Name: Rápida Verificação de Exterminadores Usando o PGR Azul plasmídeo e Montagem Golden Gate (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a quantificar a força de terminadores usando montagem Golden Gate e o plasmídeo pGR Azul. Este método rápido permite validar em menos de uma semana sequências identificadas in silico.

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Autores gostariam de reconhecer Malcom Campbell e Todd Eckdahl com o Consórcio do Genoma para o Active Ensino (GCAT) e da Educação Alliance HHMI-Science - programa Caçadores de fagos Avançando Genómica e Ciência Evolutiva (SEA-fagos). Este projecto foi apoiado por doações do Centro Nacional de Investigação Recursos (P20RR016460) e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (P20GM103429) do National Institutes of Health. Esta pesquisa foi apoiada em parte pela National Science Foundation, Grant # IIA-1.457.888. (Ouachita Baptist University) Os fundos Além disso institucionais foram fornecidos pela JD Patterson Verão Research Fellowship.

1. Projecção e Ordenação oligonucleótidos com as apropriadas pegajosas Termina <ol><li> Identificar potenciais terminadores independente de rho através da análise genômica usando programas que estão livremente disponíveis online 7. </li><li> Quando se trabalha com o ADN de cadeia dupla, determinar a orientação do terminador para ser testado. 7 O plasmídeo PGR-azul apenas verifica terminadores ligados na direcção 5 &#39;para 3&#39; na parte superior (vertente para a frente). <ol><li> Converter um fio terminator inferior (reverso) para o seu complemento revertida para reorientar a sequência de ensaios in PGR-azul usando software livre online, por exemplo, APE. </li></ol></li><li> Após a orientação é determinada para ser correta, adicionar a extremidade coesiva &quot;5&#39;- CGAC-3 &#39;&quot; para a extremidade 5&#39; da cadeia superior. Adicionar a extremidade coesiva &quot;5&#39;- CCGC-3 &#39;&quot; para a extremidade 5&#39; da cadeia inferior. 8 Isto irá assegurar que pastilha ligado irá ser inserido no adequadoorientação usando GGA. </li><li> Uma vez que as sequências são determinadas, pedir como oligonucleotídeos de cadeia simples comercialmente. </li></ol> 2. Annealing oligonucleotídeos (aplica apenas para liofilizadas DNA) <ol><li> Re-suspender oligonucleótidos individuais em água livre de nuclease, a uma concentração de 100 uM. </li><li> Adicione 10x tampão de emparelhamento: NaCl 1 M e Tris-HCl 100 mM pH 7,4. tampão de emparelhamento pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas. Uma vez que é feita de tampão de recozimento e os oligonucleótidos são re-suspensas, iniciar o recozimento 8. </li><li> Para cada terminador a ser testado, adicionar 16 ul de água ultra-pura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 2 l de 10x tampão de têmpera a cada tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 1 ml de topo oligonucleótido cadeia (100 um) a partir do terminador desejado. </li><li> Adicionar 1 ml de oligonucleótido inferior cadeia (100 um) a partir do terminador desejado. </li><li> Criar uma ebulição ba de águath utilizando um copo de 1000 ml contendo cerca de 400 ml de água da torneira e coloque em um prato quente. </li><li> Coloque os tubos de microcentrífuga a partir do passo 2.6 em uma bóia e deixe ferver por 4 min. Após 4 min, desligue o calor de placas, mas deixar o tubo e flutuar no banho de água para arrefecer lentamente O / N (18 hr) 8. Armazenar os terminadores recozido à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 3. Montagem Golden Gate (Mix Standard - Custo Eficiente) <ol><li> Fazer uma diluição de 40 nM dos terminadores recozidos. Adicionar 124 mL de água livre de nuclease para 1 ml de mistura terminadores recozido (100 M). <ol><li> Centrifugar as amostras durante 30 segundos a 10.000 xg e armazenar no gelo. </li></ol></li><li> Em uma nova adequada do tubo para o termociclador sendo usado, adicionar 6 mL de água livre de nuclease. </li><li> Adicionar 1 mL de tampão de ligase de ADN comercial [Tris-HCl 300 (pH 7,7-7,8), MgCl2 100 mM, DTT 100 mM e 10 mM de ATP]. Execute todas as etapas subsequentes no gelo. </li><li> Adicionar1 ul de PGR-Azul (35-50 ng / ul) do plasmídeo de destino para o tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 1 mL do 40 nm terminadores emparelhado com o tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 0,5 uL de endonuclease de restrição comercial de alta fidelidade BSAI ao tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 0,5 uL de ligase de ADN comercial para o tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a mistura reaccional a 10.000 xg, durante 120 segundos. Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador. </li><li> Executar o programa de termociclador: 20 ciclos de 1 min a 37 ° C, seguido de 1 min a 16 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 min a 37 ° C. Use amostras imediatamente ou congelar e armazenar a -20 ° C. 8 </li></ol> 4. Montagem Golden Gate (Comercial Mix Master - tempo eficiente) <ol><li> Adicionar 124 uL de água livre de nuclease e 1 uL de 100 uM terminadores criados no passo 2. Este dilui a concentração de ADN de 40 nM terminador recozidos.Execute esta etapa em uma nova, rotulados 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Em uma nova adequada do tubo para o termociclador, adicione 14 mL de água livre de nuclease. Verifique se o novo tubo é rotulado em conformidade. </li><li> Adicionar 2 mL de Commercial Mestre Mix Buffer para o tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 1 ml de PGR Azul plasmídeo (35-50 ng / ul) ao tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 2 mL da 40 nM terminadores emparelhado com o tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 1 ml de Commercial Master Mix ao tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifuga-se o tubo de 40 nm a 10000 xg durante 120 seg. Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador. </li><li> Executar o programa de termociclador: 1 ciclo de 60 min a 37 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 min a 55 ° C. Use amostras imediatamente ou congelar e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 5. Transformação e Selecção Colony <ol><li> Prepare Luria Base (LB) agar placas de Petri contendo concentrat 1 mMion de ampicilina (Amp) e uma concentração de 10 mM de arabinose (ARB). Preparar pelo menos 10 ml de uma solução M de L da -arabinose porque esta solução de reserva vai ser usado em passos posteriores. </li><li> Use qualquer alta eficiência (10 8 - 10 9 transformantes / mg) E. quimicamente competente coli (JM109), as células para a transformação. 9, para obter os melhores resultados, adicionar 3-5 uL da reacção de ligação a 50 ul de células competentes. Quando se utiliza células competentes químicos, seguir o protocolo de transformação específica para as células a ser usadas. </li><li> Espalhe metade (25 ul) das células transformadas em LB pré-aquecido (Amp / ARB) placas de agar utilizando uma forma de L &quot;stick de hóquei&quot; estéril e incubar O / N a 37 ° C. Devido à rápida taxa de ampicilina de decomposição, não se incubar a 37 ° C ao longo de 24 h. </li><li> Realizar a seleção de colónia com base na cor por inspeção visual. A ligadura de sucesso deve ser branco / amarelo na luz visível e fluorescência verde undeazul r (450 nm) ou luz UV. Uma ligação bem sucedida irá produzir uma colônia que é de cor azul sob luz visível após 18-20 horas. </li></ol> 6. Verificação e Quantificação de Terminator <ol><li> Prepare 5 ml estéreis tubos de caldo LB com ampicilina 1 mM e 10 mM de arabinose. O número de tubos necessário é dependente do número de terminais a ser testado, mais controlos (células com resistência à ampicilina que não apresentam fluorescência e as células contendo o plasmídeo PGR-azul não cortadas). </li><li> Sob a luz visível pegar 2-3 colónias branco / amarelo (passo 5.4) usando um loop estéril. Deixar as amostras a incubar em caldos num agitador a 37 ° C e 160 rpm durante 16-18 horas. Não incubar as amostras durante mais de 24 horas. <ol><li> Opcionalmente, utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade celular óptica a 600 nm (DO600) para garantir o crescimento celular adequado. Geralmente, uma DO 600 de 0,8-1,0 ~ é observada após 16-18 horas de crescimento. </li></ol></li><li> Usaruma placa de 96 poços estéreis para as etapas restantes. Realizar estas etapas num ambiente asséptico e em triplicado. Adicionar 199 ul de estéril LB + Amp caldo / arabinose (1 mM de ampicilina / arabinose a 10 mM) a cada poço. Incluir quarto na placa por três controles separados. <ol><li> Use os três controlos seguintes: somente um poço (1) contendo LB + Amp / arabinose caldo e um poço (2) para células competentes não transformadas (em branco) para servir como um espaço em branco. Para a quantificação (3) da força terminador, as células que contêm PGR originais sem cortes ou contendo PGR-azul ligado com uma sequência não-terminating deve ser incluído (controlo de referência para a quantificação). Veja a Figura 1 para o layout do leitor de placas. </li></ol></li><li> Pipetar 1 mL da solução de células a partir de O / N caldos em poços individuais da placa de 96 poços. </li><li> placas de vedação com uma cobertura respirável e agitar durante 18-20 horas a 37 ° C e 160 rpm. </li><li> Utilizando um leitor de placa, determinar pela leitura OD600absorvância a 600 nm. Medir a fluorescência de GFP, como se segue: 395 de excitação e emissão de fluorescência 509. Medida RFP como se segue: 575 de excitação e de emissão 605. Após 18-20 horas, o OD 600 deve ser de aproximadamente 0,5. </li><li> Para normalizar as variações em crescimento, a utilização da equação: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> tanto para GFP e RFP. </li><li> Após a normalização, determinar a força terminator relativa usando a equação <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais importante neste protocolo é design oligonucleotídeo adequada antes de pedir. Os oligonucleótidos devem ter as extremidades coesivas apropriadas para adicionado extremidades 5 &#39;da parte superior e inferior cadeias para assegurar que GGA incorporação é possível. Além disso, é importante para mudar a orientação da terminadores virada para a esquerda (terminadores que param de transcrição na cadeia inferior) ao do direito virado (termina a transcrição na parte superior fio) terminadores porque GFP e RFP ex...

Grandes projetos de biologia sintética exigem o uso de terminadores de transcrição altamente eficazes para ajudar a regular a expressão gênica. A identificação de novos terminadores requer análise bioinformática de novos genomas. No entanto, à medida que quantidades crescentes de software de bioinformática são desenvolvidas, cada uma com um algoritmo exclusivo utilizado para previsão, ocorre mais discrepância entre os resultados putativos. Como esse processo é um tanto subjetivo e é feito in silico, essas previsões precisam de confirmação biológica. 1 Além disso, o volume de terminadores putativos identificados por meio de análise in-silico requer o uso de estratégias de clonagem que podem ser concluídas em um período de tempo relativamente curto. 
O plasmídeo PGR-Blue é uma modificação do plasmídeo PGR que foi redesenhado para usar o Golden Gate Assembly (GGA) para simplificar o procedimento de clonagem, permitindo que todas as etapas da reação sejam executadas simultaneamente em um tubo de microcentrífuga. 2,3 A seleção de cores foi incorporada ao plasmídeo para aumentar a facilidade de identificação de colônias positivas. Uma ligadura bem-sucedida deve ser branca/amarela na luz visível e verde fluorescente sob luz azul (450 nm) ou ultravioleta (UV) quando cultivada em placas contendo arabinose. Como o pGR-blue não cortado contém uma cromoproteína azul (amilCP), as colônias contendo um plasmídeo não modificado são azuis sob luz visível. Essa simplificação, juntamente com o protocolo simplificado, permite que os pesquisadores prossigam da identificação bioinformática para a confirmação biológica em três a quatro dias. A natureza do design deste sistema pode ser benéfica tanto no laboratório de pesquisa quanto em ambientes educacionais.
O plasmídeo pGR-Blue permite a quantificação da força do terminador. 4 Um único promotor induzível por arabinose é usado para produzir proteína fluorescente verde (GFP) e proteína fluorescente vermelha (RFP). O terminador é clonado no plasmídeo após a sequência GFP, mas antes da sequência RFP, interrompendo assim a transcrição da proteína RFP. A resistência do terminador é determinada pela proporção de GFP produzida para RFP produzida. 
O relatório Vision and Change5 sugeriu que a educação em Ciência, Tecnologia, Engenharia e Matemática (STEM) incorpora experiências baseadas em pesquisa na sala de aula. 6 No entanto, isso requer o desenvolvimento de protocolos que podem ser feitos por alunos com conjuntos de habilidades limitados em um período de tempo definido. Embora o protocolo possa ser realizado em menos de três dias, ele também foi projetado para que cada etapa principal pudesse ser realizada em um período de laboratório semanal separado (2-3 horas) para criar uma Experiência de Pesquisa do Curso (CRE). Quando usado dessa maneira, o procedimento levará entre três e seis semanas e é apropriado para cursos introdutórios e avançados em Genética, Biologia Celular ou Bioinformática.

<table><tbody><tr><td>pGR-Blue Plasmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Folhas Estéreis)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Folhas Estéreis apenas</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>A enzima não-HF funcionará, mas é menos estável ao calor.&nbsp;</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix referido no protocolo.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga redonda Rack flutuante</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinose não induzirá o promotor pBAD</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Caldo, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Ágar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Leitor de Placas</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix & Go Competent Cells - Cepa JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Use o protocolo de transformação recomendado pela empresa</td></tr><tr><td>ApE: Um software editor de plasmídeo</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris-HCl, Cloreto</td> de Sódio <td>Promega</td><td>H5121</td><td></td>de Grau</tr><tr><td>Molecular (Cristalino/Biológico, Certificado)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologias integradas comerciais do ADN da síntese do oligonucleotide</td><td>(IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>placas da cultura de tecidos do microteste - 96 poço (estéril)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>micobacteriófago "Bernal13"</td> <td>Banco de genegramas</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>a água livre da nuclease</td><td>Tecnologias integradas do ADN (IDT)</td> <td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Estéril, L-dado forma Hockey-Stick Cell</td><td>Life Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: uma ferramenta web para a previsão de terminadores de transcrição independentes de Rho.</td><td></td><td></td><td></td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</tr></tbody></table>

rápida verificação de exterminadores usando o pgr azul plasmídeo e montagem golden gate

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

O objetivo deste protocolo é permitir a verificação rápida de terminadores identificados bioinformicamente. Além disso, o plasmídeo (pGR-Blue) é projetado especificamente para este protocolo e permite a quantificação da eficiência do terminador. Como prova de conceito, seis terminadores foram identificados bioinformaticamente no micobacteriófago Bernal13. Uma vez identificados, os terminadores foram feitos como oligonucleotídeos com as extremidades pegajosas apropriadas e recozidos juntos. Usando o Golden Gate Assembly (GGA), os terminadores foram então clonados em pGR-Blue. Sob luz visível, as colônias falsas positivas aparecem azuis e as colônias transformadas positivamente são brancas/amarelas. Após a indução de um promotor induzível por arabinose (pBad) com arabinose, a força da colônia pode ser determinada medindo a proporção de proteína fluorescente verde (GFP) produzida para proteína fluorescente vermelha (RFP) produzida. Com o pGR-Blue, o protocolo pode ser concluído em menos de três dias e é ideal em um ambiente educacional. Além disso, os resultados mostram que este protocolo é útil como um meio para entender as previsões in silico da eficiência do terminador relacionadas à regulação da transcrição.

Este protocolo irá produzir células que contêm PGR-azul com um terminador ligado entre GFP e RFP usando Golden Gate Assembly (Figura 2). As colónias positivas contendo inserção ligado pode ser seleccionado com base na cor. À luz visível colónias positivas será branco / amarelo e falsos positivos irá produzir colónias azuis após 18-20 horas de incubação a 37 ° C (Figura 3). Após selecção de col...

Este protocolo utiliza o Golden Gate Assembly e o plasmídeo pGR-blue para quantificar rapidamente a resistência dos terminadores encontrados in silico.

Rápida Verificação de Exterminadores Usando o PGR Azul plasmídeo e Montagem Golden Gate

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

O objetivo geral do protocolo de biologia sintética é determinar rapidamente a funcionalidade do terminador e quantificar a força do terminador em um sistema in vitro que utiliza a montagem por Golden Gate. Este protocolo é usado para testar terminadores que identificamos in silico por meio de bioinformática e avaliá-los em um contexto biológico. Isso permite a confirmação rápida e simples de terminadores identificados bioinformaticamente em um ambiente de bancada laboratorial.A principal vantagem deste protocolo é sua velocidade. Podemos passar da identificação bioinformática à confirmação biológica em menos de uma semana. Ao fazê-lo, também podemos verificar se um terminador é de fato um terminador e quantificar sua eficiência de terminação.De modo geral, os indivíduos inicialmente terão dificuldade com esta técnica, pois parece contra-intuitivo adicionar a enzima de restrição junto com a ligase no mesmo tubo. No entanto, utilizamos endonucleases de restrição do tipo 2S, nas quais o sítio de reconhecimento da enzima é distinto do sítio de corte propriamente dito. Uma vez que o terminador é ligado ao plasmídeo pGR blue, essa ligação é permanente.No entanto, ao colocar a enzima de restrição e a ligase no mesmo tubo e submeter a múltiplos ciclos, podemos obter uma alta eficiência de clonagem. Inicie este procedimento ressuspendendo os oligonucleotídeos individuais em água livre de nucleases numa concentração de 100 micromolar, depois prepare o tampão de hibridização 10x. Em seguida, rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada terminador a ser testado.A cada tubo, adicione 16 microlitros de água ultrapura, 2 microlitros de tampão de hibridização 10x e 1 microlitro de cada um dos oligonucleotídeos da fita superior e inferior dos terminadores desejados. É muito importante garantir que os oligonucleotídeos encomendados possuam as extremidades coesivas corretas. Pois, uma vez hibridizados, é essencial assegurar que o terminador esteja na orientação correta.Se o terminador estiver na orientação incorreta, o pGR blue não poderá verificar se é um terminador funcional. Em seguida, coloque os tubos de microcentrífuga em uma placa flutuante e ferva-os por quatro minutos em banho-maria. Após quatro minutos, desligue a placa de aquecimento, mas deixe os tubos na água durante a noite para esfriar lentamente.Armazene os terminadores recozidos a 20 graus Celsius. Para preparar uma diluição de 40 nanomolares dos terminadores recozidos, primeiro descongele-os no gelo e, em seguida, em um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, adicione 124 microlitros de água livre de nucleases a 1 microlitro dos terminadores recozidos. Centrifugue as amostras por 30 segundos a 10.000x g.Após a centrifugação, armazene as amostras em gelo. Em um novo tubo apropriado para termociclador, adicione 6 microlitros de água livre de nucleases. Em seguida, adicione um microlitro de tampão comercial para DNA ligase.Realize todos os passos subsequentes em gelo. Em seguida, adicione 1 microlitro contendo de 35 a 50 nanogramas por microlitro do plasmídeo destino pGR blue, 1 microlitro dos terminadores anelados de 40 nanomolar, 0,5 microlitros de enzima de restrição BSA1 de alta fidelidade comercial e 0,5 microlitros de ligase de DNA comercial. Centrifugue a mistura de reação a 10.000x g por 120 segundos.Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador e execute o seguinte programa: 20 ciclos de 1 minuto a 37 graus Celsius, seguidos por 1 minuto a 0 graus Celsius e, depois, um ciclo de 15 minutos a 37 graus Celsius. Após a execução, congele e armazene as amostras a -20 graus Celsius ou prossiga imediatamente para a transformação.Transforme as reações de ligação em células de E. coli quimicamente competentes utilizando qualquer protocolo de transformação apropriado. Aqui, as células JM109 são transformadas utilizando a transformação zippy.Usando uma alça de vidro em forma de L, espalhe 25 microlitros das células transformadas em placas de ágar LB pré-aquecidas contendo 1 milimolar de ampicilina e 10 milimolares de arabinose. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Não as incube por mais de 24 horas.A ampicilina degrada-se rapidamente. No dia seguinte, examine a cor das colônias. Uma ligação bem-sucedida deve ser branca ou amarela à luz visível e fluorescer em verde sob luz azul ou UV.Uma ligação mal-sucedida produzirá uma colônia de cor azul sob luz visível. Para cada um dos terminadores e controles, prepare um tubo de ensaio contendo 5 mililitros de caldo LB estéril com 1 milimolar de ampicilina e 10 milimolar de arabinose. Ao realizar este protocolo, com o pGR é muito importante garantir que os controles adequados estejam em vigor.O primeiro controle deve ser apenas caldo LB. O próximo controle deve ser células que têm resistência à ampicilina, mas não fluorescem sob luz azul. Estas servirão como branco.O próximo controle é um plasmídeo pGR que não foi cortado, portanto não possui terminador inserido, e servirá como base para a força do terminador; o último dos seus tubos será destinado à sua amostra. Sob luz visível, use um alça estéril para selecionar 2 a 3 colônias brancas ou amarelas e transfira-as para o caldo LB. Incube as amostras em agitador a 37 graus Celsius e 160 rpm por 16 a 18 horas.No dia seguinte, utilize um espectrofotômetro para determinar a densidade óptica celular de cada amostra a 600 nanômetros. Geralmente, após esse período, espera-se uma DO 600 entre 0,8 e 1,0. Coloque uma placa estéril de 96 poços na cabine de segurança.Para cada amostra ou controle, prepare 3 poços com 199 microlitros de caldo LB estéril com ampicilina e arabinose. Em seguida, pipete 1 microlitro da solução celular dos caldos de cultura noturna para poços individuais da placa de 96 poços. Cubra as placas com uma tampa permeável e agite-as por 18 a 20 horas a 37 graus Celsius e 160 rpm.No dia seguinte, utilize um leitor de placas para determinar a DO 600, que deve ser aproximadamente 0,5. Além disso, meça a fluorescência de G de P em um comprimento de onda de excitação de 395 nanômetros e emissão de 509 nanômetros. Meça a fluorescência de RFP em um comprimento de onda de excitação de 575 nanômetros e emissão de 605 nanômetros.No Excel, normalize a variação no crescimento dividindo a fluorescência pela DO 600. Após a normalização, determine a força relativa do terminador tomando a fluorescência do terminador GFP dividida pela fluorescência do controle GFP e dividindo pelo valor de fluorescência do terminador RFP dividido pela fluorescência do controle RFP. Os terminadores putativos T1 a T6, identificados bioinformaticamente no fago de microbactérias bernal 13, foram analisados conforme descrito neste vídeo.Esses resultados mostram fluorescência relativa. Todos os resultados foram normalizados utilizando células contendo PGR não cortado e não modificado como controle. Descobriu-se que T3 é um terminador forte.Todos os resultados representam colônias individuais cultivadas em triplicata e médias para representação visual. As barras de erro representam os desvios entre os pontos de dados médios. Para determinar o melhor controle de referência para quantificar a força do terminador, foram comparados dados brutos utilizando o plasmídeo pGR original sem terminador e o pGR blue clonado com uma sequência conhecida por não ser um terminador.Como pode ser visto aqui, ambos os controles apresentaram níveis semelhantes de expressão de GFP e RFP e, mais importante, produziram razões semelhantes entre GFP e RFP. Todos esses resultados representam colônias individuais que foram cultivadas em triplicata e cujos valores foram médios para representação visual. Uma vez dominada, esta técnica pode levar tão pouco quanto 72 horas, incluindo o tempo de envio e pedido.É importante observar que o pGR blue funciona apenas em *E. coli*. Além disso, como estamos analisando apenas uma pequena região do terminador, não temos conhecimento sobre outros elementos regulatórios que possam controlar a transcrição. Para verificar os resultados obtidos com este protocolo utilizando o pGR blue, podem ser empregados métodos adicionais, como a PCR quantitativa.Além disso, o inserto pGR pode ser cortado e ligado em um plasmídeo de sua escolha.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Este protocolo descreve um método para derivar portas de deslocamento de fita de DNA de plasmídeos e testá-las usando medições de cinética de fluorescência. As portas podem ser compostas modularmente em sistemas multicomponentes para aproximar o comportamento de redes formais de reação química (CRN), demonstrando um novo uso para CRNs como linguagem de programação molecular.

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Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Aqui, apresentamos um protocolo para nocautear um gene de interesse envolvido na conjugação de plasmídeos e, posteriormente, analisar o impacto de sua ausência usando ensaios de acasalamento. A função do gene é explorada para uma região específica de sua sequência usando deleção ou mutações pontuais.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

Métodos para a geração de bibliotecas gRNA em larga escala devem ser simples, eficiente e econômica. Descreveremos um protocolo para a produção de bibliotecas de gRNA baseado na digestão enzimática de ADN alvo. Este método, CORALINA (geração de biblioteca gRNA abrangente através da actividade nuclease controlada) apresenta uma alternativa para síntese do oligonucleotide personalizado dispendiosos.

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

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O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

Sistemas CRISPR-Cas e proteínas anti-CRISPR foram integrados ao esquema de portões booleanos em Saccharomyces cerevisiae. Os novos circuitos lógicos pequenos mostraram bom desempenho e aprofundaram a compreensão dos fatores de transcrição baseados em dCas9/dCas12a e das propriedades das proteínas anti-CRISPR.

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Aprenda a quantificar a força de terminadores usando montagem Golden Gate e o plasmídeo pGR Azul. Este método rápido permite validar em menos de uma semana sequências identificadas in silico.

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