundongo geneticamente modificado para obter a manipulação de genes extirpando um STOP flanqueado por loxP, ativando a proteína de fluorescência vermelha ou RFP como repórter.

Microinjeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação gênica em um filhote de camundongo estriado

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Um protocolo simples e eficiente de microinjeção para edição de genes em embriões de bagre de canal usando o sistema CRISPR/Cas9 é apresentado. Neste protocolo, guia de RNAs e proteínas Cas9 foram injetadas na gema de uma célula de embriões. Este protocolo foi validado por nocauteando dois genes imune-relacionados de bagre do canal.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

Microinjeção de Nasonia vitripennis embriões é um método essencial para gerar modificações hereditárias do genoma. Aqui descrito é um procedimento detalhado para microinjeção e transplante de embriões Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente a manipulação futura do genoma deste organismo.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Aqui, um protocolo é apresentado para produzir e traseira CRISPR / Cas9 genoma nocaute peixeelétrico. Descritos em detalhes são os requisitos necessários de biologia molecular, reprodução e criação para um ginásio e um mormyrid, e técnicas de injeção para produzir larvas DelF 0 induzidas por Cas9.

Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

O presente protocolo descreve a microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 e DNA do doador para produzir eficientemente camundongos knock-in e floxed de gênico.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

Aprenda microinjeção para transgenese e edição de genoma em peixes stickleback de três espinhos. Este método eficiente permite testar funções de genes e enhancers em biologia evolutiva e do desenvolvimento.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

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