Name: Avaliação de miofilamentos Ca 2+ Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a avaliar a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+ em cardiomiócitos isolados de ratos usando Fura-2 AM e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar o acoplamento excitação-contração em corações saudáveis e doentes.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2013068067); pelo Programa de Pós-Graduação Cérebro Korea 21 do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia, Hospital da Universidade Nacional de Seul, a sociedade coreana de Hipertensão (2013), SK Fund Research Telecom coreano (no. 3420130290) e da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 31460265; 81260035 NSFC).

O protocolo está de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais da ONU de Saúde (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996). Foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Seul (aprovação IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Tampão de Preparação (Materiais de mesa e equipamentos) <ol><li> Preparar 300 ml de solução de isolamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glicose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 com NaOH). </li><li> Preparação de 100 ml de solução de armazenamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO4 5; CaCl2 0,2; de sódio e piruvato 5; glucose 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 com NaOH). </li><li> Prepare 1 litro de solução de perfusão (em mM: NaCl, 141,4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MGCL 2, 1; HEPES, 10; glicose, 5,5; CaCl2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 com NaOH). </li><li> Preparar 30 ml de uma solução de colagenase, adicionando colagenase (1 mg / ml), a protease (0,1 mg / ml), albumina de soro bovino (BSA, 1.67mg / ml), e Ca2 + (0,05 mM) a 25 ml de isolamento solução. </li><li> Preparar 20 ml de solução de colagenase 2 por adição de colagenase (1 mg / mL), BSA (1,67 mg / ml), e Ca2 + (0,05 mM) a 16,7 ml de solução de isolamento. </li><li> Preparar 40 ml de solução de BSA através da adição de 0,4 g de BSA a 40 ml de solução de isolamento. Separado 10 ml e 30 ml em duas provetas. Adicionar Ca 2+ a 30 ml de solução de BSA de modo que a concentração final de Ca2 + em solução de BSA a 1 mm. </li></ol> 2. Preparação para o isolamento de Left ventricular (LV) miócitos <ol><li> Transferir 8-12, ratos semanas de idade do sexo masculino Sprague-Dawley (SD) em gaiolas de transporte não poluentes do biotério para a sala de preparação e isolamento. </li><li> Hcomer dois banhos de água a 37 o C. Nota: Utilize banho de uma água para a água - reservatório encamisado e os tubos de perfusão do sistema de perfusão Langendorff. Use outro banho de água para agitar troncos de tecido do miocárdio, a fim de separar os miócitos individuais. </li><li> Adicionar 5 ml e 3,3 ml de solução de BSA (sem Ca2 +) para 25 ml de solução de colagenase 1 e 16,7 ml de solução de colagenase 2 para perfazer o volume para 30 ml e 20 ml, respectivamente. </li><li> Adicionar solução de isolamento (100 ml) e solução de colagenase 1 (30 ml) a uma coluna (Cl 1) e a coluna 2 (Cl 2) no sistema de perfusão de Langendorff, respectivamente (Figura 1A). </li><li> Oxigenar a solução de isolamento e uma solução de colagenase em Cl 1 e Cl 2 através do tubo de ligação de oxigénio no sistema de perfusão de Langendorff (Figura 1A). Da mesma forma, a solução de colagenase oxigenado 2 e a solução de BSA no banho de água com agitação, com 100% de O2 através datubo de ligação de oxigênio. </li></ol> 3. Isolamento de LV miócitos <ol><li> Anestesiar uma ratazana SD por meio de injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) e confirmar o estado anestésico por dedo do pé que comprime e falta de retirada reflexão. </li><li> Mova o rato para uma bandeja de dissecação. Na posição supina, fixe as quatro pernas para os lados do corpo com fita. </li><li> Aplicar incisões mid-axiais com tesouras cirúrgicas torácicas para abrir a caixa, garantindo a não danificar o coração. Use um outro par de tesouras limpas para dissecar o coração dos vasos comunicantes (por exemplo, superior e inferior da veia cava, vasos pulmonares e aorta) e membrana de pericárdio 13. </li><li> Deixar uma porção da aorta de um comprimento suficiente (5-8 mm), prender a aorta, com uma pinça fina e montar rapidamente a cânula do sistema de perfusão de Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Amarre fio de sutura 4/0 firmemente sobre a aorta. </li><li&gt; Ligar a válvula em Col. 1 e perfundir o coração isolado com uma solução de isolamento pré-aquecido e oxigenado durante 10 min (taxa de perfusão: 12-14 mL / min). Desligue a válvula na Col. 1, acender a válvula na Col. 2 e perfundir o coração com solução de colagenase 1 para 8-10 min. </li><li> Desmontar o coração digerido por corte da aorta e transferi-lo, mantendo a aorta com uma pinça para o balão contendo uma solução de isolamento fresco (Figura 1bi). Use uma tesoura fina e pinças para cortar a maior parte de parede livre do VE (incluindo o septo) em pedaços menores (~ 22 mm, Figura 1Bii). </li><li> Transferir os pedaços para um frasco contendo uma solução de colagenase fresco pré-aquecido e oxigenado 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Manter a entrega de oxigênio para a solução de colagenase contendo miócitos 2. </li><li> Mova o miócitos - suspensão para um tubo de 10 ml de centrífuga usando conta-gotas com um bulbo de sucção e adicionar Ca 2+ - contendo solução de BSA (1: 1 em volume). Centrifugar a 30 g durante 2 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de miócitos em 5 ml de solução de BSA. Centrífuga e descartar o sobrenadante. </li><li> Dispersar os peletes de miócitos e manter miócitos em 10 ml de solução de armazenamento de pré-oxigenado à TA (Figura 1Biv-VI). </li><li> Repita os passos processuais (3,7-3,9) com o tecido do LV restante no frasco. Nota: Manter repetindo os procedimentos (passos 3,7-3,9) novamente até que a maior parte do tecido do LV desaparece para se obter um bom rendimento de miócitos. </li><li> Manter os miócitos em solução de armazenamento para 6-8 horas a temperatura ambiente, até ao fim das experiências. </li></ol> 4. As medições simultâneas de Ca2 + intracelular Transitórios e miócitos Contração <ol><li> miócitos carga LV com o éster de acetoximetilo de Fura-2 AM (2 | iM). Nota: Execute todos os procedimentos de carga e experiências com miócitos carregados em um tubo escuro (Figura 1Bvii). <ol><li> Centrifuge a suspensão de miócitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Descartar o sobrenadante e re-suspender o pellet de miócitos em 1 ml de solução de Tyrode com uma baixa concentração de Ca2 + (250? M, Materiais de mesa e equipamentos). </li><li> Adicionar Fura-02:00 e poloxamer 407 (2 mL), suavemente dispersar a suspensão de miócitos, e manter a mistura temperatura ambiente (20-24 ° C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii). </li><li> Centrífuga-se a mistura durante 5 seg, descartar o sobrenadante e dispersar o sedimento de miócitos em 1 ml de solução de perfusão contendo 500 uM de Ca 2+. Depois de 10 minutos, centrifugar a mistura durante 5 seg e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar solução de perfusão fresco (500 | iM de Ca2 +, 1 ml) e manter o Fura-02:00 - sedimento miócito carregado nesta solução de gravação. </li></ol></li><li> A medição da contracção dos miócitos e Ca2 + intracelular <ol><li> Antes de gravar, encher o tubo de perfusão que é executado através de umacamisa de água com a solução de Tyrode, que é pré-aquecido a 36 o C. </li><li> Coloque algumas gotas do Fura 02:00 - carregado suspensão de miócitos LV na câmara de um microscópio de fluorescência invertido para 5-8 min. Lentamente perfundir a solução de Tyrode (2,2 ml / min). </li><li> Pressione o botão &quot;start&quot; no painel frontal do estimulador digital para iniciar a estimulação de campo (2 Hz). Nota: A tensão de saída (10 V, 5 mseg de duração) é aplicado aos miócitos na câmara por meio de fios de platina posicionados em ambos os lados da câmara. <ol><li> Seleccione miócitos que se contraem de forma estável (não aqueles que apresentam hiper ou hipo-contração) para a gravação. </li></ol></li><li> Ajuste do miócito de escolha na posição horizontal do sistema de detecção à base de sarcómero vídeo e ajustar a focagem do microscópio, para obter imagens óptimas de sarcómeros. Posicionar a caixa retangular roxo na área em que sarcômeros claras são claramente observados até a médiade comprimentos de sarcômero (pico vermelho) mostra um pico singular afiada (Figura 2A, imagem inferior). </li><li> Gravar as mudanças de comprimento do sarcómero em resposta à estimulação do campo (Figura 2A e B). Nota: Use os miócitos carregados dentro de 1 - 2 horas. </li><li> Ajustar a abertura da câmara de modo a que o campo no sistema de detecção à base de sarcómero vídeo é o tamanho do miócito (Figura 2A). Estimular a miócitos com excitação a 360 nm / 380 nm e emissão a 510 nm (freqüência de aquisição de 1.000 Hz). Encurtamento do sarcômero Record e a relação Fura2 AM com estimulação de campo (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 5. Avaliação de miofilamentos Ca2 + Sensibilidade <ol><li> Calcular a média dos comprimentos de sarcômero e Ca 2 + transientes no estado estacionário (10 - 20 traços) e traçar o ciclo do plano de fase da relação de Fura-2 vs. comprimento do sarcômero do mesmo miócitos (ambos com valor medidos e delta mudanças; Figura 2c). </li><li> Em cada parcela, definir rácio Fura -2 a 50% de relaxamento (EC50, Figura 2C). Compare tanto o loop e EC 50 de cada intervenção. </li></ol>

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<li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li>
<li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li>
<li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM%2C+DCM+AND+RCM%3A+what+can+we+learn+about+thin+filament+function%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li>
<li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li>
<li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li>
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<li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares de Ca2 + transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionais que medem a contr...

Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração 1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na +, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de Ca2 + (LTCCs) e influxo de Ca2 + através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação de Ca2 + através dos receptores de rianodina (RyRs), aumentando a concentração citosólica de Ca2 + a partir do nanomolar (nM ) a micromolar nível (^ M). Um tal aumento no Ca 2+ citosólica de Ca2 + promove a ligação à troponina C (TNC) em filamentos finos e induz alterações conformacionais do complexo filamento para facilitar a interacção actina-miosina e alcança myocardial contração 3. Por outro lado, o Ca2 + citosólico é re-captado volta para o retículo sarcoplasmático (RS) através da Ca2 + -ATPase em SR (SERCA2a) ou é extrudada para fora do miócito através do Na + / Ca2 + e o permutador de plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Consequentemente, o declínio no Ca 2+ citosólico instiga mudanças conformacionais de filamentos finos de volta ao estado original, resultando na dissociação da actina-miosina e miócitos relaxamento 1-3. Neste esquema, a actividade da SERCA2a é geralmente considerada para determinar a velocidade de relaxamento do miocárdio porque é responsável por 70 - 90% de remoção citosólica de Ca2 + na maioria das células de mamífero do coração 1. Como tal, anormal manipulação de Ca 2+ por LTCC, RyR e SERCA2a, etc. tem sido considerado os mecanismos principais para comprometimento da contratilidade e relaxamento no coração doente 1-4. de Ca2 +, que funciona como o mensageiro em contas de acoplamento CE para cerca de 1% do total de Ca 2+ e a maioria dos Ca 2+ é obrigado a intracelulares de Ca2 + buffers 5,6. Isto é devido ao facto de vários tampões Ca 2+ são abundantes em miócitos cardíacos, por exemplo, fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, a calmodulina, a parvalbumina, miofibrila TnC, miosina, SERCA2a, e calsequestrin no SR. 5,6,7. Entre eles, SERCA2a e TnC são as predominantes Ca 2+ buffers 5,6,7. Além disso, o Ca 2+ ligação aos seus tampões é um processo dinâmico durante tique (por exemplo, 30-50% de Ca 2+ se liga a TnC e dissociam-se que durante os transientes de Ca2 + 7) e a alteração no Ca 2+ causa adicional de ligação &quot;libertação&quot; de Ca2 + livre para o citosol, os resultados nas alterações do Ca2 + intracelular concentration. Consequentemente, a perturbação do nível intracelular de Ca 2+ induz movimentos miofilamentos anormais, que são os precursores da disfunção contráctil e arritmias 8,9. Muitos factores (tanto fisiológicos e patológicos) podem ser as fontes de modificações pós-transcricionais de proteínas miofilamentos, que influenciam miofilamentos Ca 2+ e de tamponamento miofilamentos Ca 2+ sensibilidade 8-10. Recentemente, foi relatado que mutações em proteínas miofilamentos aumentar o Ca2 + intracelular e a afinidade de ligação a manipulação de Ca2 +, desencadeando a potenciação dependente de pausa de transientes de Ca2 +, Ca2 +, libertação anormal e arritmias 8. De acordo com este conceito, mostrámos também que miofilamentos Ca 2+ dessensibilização em corações de ratos hipertensos secundárias à sobre-regulação da sintase do óxido nítrico neuronal está associada com elevada diastólica e sistólica Ca 2+ níveis11, que por sua vez, aumenta a vulnerabilidade do LTCC ao Ca2 + inactivação dependente 12. Assim, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é um regulador &quot;ativo&quot; da função contrátil intracelular de Ca2 + homeostase e miócitos. Tornou-se necessário analisar as interacções entre miofilamentos e Ca 2+ manipulação proteínas para investigação aprofundada sobre miócitos acoplamento CE e função cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo que avalia as mudanças de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade em miócitos cardíacos isolados. Análise abrangente do intracelular perfil Ca 2+, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade e contração vai descobrir novos mecanismos mecânicos do miocárdio subjacentes.

<table><tbody><tr><td>Rato Sprague Dawley</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 semanas</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sódico</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Coréia)</td> <td>AHN901</td><td>Código de seguro: 645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td> <td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Fetal Bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td> <td>Sondas Moleculares</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 Solução a 20% em DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria agitado</td><td>Chang Shin Modelo científico</td><td>: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Construtor experimental</td><td>Aquisição e análise de dados de acoplamento EC em miócitos</td></tr><tr><td>miócitos cálcio e Sistema de Registro de Contratilidade</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria Circulante</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência de Miócitos</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência & Detecção de vídeo</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência e Interface do sistema</td> Fonte de luz de excitação <td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada ARC de alta intensidade Fonte de alimentação</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter controlador de roda</td><td>IonOptix</td><td>GB / MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador digital</td><td>Sistemas médicos Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>Composições de Soluções Experimentais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solução de Isolamento (pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentração (mmol) 135</td></tr><tr><td>Concentração KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>(mmol) 5.4</td></tr><tr><td>Concentração HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>(mmol) 5</td></tr><tr><td>Concentração de</td><td>glicose</td><td>Sigma G8270</td><td>(mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentração (mmol) 3.5</td></tr><tr>Concentração <td>de CB2742654</td><td>Sigma</td><td>taurina (mmol) 20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentração (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Solução de armazenamento (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentração (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentração (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentração (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentração (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 0,2</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentração (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentração (mmol) 5</td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentração (mmol) 5</td></tr><tr><td></td><td>Taurina Sigma</td><td>Concentração CB2742654</td><td>(mmol) 20</td></tr><tr><td>Solução de perfusão (solução de tirodo, pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentração (mmol) 141,4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentração (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentração (mmol) 0,33</td></tr><tr><td>Concentração HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>(mmol) 10</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Concentração Sigma</td><td>G8270</td><td>(mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>Concentração C2002</td><td>(mmol) 1.8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Para o carregamento Fura 2AM, as concentrações de CaCl2 são 0,25 mM e 0,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentração (mmol) 1</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentração (mmol) 14,5</td></tr><tr><td>Solução de Collangenase 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de Isolamento (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina Fetal Bovina (solução BSA 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentração (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>de colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentração (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>de protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentração (mmol) 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Solução de colangenase 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de isolamento ( 20mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina Fetal Bovina (solução BSA 3,3 mL)</td><td></td><td></td> <td>Concentração (mmol) 1,67 mg / mL</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentração (mmol) 1 mg / mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td><td></td>BSA</tr><tr><td>Solução de Isolamento ( 40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina Fetal</td><td>Bovina Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentração (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

avaliação de miofilamentos ca<sup&gt; 2+</sup&gt; sensibilidade subjacente cardiac excitação-contração acoplamento

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca 2+ sensibilidade afetam Ca 2+ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis ​​pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis ​​e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na +, Ca 2+ e os canais de K + e Na + -Ca 2+) e proteínas de permutador de Ca 2+ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca 2 + -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca 2+ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca 2+ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível de Ca2 + intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca 2+ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação de Ca2 +, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis ​​e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.

miócitos do VE são isolados de corações normais e hipertensos ratos. Miócitos em forma de haste com estrias claras (representando sarcómeros) e contracções estáveis ​​em resposta à estimulação do campo são considerados os miócitos óptimos e são seleccionados para gravações (Figura 2A). No exemplo mostrado na F igura 2A, uma Fura 02:00 -loaded miócitos está posicionado horizontalmente e a abertura da câmara é ajustado de modo que o miócito ocupa a maior p...

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca2+ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca2+ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade ao cálcio dos miofilamentos, a fim de aprimorar nossa compreensão dos mecanismos que sustentam a contração em corações saudáveis e doentes. Este método pode ajudar a responder perguntas relacionadas à congestão cardíaca e insuficiência cardíaca. A principal vantagem desta técnica é que, juntamente com canais iônicos, transportadores iônicos e o manejo intercelular de cálcio, ela fornece uma compreensão abrangente do mecanismo que sustenta a contratilidade do coração de camundongo em condições saudáveis e em doenças cardíacas.Para iniciar este procedimento, aqueça dois banhos-maria a 37 graus Celsius. Adicione cinco mililitros de solução de BSA livre de cálcio a 25 mililitros de solução de colagenase um e 3,3 mililitros de solução de BSA livre de cálcio a 16,7 mililitros de solução de colagenase dois. Em seguida, adicione 100 mililitros de solução de isolamento à coluna um e 30 mililitros de solução de colagenase um à coluna dois no sistema de perfusão Langendorff.Oxigene a solução de isolamento e a solução de colagenase na coluna um e na coluna dois, respectivamente, por meio do tubo de conexão de oxigênio no sistema de

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em...

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

Músculo papilar do ventrículo esquerdo de murino pode ser usado para investigar in vitro a contractilidade cardíaca. Este artigo descreve em detalhes o isolamento e protocolos experimentais para estudar características contráteis cardíacas.

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Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Este protocolo visa descrever passo a passo a técnica de extração e avaliação da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados. Esta metodologia permite a medição e a sintomadulação aguda da função de miofilament usando pequenas biópsias congeladas que podem ser coletadas de diferentes locais cardíacos, de camundongos a homens.

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Apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos eletromecânicos da ativação do GtACR1 em cardiomiócitos de coelho. Fornecemos informações detalhadas sobre isolamento celular, cultivo e transdução adenoviral, e sobre experimentos funcionais com as técnicas de patch-clamp e fibra de carbono.

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Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.

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Medida da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Primários Humanos Isolados

Aprenda a avaliar a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+ em cardiomiócitos isolados de ratos usando Fura-2 AM e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar o acoplamento excitação-contração em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca

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