Rápida Verificação de Exterminadores Usando o PGR Azul plasmídeo e Montagem Golden Gate

O objetivo geral do protocolo de biologia sintética é determinar rapidamente a funcionalidade do terminador e quantificar a força do terminador em um sistema in vitro que utiliza a montagem do Golden Gate. Este protocolo é usado para testar terminadores que encontramos in silico usando bioinformática e testá-los em um ambiente biológico. Isso permite a confirmação rápida e simples de terminadores identificados bioinformaticamente em um ambiente de bancada de laboratório.

A principal vantagem deste protocolo é sua velocidade. Podemos passar da identificação bioinformática à confirmação biológica em menos de uma semana. E, ao fazer isso, também podemos verificar se um terminador é de fato um terminador e podemos quantificar sua força de terminação.

Geralmente, os indivíduos inicialmente lutam com essa técnica, porque parece contra-intuitivo adicionar a enzima de restrição com uma ligase no mesmo tubo. No entanto, usamos endonucleases de restrição tipo 2S e o local de reconhecimento da enzima é separado do local de corte real. Uma vez que o terminador é ligado ao plasmídeo azul pGR, esta é uma ligação permanente.

No entanto, por ter a enzima de restrição e a ligase no mesmo tubo, passando por vários ciclos, podemos obter uma alta eficiência de fechamento. Comece este procedimento ressuspendendo os oligonucleotídeos individuais em água livre de nuclease a uma concentração de 100 micromolares e, em seguida, prepare o tampão de recozimento 10x. Em seguida, rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada terminador a ser testado.

Para cada tubo, adicione 16 microlitros de água ultrapura, 2 microlitros de tampão de recozimento 10x e 1 microlitro de cada um dos oligonuclotes de fita superior e inferior dos terminadores desejados. É muito importante certificar-se de que os oligonuclotídeos que você encomendou tenham as extremidades pegajosas corretas. Porque uma vez que eles são recozidos juntos, é importante garantir que o terminador esteja na orientação correta.

Se o terminador estiver na orientação errada, o pGR blue não será capaz de verificar se é um terminador em funcionamento. Em seguida, coloque os tubos de microcentrífuga em uma bóia e ferva-os por quatro minutos em banho-maria. Após quatro minutos, desligue a placa de aquecimento, mas deixe o tubo na água durante a noite para esfriar lentamente.

Armazene os terminadores recozidos a 20 graus Celsius. Para fazer uma diluição de 40 nanomolares dos terminadores recozidos, primeiro descongele-os no gelo e, em seguida, em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, adicione 124 microlitros de água livre de nuclease a 1 microlitro dos terminadores recozidos. Centrifugue as amostras por 30 segundos a 10.000x g.

Após a centrifugação, armazene as amostras no gelo. Em um novo tubo apropriado para termociclador, adicione 6 microlitros de água livre de nuclease. Em seguida, adicione um microlitro de tampão DNA ligase comercial.

Execute todas as etapas subsequentes no gelo. Em seguida, adicione 1 microlitro contendo 35 a 50 nanogramas por microlitro do plasmídeo de destino azul pGR, 1 microlitro dos terminadores recozidos de 40 nanomolares, 0,5 microlitros de endonuclease de restrição BSA1 comercial de alta fidelidade e 0,5 microlitros de DNA ligase comercial. Centrifugue a mistura de reação a 10.000x g por 120 segundos.

Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador e execute o seguinte programa. 20 ciclos de 1 minuto a 37 graus Celsius, seguidos de 1 minuto a 16 graus Celsius e depois um ciclo de 15 minutos a 37 graus Celsius. Após a execução, congele e armazene as amostras a 20 graus Celsius ou prossiga imediatamente para a transformação.

Transformar as reações de ligação em células de E. coli quimicamente competentes, utilizando qualquer protocolo de transformação adequado. Aqui, as células JM109 são transformadas usando a transformação zippy.

Usando um taco de hóquei de vidro em forma de L, espalhe 25 microlitros das células transformadas em placas de ágar LB pré-aquecidas contendo 1 ampicilina milimolar e 10 arabinose milimolar. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Não os incube por mais de 24 horas.

A ampicilina se degrada rapidamente. No dia seguinte, inspecione a cor das colônias. Uma ligadura bem-sucedida deve ser branca ou amarela na luz visível e fluorescente em verde sob luz azul ou UV.

Uma ligação malsucedida produzirá uma colônia de cor azul sob luz visível. Para cada um dos terminadores e controles, prepare um tubo de ensaio contendo 5 mililitros de caldo LB estéril com 1 ampicilina milimolar e arabinose 10 milimolar. Ao executar este protocolo, com o pGR é muito importante garantir que os controles adequados estejam em vigor.

O primeiro controle deve ser apenas o caldo LB. O próximo controle deve ser células que têm resistência à ampicilina, mas não fluorescem sob luz azul. Estes servirão como um espaço em branco.

O próximo controle é um plasmídeo pGR que não é cortado, portanto, não tem terminador no lugar e isso servirá como linha de base para a força do terminador e o último de seus tubos será para sua amostra. Sob luz visível, use um laço estéril para escolher 2 a 3 colônias brancas ou amarelas e transfira-as para o caldo LB. Deixar incubar as amostras num agitador a 37 graus Celsius a 160 rpm durante 16 a 18 horas.

No dia seguinte, use um espectrofotômetro para determinar a densidade celular óptica de cada amostra em 600 nanômetros. Geralmente, após esse período de tempo, espera-se um OD 600 de 0,8 a 1,0. Coloque uma placa estéril de 96 poços no capô.

Para cada amostra ou controle, prepare 3 poços com 199 microlitros de caldo LB estéril com ampicilina e arabinose. Em seguida, pipete 1 microlitro da solução celular dos caldos noturnos em poços individuais da placa de 96 poços. Encha as placas com uma capa respirável e agite-as por 18 a 20 horas a 37 graus Celsius e 160 rpm.

No dia seguinte, use um leitor de placas para determinar o OD 600, que deve ser de aproximadamente 0,5. Além disso, meça o G de fluorescência de P em um comprimento de onda de excitação de 395 nanômetros e na emissão de 509 nanômetros. Meça a fluorescência RFP em um comprimento de onda de excitação de 575 nanômetros e emissão de 605 nanômetros.

Usando o Excel, normalize a variação no crescimento dividindo a florescência pelo OD 600. Após a normalização, determine a força relativa do terminador tomando a fluorescência do terminador GFP sobre a fluorescência de controle GFP e dividindo-a pela fluorescência do terminador RFP sobre a fluorescência de controle RFP. Os terminadores putativos T1 a 6 bioinformaticamente identificados na microbactéria fago bernal 13 foram analisados conforme descrito neste vídeo.

Esses resultados mostram fluorescência relativa. Todos os resultados foram normalizados usando células contendo PGR não cortado e não modificado como controle. T3 foi considerado um terminador forte.

Todos os resultados representam colônias individuais cultivadas em triplicata e calculadas em média para representação visual. As barras de erro representam desvios entre os pontos de dados médios. Para determinar o melhor controle de referência para quantificar a força do terminador, foram comparados os dados brutos usando o plasmídeo pGR original sem terminador e o azul de pGR clonado com uma sequência conhecida por não ser um terminador.

Como pode ser visto aqui, ambos os controles mostraram níveis semelhantes de expressão de GFP e RFP e, mais importante, produziram taxas semelhantes de GFP para RFP. Todos esses resultados representam colônias individuais que foram cultivadas em triplicata e calculadas em média para representação visual. Uma vez dominada, essa técnica pode levar apenas 72 horas, incluindo o tempo de envio e pedido.

É importante notar que o azul pGR só funciona em e.coli. Além disso, como estamos olhando apenas para um pequeno pedaço do terminador, realmente não temos ideia de outros elementos regulatórios que podem controlar a transcrição. Para verificar os resultados obtidos com este protocolo usando pGR azul, métodos adicionais podem ser usados como PCR quantitativo.

Além disso, o inserto pGR pode ser cortado e ligado em um plasmídeo de sua escolha.