DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é extrair DNA e RNA de alto rendimento e qualidade de sedimentos marinhos costeiros e, posteriormente, quantificar genes e transcritos de RNA ribossômico 16S. Este método que descreve a extração de DNA e RNA de sedimentos marinhos seguido de PCR quantitativo é uma etapa fundamental na análise molecular da abundância e diversidade microbiana no ambiente. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para coextrair DNA e RNA da mesma amostra, que pode ser usada para análise posterior, como PCR quantitativo.

Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Enrico Tatti, da NUI Galway, e Duncan Sweeney, estudante de doutorado da Universidade de Essex. Para coextrair DNA e RNA de sedimentos costeiros após preparar materiais livres de RNA e coletar amostras de sedimentos costeiros de acordo com o protocolo de texto, transfira 0,5 gramas de sedimento para um tubo de lise de esferas de dois mililitros. Adicione 500 microlitros de tampão fosfato CTAB e 500 microlitros de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico ao tubo e inverta cinco a 10 vezes para homogeneizar a amostra.

Vórtice em velocidade máxima por 2,5 minutos antes de girar a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, em uma capela de exaustão, extraia a camada aquosa superior e transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque as amostras no gelo e adicione 500 microlitros de clorofórmio: álcool isoamílico gelado.

Em seguida, inverta o tubo várias vezes até que uma emulsão seja visível e centrifugue como antes. Numa hotte, extrair a camada aquosa superior e colocá-la num novo tubo estéril de 1,5 mililitros. Em seguida, para precipitar os ácidos nucléicos, adicione dois volumes de solução de cloreto de sódio a 30% PEG e misture bem.

Incube no gelo por duas horas ou deixe as amostras a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, centrifugue as amostras a 16 000 vezes g a quatro graus Celsius durante 20 minutos. Usando uma micropipeta, remova suavemente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Deixe aproximadamente 10 microlitros de solução de PEG no tubo e adicione um mililitro de etanol 70% gelado. Depois de girar a amostra, use uma micropipeta para remover lentamente o etanol, tomando cuidado para não tocar no pellet. Em seguida, centrifugar durante cinco segundos e retirar o etanol residual.

Deixe o pellet secar ao ar por cinco minutos antes de usar 50 microlitros de água tratada com DEPC para ressuspendê-lo. Alíquota de uma amostra de 15 microlitros para DNA e 30 microlitros para RNA. A etapa mais crítica é garantir que o pellet de DNA / RNA não seja desalojado durante a remoção do sobrenadante e nenhum etanol residual permaneça antes de ressuspender o pellet em água, pois inibe a reação molecular a jusante.

Para digerir o DNA na amostra de RNA, adicione três microlitros de tampão DNase I e 1,5 microlitros de DNase I à alíquota de ácido nucleico de 30 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Misture o reagente de inativação de DNase por vórtice por 30 segundos.

Em seguida, adicione 4,8 microlitros da solução à amostra e incube em temperatura ambiente por cinco minutos, ocasionalmente batendo no fundo dos tubos para misturar a solução. Depois de girar a amostra, transfira o sobrenadante contendo RNA para um novo tubo, tomando cuidado para não transferir o precipitante. Para verificar a qualidade do RNA, dilua dois microlitros de RNA, um em cada 10, adicionando 18 microlitros de água deionizada estéril sem RNase.

Em reações de PCR separadas, adicione um microlitro de puro ou uma diluição em 10 de RNA a um tubo de PCR estéril de 0,5 mililitro. Seguindo a tabela no protocolo de texto, adicione os componentes da reação de PCR para amplificar o gene do RNA ribossômico 16S. Inclua um controle positivo, um controle de inibidor de PCR e um controle negativo.

Em seguida, execute as reações de PCR usando os seguintes parâmetros de amplificação. Para gerar o cDNA da primeira fita a partir do RNA, adicione os reagentes de reação a um tubo de PCR de 0,2 mililitro de acordo com o protocolo de texto. Incube as amostras a 65 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, coloque as amostras no gelo por pelo menos um minuto antes de incubar a 25 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, adicione os reagentes na tabela listada aqui a partir do protocolo de texto e incube a 55 graus Celsius por 50 minutos. Em seguida, inative a reação a 72 graus Celsius por 10 minutos.

Depois de gerar padrões de DNA e RNA para qPCR de acordo com o protocolo de texto, descongele amostras ambientais de DNA e cDNA, padrões e reagentes de qPCR no gelo. Dilua os padrões de ácido nucleico e prepare uma em cada 10 diluições do DNA ambiental e do cDNA de puro a 10 a menos três. Faça uma mistura principal para o número total de reações mais 10% e misture bem.

Adicione 19 microlitros de master mix e um microlitro de molde em triplicata a cada poço em uma placa qPCR óptica de 96 poços. Use uma tampa óptica qPCR para cobrir a placa. Em seguida, centrifugue brevemente a placa e carregue-a no bloco de aquecimento da máquina qPCR.

Em seguida, abra o software gerenciador de qPCR, clique na guia Protocolo, clique em Criar novo e adicione as seguintes condições de amplificação. Defina o volume de amostra para 20 microlitros, clique em OK e salve o protocolo. Agora escolha a guia Placa.

Em seguida, em Editar selecionados, clique em Selecionar fluoróforo. Adicione o corante repórter para a sonda apropriada e clique em OK. Realce os poços que contêm os padrões e, no menu Tipo de amostra, selecione Padrão. Escolha Replicar série para alterar o tamanho da replicação para três e clique em Aplicar.

Escolha Dilution Series para adicionar a concentração inicial calculada para o padrão. Indique o fator de diluição de 10, selecione Decrescente ou Crescente dependendo da ordem em que a curva padrão foi adicionada à placa e clique em Aplicar. Realce as posições dos poços que contêm as amostras desconhecidas e selecione Desconhecido no menu suspenso Tipo de amostra.

Escolha Replicar série e altere o tamanho da replicação para três e clique em Aplicar. Em Nome da amostra, edite os nomes da amostra e repita o procedimento para nenhuma fonte de controle de modelo. Em seguida, na caixa do editor de chapas, clique em OK e salve o arquivo.

Em seguida, clique em Iniciar Execução. Quando a execução for concluída, escolha a guia Quantificação para exibir a curva padrão, os descritores de curva padrão e os gráficos de amplificação. Por fim, escolha a guia Dados de quantificação para valores de Cp e quantidade inicial correspondente para genes de amostras desconhecidas.

Determinar o número de cópias de genes por grama de sedimento de peso húmido de acordo com o protocolo de texto. Conforme mostrado nesta imagem de gel, uma extração bem-sucedida de ácido nucleico produz bandas claras de DNA e RNA, onde bandas nítidas de RNA ribossômico 23S e 16S são visíveis, além da presença de uma banda de DNA genômico de alto peso molecular. Esta figura demonstra que quando uma faixa de diluição de dez vezes é corretamente preparada e amplificada para gerar uma curva padrão a ser usada para a reação de qPCR, uma diferença de 3,3 ciclos entre cada diluição padrão é vista.

É importante relatar o ponto de cruzamento, ou valores de Cp, do controle sem modelo, ou NTC, se presente. Se isso ocorrer, um corte de Cp para amostras padrão e desconhecidas de 3,3 ciclos ou uma dobra logarítmica maior que o valor de Cp do NTC é imposto conforme descrito anteriormente. Aqui, foi realizada a amplificação da amostra ambiental de 10 para menos um, 10 para menos dois e 10 para menos três diluições.

A amostra pura não amplificou e os valores de Cp de 10 elevado a menos um a 10 elevado a menos três diluições foram 24,12, 26,02 e 28,40, respectivamente. Como visto neste gráfico, descritores de curva padrão, incluindo os valores de R ao quadrado de 0,99 e eficiências de PCR na faixa de 90 a 110% são desejados. Neste experimento, o Cp do NTC foi de 30,5 e um ponto de corte negativo de Cp de 27,2 foi imposto.

A conversão de abundâncias gênicas em por grama de sedimento de peso úmido resultou em 2,5 vezes 10 elevado a sétimo e 7,1 vezes 10 elevado a sétimo para 10 elevado a menos um e 10 elevado a menos duas diluições, respectivamente. A diluição de 10 elevado a menos três Cp foi maior que o ponto de corte do NTC. Nesse caso, o 10 elevado a dois negativos foi selecionado como a diluição ideal do modelo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o RNA pode ser rapidamente degradado, portanto, é importante manter a amostra no gelo e usar luvas para evitar a contaminação com RNase o tempo todo. Não se esqueça de que estamos trabalhando com fenol: clorofórmio e álcool isamílico, e isso pode ser extremamente perigoso. E precauções como usar jaleco, luvas e óculos de proteção e trabalhar sob um capuz químico devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair DNA e RNA e quantificar a abundância de genes e transcritos em sedimentos costeiros marinhos. Lembre-se, este procedimento pode ser facilmente usado para extrair DNA e RNA e quantificar uma variedade de alvos genéticos da maioria das amostras ambientais, incluindo o solo.