Name: Avaliação de miofilamentos Ca 2+ Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a avaliar a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+ em cardiomiócitos isolados de ratos usando Fura-2 AM e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar o acoplamento excitação-contração em corações saudáveis e doentes.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2013068067); pelo Programa de Pós-Graduação Cérebro Korea 21 do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia, Hospital da Universidade Nacional de Seul, a sociedade coreana de Hipertensão (2013), SK Fund Research Telecom coreano (no. 3420130290) e da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 31460265; 81260035 NSFC).

O protocolo está de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais da ONU de Saúde (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996). Foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Seul (aprovação IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Tampão de Preparação (Materiais de mesa e equipamentos) <ol><li> Preparar 300 ml de solução de isolamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glicose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 com NaOH). </li><li> Preparação de 100 ml de solução de armazenamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO4 5; CaCl2 0,2; de sódio e piruvato 5; glucose 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 com NaOH). </li><li> Prepare 1 litro de solução de perfusão (em mM: NaCl, 141,4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MGCL 2, 1; HEPES, 10; glicose, 5,5; CaCl2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 com NaOH). </li><li> Preparar 30 ml de uma solução de colagenase, adicionando colagenase (1 mg / ml), a protease (0,1 mg / ml), albumina de soro bovino (BSA, 1.67mg / ml), e Ca2 + (0,05 mM) a 25 ml de isolamento solução. </li><li> Preparar 20 ml de solução de colagenase 2 por adição de colagenase (1 mg / mL), BSA (1,67 mg / ml), e Ca2 + (0,05 mM) a 16,7 ml de solução de isolamento. </li><li> Preparar 40 ml de solução de BSA através da adição de 0,4 g de BSA a 40 ml de solução de isolamento. Separado 10 ml e 30 ml em duas provetas. Adicionar Ca 2+ a 30 ml de solução de BSA de modo que a concentração final de Ca2 + em solução de BSA a 1 mm. </li></ol> 2. Preparação para o isolamento de Left ventricular (LV) miócitos <ol><li> Transferir 8-12, ratos semanas de idade do sexo masculino Sprague-Dawley (SD) em gaiolas de transporte não poluentes do biotério para a sala de preparação e isolamento. </li><li> Hcomer dois banhos de água a 37 o C. Nota: Utilize banho de uma água para a água - reservatório encamisado e os tubos de perfusão do sistema de perfusão Langendorff. Use outro banho de água para agitar troncos de tecido do miocárdio, a fim de separar os miócitos individuais. </li><li> Adicionar 5 ml e 3,3 ml de solução de BSA (sem Ca2 +) para 25 ml de solução de colagenase 1 e 16,7 ml de solução de colagenase 2 para perfazer o volume para 30 ml e 20 ml, respectivamente. </li><li> Adicionar solução de isolamento (100 ml) e solução de colagenase 1 (30 ml) a uma coluna (Cl 1) e a coluna 2 (Cl 2) no sistema de perfusão de Langendorff, respectivamente (Figura 1A). </li><li> Oxigenar a solução de isolamento e uma solução de colagenase em Cl 1 e Cl 2 através do tubo de ligação de oxigénio no sistema de perfusão de Langendorff (Figura 1A). Da mesma forma, a solução de colagenase oxigenado 2 e a solução de BSA no banho de água com agitação, com 100% de O2 através datubo de ligação de oxigênio. </li></ol> 3. Isolamento de LV miócitos <ol><li> Anestesiar uma ratazana SD por meio de injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) e confirmar o estado anestésico por dedo do pé que comprime e falta de retirada reflexão. </li><li> Mova o rato para uma bandeja de dissecação. Na posição supina, fixe as quatro pernas para os lados do corpo com fita. </li><li> Aplicar incisões mid-axiais com tesouras cirúrgicas torácicas para abrir a caixa, garantindo a não danificar o coração. Use um outro par de tesouras limpas para dissecar o coração dos vasos comunicantes (por exemplo, superior e inferior da veia cava, vasos pulmonares e aorta) e membrana de pericárdio 13. </li><li> Deixar uma porção da aorta de um comprimento suficiente (5-8 mm), prender a aorta, com uma pinça fina e montar rapidamente a cânula do sistema de perfusão de Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Amarre fio de sutura 4/0 firmemente sobre a aorta. </li><li&gt; Ligar a válvula em Col. 1 e perfundir o coração isolado com uma solução de isolamento pré-aquecido e oxigenado durante 10 min (taxa de perfusão: 12-14 mL / min). Desligue a válvula na Col. 1, acender a válvula na Col. 2 e perfundir o coração com solução de colagenase 1 para 8-10 min. </li><li> Desmontar o coração digerido por corte da aorta e transferi-lo, mantendo a aorta com uma pinça para o balão contendo uma solução de isolamento fresco (Figura 1bi). Use uma tesoura fina e pinças para cortar a maior parte de parede livre do VE (incluindo o septo) em pedaços menores (~ 22 mm, Figura 1Bii). </li><li> Transferir os pedaços para um frasco contendo uma solução de colagenase fresco pré-aquecido e oxigenado 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Manter a entrega de oxigênio para a solução de colagenase contendo miócitos 2. </li><li> Mova o miócitos - suspensão para um tubo de 10 ml de centrífuga usando conta-gotas com um bulbo de sucção e adicionar Ca 2+ - contendo solução de BSA (1: 1 em volume). Centrifugar a 30 g durante 2 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de miócitos em 5 ml de solução de BSA. Centrífuga e descartar o sobrenadante. </li><li> Dispersar os peletes de miócitos e manter miócitos em 10 ml de solução de armazenamento de pré-oxigenado à TA (Figura 1Biv-VI). </li><li> Repita os passos processuais (3,7-3,9) com o tecido do LV restante no frasco. Nota: Manter repetindo os procedimentos (passos 3,7-3,9) novamente até que a maior parte do tecido do LV desaparece para se obter um bom rendimento de miócitos. </li><li> Manter os miócitos em solução de armazenamento para 6-8 horas a temperatura ambiente, até ao fim das experiências. </li></ol> 4. As medições simultâneas de Ca2 + intracelular Transitórios e miócitos Contração <ol><li> miócitos carga LV com o éster de acetoximetilo de Fura-2 AM (2 | iM). Nota: Execute todos os procedimentos de carga e experiências com miócitos carregados em um tubo escuro (Figura 1Bvii). <ol><li> Centrifuge a suspensão de miócitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Descartar o sobrenadante e re-suspender o pellet de miócitos em 1 ml de solução de Tyrode com uma baixa concentração de Ca2 + (250? M, Materiais de mesa e equipamentos). </li><li> Adicionar Fura-02:00 e poloxamer 407 (2 mL), suavemente dispersar a suspensão de miócitos, e manter a mistura temperatura ambiente (20-24 ° C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii). </li><li> Centrífuga-se a mistura durante 5 seg, descartar o sobrenadante e dispersar o sedimento de miócitos em 1 ml de solução de perfusão contendo 500 uM de Ca 2+. Depois de 10 minutos, centrifugar a mistura durante 5 seg e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar solução de perfusão fresco (500 | iM de Ca2 +, 1 ml) e manter o Fura-02:00 - sedimento miócito carregado nesta solução de gravação. </li></ol></li><li> A medição da contracção dos miócitos e Ca2 + intracelular <ol><li> Antes de gravar, encher o tubo de perfusão que é executado através de umacamisa de água com a solução de Tyrode, que é pré-aquecido a 36 o C. </li><li> Coloque algumas gotas do Fura 02:00 - carregado suspensão de miócitos LV na câmara de um microscópio de fluorescência invertido para 5-8 min. Lentamente perfundir a solução de Tyrode (2,2 ml / min). </li><li> Pressione o botão &quot;start&quot; no painel frontal do estimulador digital para iniciar a estimulação de campo (2 Hz). Nota: A tensão de saída (10 V, 5 mseg de duração) é aplicado aos miócitos na câmara por meio de fios de platina posicionados em ambos os lados da câmara. <ol><li> Seleccione miócitos que se contraem de forma estável (não aqueles que apresentam hiper ou hipo-contração) para a gravação. </li></ol></li><li> Ajuste do miócito de escolha na posição horizontal do sistema de detecção à base de sarcómero vídeo e ajustar a focagem do microscópio, para obter imagens óptimas de sarcómeros. Posicionar a caixa retangular roxo na área em que sarcômeros claras são claramente observados até a médiade comprimentos de sarcômero (pico vermelho) mostra um pico singular afiada (Figura 2A, imagem inferior). </li><li> Gravar as mudanças de comprimento do sarcómero em resposta à estimulação do campo (Figura 2A e B). Nota: Use os miócitos carregados dentro de 1 - 2 horas. </li><li> Ajustar a abertura da câmara de modo a que o campo no sistema de detecção à base de sarcómero vídeo é o tamanho do miócito (Figura 2A). Estimular a miócitos com excitação a 360 nm / 380 nm e emissão a 510 nm (freqüência de aquisição de 1.000 Hz). Encurtamento do sarcômero Record e a relação Fura2 AM com estimulação de campo (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 5. Avaliação de miofilamentos Ca2 + Sensibilidade <ol><li> Calcular a média dos comprimentos de sarcômero e Ca 2 + transientes no estado estacionário (10 - 20 traços) e traçar o ciclo do plano de fase da relação de Fura-2 vs. comprimento do sarcômero do mesmo miócitos (ambos com valor medidos e delta mudanças; Figura 2c). </li><li> Em cada parcela, definir rácio Fura -2 a 50% de relaxamento (EC50, Figura 2C). Compare tanto o loop e EC 50 de cada intervenção. </li></ol>

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<li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li>
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<li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM%2C+DCM+AND+RCM%3A+what+can+we+learn+about+thin+filament+function%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li>
<li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li>
<li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li>
<li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li>
<li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares de Ca2 + transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionais que medem a contr...

Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração 1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na +, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de Ca2 + (LTCCs) e influxo de Ca2 + através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação de Ca2 + através dos receptores de rianodina (RyRs), aumentando a concentração citosólica de Ca2 + a partir do nanomolar (nM ) a micromolar nível (^ M). Um tal aumento no Ca 2+ citosólica de Ca2 + promove a ligação à troponina C (TNC) em filamentos finos e induz alterações conformacionais do complexo filamento para facilitar a interacção actina-miosina e alcança myocardial contração 3. Por outro lado, o Ca2 + citosólico é re-captado volta para o retículo sarcoplasmático (RS) através da Ca2 + -ATPase em SR (SERCA2a) ou é extrudada para fora do miócito através do Na + / Ca2 + e o permutador de plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Consequentemente, o declínio no Ca 2+ citosólico instiga mudanças conformacionais de filamentos finos de volta ao estado original, resultando na dissociação da actina-miosina e miócitos relaxamento 1-3. Neste esquema, a actividade da SERCA2a é geralmente considerada para determinar a velocidade de relaxamento do miocárdio porque é responsável por 70 - 90% de remoção citosólica de Ca2 + na maioria das células de mamífero do coração 1. Como tal, anormal manipulação de Ca 2+ por LTCC, RyR e SERCA2a, etc. tem sido considerado os mecanismos principais para comprometimento da contratilidade e relaxamento no coração doente 1-4. de Ca2 +, que funciona como o mensageiro em contas de acoplamento CE para cerca de 1% do total de Ca 2+ e a maioria dos Ca 2+ é obrigado a intracelulares de Ca2 + buffers 5,6. Isto é devido ao facto de vários tampões Ca 2+ são abundantes em miócitos cardíacos, por exemplo, fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, a calmodulina, a parvalbumina, miofibrila TnC, miosina, SERCA2a, e calsequestrin no SR. 5,6,7. Entre eles, SERCA2a e TnC são as predominantes Ca 2+ buffers 5,6,7. Além disso, o Ca 2+ ligação aos seus tampões é um processo dinâmico durante tique (por exemplo, 30-50% de Ca 2+ se liga a TnC e dissociam-se que durante os transientes de Ca2 + 7) e a alteração no Ca 2+ causa adicional de ligação &quot;libertação&quot; de Ca2 + livre para o citosol, os resultados nas alterações do Ca2 + intracelular concentration. Consequentemente, a perturbação do nível intracelular de Ca 2+ induz movimentos miofilamentos anormais, que são os precursores da disfunção contráctil e arritmias 8,9. Muitos factores (tanto fisiológicos e patológicos) podem ser as fontes de modificações pós-transcricionais de proteínas miofilamentos, que influenciam miofilamentos Ca 2+ e de tamponamento miofilamentos Ca 2+ sensibilidade 8-10. Recentemente, foi relatado que mutações em proteínas miofilamentos aumentar o Ca2 + intracelular e a afinidade de ligação a manipulação de Ca2 +, desencadeando a potenciação dependente de pausa de transientes de Ca2 +, Ca2 +, libertação anormal e arritmias 8. De acordo com este conceito, mostrámos também que miofilamentos Ca 2+ dessensibilização em corações de ratos hipertensos secundárias à sobre-regulação da sintase do óxido nítrico neuronal está associada com elevada diastólica e sistólica Ca 2+ níveis11, que por sua vez, aumenta a vulnerabilidade do LTCC ao Ca2 + inactivação dependente 12. Assim, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é um regulador &quot;ativo&quot; da função contrátil intracelular de Ca2 + homeostase e miócitos. Tornou-se necessário analisar as interacções entre miofilamentos e Ca 2+ manipulação proteínas para investigação aprofundada sobre miócitos acoplamento CE e função cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo que avalia as mudanças de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade em miócitos cardíacos isolados. Análise abrangente do intracelular perfil Ca 2+, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade e contração vai descobrir novos mecanismos mecânicos do miocárdio subjacentes.

<table><tbody><tr><td>Rato Sprague Dawley</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 semanas</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sódico</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Coréia)</td> <td>AHN901</td><td>Código de seguro: 645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td> <td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Fetal Bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td> <td>Sondas Moleculares</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 Solução a 20% em DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria agitado</td><td>Chang Shin Modelo científico</td><td>: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Construtor experimental</td><td>Aquisição e análise de dados de acoplamento EC em miócitos</td></tr><tr><td>miócitos cálcio e Sistema de Registro de Contratilidade</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria Circulante</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência de Miócitos</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência & Detecção de vídeo</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência e Interface do sistema</td> Fonte de luz de excitação <td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada ARC de alta intensidade Fonte de alimentação</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter controlador de roda</td><td>IonOptix</td><td>GB / MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador digital</td><td>Sistemas médicos Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>Composições de Soluções Experimentais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solução de Isolamento (pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentração (mmol) 135</td></tr><tr><td>Concentração KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>(mmol) 5.4</td></tr><tr><td>Concentração HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>(mmol) 5</td></tr><tr><td>Concentração de</td><td>glicose</td><td>Sigma G8270</td><td>(mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentração (mmol) 3.5</td></tr><tr>Concentração <td>de CB2742654</td><td>Sigma</td><td>taurina (mmol) 20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentração (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Solução de armazenamento (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentração (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentração (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentração (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentração (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 0,2</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentração (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentração (mmol) 5</td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentração (mmol) 5</td></tr><tr><td></td><td>Taurina Sigma</td><td>Concentração CB2742654</td><td>(mmol) 20</td></tr><tr><td>Solução de perfusão (solução de tirodo, pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentração (mmol) 141,4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentração (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentração (mmol) 0,33</td></tr><tr><td>Concentração HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>(mmol) 10</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Concentração Sigma</td><td>G8270</td><td>(mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>Concentração C2002</td><td>(mmol) 1.8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Para o carregamento Fura 2AM, as concentrações de CaCl2 são 0,25 mM e 0,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentração (mmol) 1</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentração (mmol) 14,5</td></tr><tr><td>Solução de Collangenase 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de Isolamento (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina Fetal Bovina (solução BSA 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentração (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>de colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentração (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>de protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentração (mmol) 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Solução de colangenase 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de isolamento ( 20mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina Fetal Bovina (solução BSA 3,3 mL)</td><td></td><td></td> <td>Concentração (mmol) 1,67 mg / mL</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentração (mmol) 1 mg / mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td><td></td>BSA</tr><tr><td>Solução de Isolamento ( 40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina Fetal</td><td>Bovina Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentração (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentração (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

avaliação de miofilamentos ca<sup&gt; 2+</sup&gt; sensibilidade subjacente cardiac excitação-contração acoplamento

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca 2+ sensibilidade afetam Ca 2+ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis ​​pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis ​​e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na +, Ca 2+ e os canais de K + e Na + -Ca 2+) e proteínas de permutador de Ca 2+ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca 2 + -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca 2+ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca 2+ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível de Ca2 + intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca 2+ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação de Ca2 +, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis ​​e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.

miócitos do VE são isolados de corações normais e hipertensos ratos. Miócitos em forma de haste com estrias claras (representando sarcómeros) e contracções estáveis ​​em resposta à estimulação do campo são considerados os miócitos óptimos e são seleccionados para gravações (Figura 2A). No exemplo mostrado na F igura 2A, uma Fura 02:00 -loaded miócitos está posicionado horizontalmente e a abertura da câmara é ajustado de modo que o miócito ocupa a maior p...

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca2+ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca2+ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade ao cálcio dos miofilamentos, a fim de aprimorar nossa compreensão dos mecanismos que sustentam a contração em corações saudáveis e doentes. Este método pode ajudar a responder perguntas relacionadas à congestão cardíaca e insuficiência cardíaca. A principal vantagem desta técnica é que, juntamente com canais iônicos, transportadores iônicos e o manejo intercelular de cálcio, ela fornece uma compreensão abrangente do mecanismo que sustenta a contratilidade do coração de camundongo em condições saudáveis e em doenças cardíacas.Para iniciar este procedimento, aqueça dois banhos-maria a 37 graus Celsius. Adicione cinco mililitros de solução de BSA livre de cálcio a 25 mililitros de solução de colagenase um e 3,3 mililitros de solução de BSA livre de cálcio a 16,7 mililitros de solução de colagenase dois. Em seguida, adicione 100 mililitros de solução de isolamento à coluna um e 30 mililitros de solução de colagenase um à coluna dois no sistema de perfusão Langendorff.Oxigene a solução de isolamento e a solução de colagenase na coluna um e na coluna dois, respectivamente, por meio do tubo de conexão de oxigênio no sistema de perfusão Langendorff. Da mesma forma, oxigene a solução de colagenase dois e a solução de BSA no banho-maria agitador com 100% de oxigênio por meio do tubo de conexão de oxigênio. Nesta etapa, após anestesiar um rato SD por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico, confirme o estado anestésico por meio da compressão dos dedos dos pés e da ausência do reflexo de retirada.Em seguida, transfira a rata para uma bandeja de dissecação. Na posição supina, prenda as quatro patas nas laterais do corpo com fita adesiva. Depois, prenda a aorta com pinça fina e imediatamente acople a cânula do sistema de perfusão Langendorff.Depois disso, amarre firmemente o fio de sutura sobre a aorta. Ligue a válvula da coluna um e perfunda o coração isolado com solução de isolamento pré-aquecida e oxigenada por 10 minutos. Posteriormente, ligue a válvula da coluna dois e perfunda o coração com a solução de colagenase um por oito a 10 minutos.Em seguida, remova o coração digerido cortando a aorta e transfira-o para o frasco contendo solução de isolamento fresca. Usando tesoura fina e pinça, corte a maior parte da parede livre do VE, incluindo o septo, em pedaços menores. Em seguida, transfira os tecidos para um frasco contendo solução fresca de colagenase dois, pré-aquecida e oxigenada.Em seguida, agite-os por 10 minutos e mantenha a solução de colagenase contendo miócitos oxigenada. Posteriormente, transfira a suspensão de miócitos para um tubo de centrífuga de 10 mililitros e adicione a solução de BSA contendo cálcio. Centrifugue por dois minutos.Após dois minutos, descarte o sobrenatante e re-suspenda o pellet de miócitos em cinco mililitros de solução de BSA. Em seguida, centrifugue e descarte novamente o sobrenatante. A seguir, disperse o pellet de miócitos e mantenha os miócitos em 10 mililitros de solução de armazenamento pré-oxigenada à temperatura ambiente até o final do experimento.Agora, carregue os miócitos LV com dois micromoles por litro de acetoximetil éster de Fura-2AM. Centrifugue um mililitro da suspensão de miócitos durante 10 segundos. Em seguida, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet de miócitos em um mililitro de solução de Tyrode com baixa concentração de cálcio.Posteriormente, adicione Fura-2AM e dois microlitros de poloxâmero 407 aos miócitos. Disperse suavemente a suspensão de miócitos e mantenha a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, centrifugue a mistura por cinco segundos.Descarte o sobrenadante e disperse o pellet de miócitos em um mililitro de solução de perfusão contendo cálcio 500 micromolar. Após 10 minutos, centrifugue a mistura por cinco segundos e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione solução de perfusão fresca e mantenha o pellet de miócitos carregado com Fura-2AM nesta solução para as gravações.Antes da gravação, preencha o tubo de perfusão que passa por uma jaqueta d'água com a solução de Tyrode a 36 graus Celsius. Em seguida, coloque algumas gotas da suspensão de miócitos ventriculares esquerdos carregados com Fura-2AM na câmara de um microscópio de fluorescência invertido e aguarde de cinco a oito minutos. Perfuse lentamente com a solução de Tyrode a 2,2 mililitros por minuto.Em seguida, pressione o botão de início no painel frontal do estimulador digital para iniciar a estimulação de campo a dois hertz. Selecione os miócitos que contraem de forma estável para o registro. Aqui são mostrados os traçados brutos do encurtamento do sarcômero e da medida da razão Fura-2 em miócitos do VE de ratos submetidos a procedimento simulado e ratos hipertensos.Aqui estão os traços médios do comprimento do sarcômero e dos sinais de Fura-2. E aqui estão os gráficos de plano de fase da razão de Fura-2 versus comprimento do sarcômero nos dois grupos. O laço da trajetória é deslocado para a direita e o EC50 tende a ser maior na hipertensão, sugerindo dessensibilização ao cálcio dos miofilamentos.Antes de realizar este procedimento, é importante lembrar-se de testar o córtex, os miócitos isolados, detectando a contração dos miócitos sem a carga de Fura-2AM. Além disso, verifique sempre a contração dos miócitos após a carga com Fura-2AM para evitar sobrecarga. Após este procedimento, outros métodos, como técnicas de patch clamp, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.Por exemplo, um tipo de atividade do canal Ca, ou seja, no verbo, o acoplamento excitação-contração do miócito. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no futuro da fisiologia cardíaca explorarem novos conhecimentos sobre doenças cardíacas em humanos. Após experiência rotineira, você deverá ter um bom entendimento de como analisar a atividade do canal de cálcio dos miofilamentos.Para compreender melhor os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaco em corações saudáveis e doentes.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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