Um modelo de mouse Retinal isquemia-reperfusão Através elevação da pressão intra-ocular

O objetivo geral desta técnica é fornecer um modelo experimental de Lesão de Isquemia-Reperfusão Retiniana e suas consequências patológicas. Este método é comumente usado para investigar os mecanismos subjacentes à isquemia-reperfusão retiniana, bem como para avaliar possíveis abordagens terapêuticas para o tratamento de patologias associadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela cria uma lesão altamente direcionada às estruturas oculares, causando danos mínimos aos tecidos circundantes.

A utilidade desta técnica se estende para a compreensão e três meses de múltiplas manifestações da Lesão de Isquemia-Reperfusão Retiniana, incluindo: inflamação, estresse oxidativo e disfunção do olhar fixo na unidade neurovascular da retina. A demonstração em vídeo desse método é fundamental porque as técnicas cirúrgicas para colocação de cânulas podem ser difíceis de reproduzir sem um guia visual. Antes de iniciar o procedimento, aqueça uma gaiola vazia sobre a mesa.

Em seguida, insira a extremidade afiada do tubo Y-site pré-perfurado do conjunto primário em uma garrafa de 0,1% de heparina sódica e pendure o fundo da heparina sódica em uma extensão de pólo IV. Abra a tampa do filtro de ar na tubulação. Em seguida, eleve o frasco de heparina sódica a 163 centímetros do tampo da mesa até o pico do gotejamento de heparina sódica, para produzir uma pressão de fluxo de heparina sódica de 120 mililitros de mercúrio.

Abra a tubulação do local Y pré-perfurado do conjunto primário, para permitir que a heparina sódica encha a tubulação e conecte a tubulação do local Y pré-perfurado do conjunto primário ao coletor de cinco válvulas. Em seguida, usando conexões de tubo Luer macho para Luer macho, conecte agulhas de meia polegada de calibre 30 ao coletor de cinco portas. Insira cada uma das agulhas em seu próprio segmento de dez polegadas de tubo de calibre 30

Em seguida, usando hemostatos, quebre as novas pontas das agulhas de calibre 30 de meia polegada e insira suas extremidades rombas nas extremidades abertas do tubo de calibre 30. Em seguida, use fita adesiva para organizar os tubos da agulha de forma que os tubos conectados às portas internas sejam posicionados em cima dos tubos conectados às portas externas para evitar o emaranhamento do tubo durante a canulação da câmara anterior. Agora, ligue o fluxo de 0,1% de heparina sódica para o coletor de cinco válvulas e para cada porta individual por dois a três minutos para remover quaisquer bolhas de ar.

Em seguida, desligue todas as portas do coletor de cinco válvulas. Para realizar a canulação, após a administração da anestesia, coloque todos os camundongos na gaiola quente na mesa de cirurgia, confirmando a obtenção de anestesia profunda por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé após cinco a dez minutos. Em seguida, administre uma gota de Tropicamida para dilatação da pupila e uma gota de Proparacaína para anestesia local em cada um dos olhos dos animais e organize os camundongos na ordem de anestesia, de modo que o primeiro camundongo anestesiado seja o primeiro camundongo a ser canulado.

Enquanto espera que o colírio faça efeito, prepare pedaços de fita reta de dez centímetros, puxando firmemente a fita antes de rasgar e reservando um pedaço de fita por animal. Observe que não puxar firmemente a fita resultará em enrolamento da fita. Quando o primeiro camundongo estiver pronto, coloque o animal sob um microscópio cirúrgico.

Em seguida, ligue a primeira porta de 0,1% de heparina sódica no coletor de cinco válvulas e use uma pinça para propotizar suavemente um olho. Em seguida, insira a agulha da cânula de calibre 30 na câmara anterior, aproximadamente a meio caminho entre as fibras zonulares e o ápice da córnea. Tomando cuidado para evitar penetrar na conrea uma segunda vez.

Observe que um movimento de torção suave é usado para inserir a cânula profundamente na câmara anterior. Agora, pressione o tubo de calibre 30 contra o tampo da mesa para minimizar qualquer movimento da cânula inserida enquanto pega um pedaço de fita adesiva e use a fita para prender o tubo à mesa. Uma vez que o tubo tenha sido fixado, registre a hora de início da cirurgia.

Use o microscópio para verificar se não há vazamento e se o olho de isquemia-reperfusão é maior que o olho contralateral, para estabelecer a presença de distensão ocular. Aplique hipromelose em ambos os olhos a cada 30 minutos, até o final do experimento para lubrificar a córnea e selar quaisquer microvazamentos. Se um animal se mexer durante o procedimento, levante a cauda e administre um reforço de cetamina por via intraperitoneal.

90 minutos após a canulação do primeiro animal, puxe suavemente a cânula da câmara anterior e lubrifique ambos os olhos com geléia lubrificante. À medida que as cânulas subsequentes são removidas, coloque cada camundongo de volta na gaiola na mesa cirúrgica, até que os animais estejam totalmente recuperados. Depois que todas as cânulas forem removidas, desinfete-as com lenços umedecidos com álcool.

Em seguida, use uma seringa de 60 mililitros cheia de ar para expelir a heparina sódica do coletor de cinco válvulas, agulhas de calibre 30, tubo de calibre 30 e cânulas. Em seguida, enxágue todos os instrumentos com uma seringa de 60 mililitros cheia de água destilada. Por fim, expulse a água destilada de todos os materiais com 60 mililitros de ar e guarde o equipamento desinfetado e enxaguado para uso posterior.

A imunomarcação NeuN dos núcleos neuronais revela perda significativa de células nuronais, após insulto de isquemia-reperfusão, por imagem microscópica confocal, sete dias após a lesão de isquemia-reperfusão. De fato, a quantificação manual das células NeuN positivas no controle e nos olhos de isquemia-reperfusão demonstra uma diminuição na contagem de neurônios da camada de células gangelion após a lesão, indicando a presença de morte celular induzida por isquemia-reperfusão. Amplitudes mais baixas da onda a e da onda b documentadas pela eletrorretinografia também significam a ocorrência de deficiências induzidas por isquemia-reperfusão na função neuronal da retina em comparação com os olhos de controle não lesionados.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em dez animais em aproximadamente cinco horas, incluindo as duas horas finais gastas esperando que os camundongos se recuperem da anestesia. Ao tentar este procedimento, é importante manter a anestesia profunda. Como uma sedação eficaz, evitará o deslocamento da cânula pelo movimento do animal.

Após este procedimento, outros métodos, como a eletrorretinografia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a função da retina. Essa técnica permitiu que pesquisadores nas áreas de oftalmologia, neurociência e biologia vascular explorassem a patogênese neurovasuclar da retina e a intervenção terapêutica em roedores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar uma lesão retiniana direcionada, por meio da canulação da câmara anterior ocular.

Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos cirúrgicos pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de um descarte eficaz de perfurocortantes, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.