Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes

O objetivo geral da imagem paramagnética eletrônica de varredura rápida, ou RSEPRI, é fornecer informações quantitativas sobre a concentração de oxigênio, pH, estado redox e concentração de moléculas sinalizadoras que são úteis para a pesquisa biomédica. A EPRI é uma ferramenta que pode ser usada para responder perguntas fundamentais na pesquisa sobre câncer relacionadas ao microambiente tumoral. A principal vantagem da imagem por RPE de varredura rápida é que é possível obter mais informações em um tempo muito menor, com uma maior variedade de moléculas marcadoras, em comparação com a imagem por RPE de onda contínua ou CW.

As moléculas que são sensíveis ao estado redox ou ao pH são um bom exemplo de onde a EPRI de varredura rápida realmente se destaca. Inicie este procedimento com o cálculo das condições experimentais de varredura rápida conforme determinado no protocolo textual. Um aspecto importante da varredura rápida é compreender a dependência do sinal em relação à largura de banda do ressonador e às condições experimentais, como a largura da varredura de frequência.

Para realmente otimizar o experimento, é necessário compreender os três elementos. O driver da bobina de varredura rápida possui dois amplificadores. Ao selecionar um capacitor, a caixa de capacitores precisa ser equilibrada com uma capacitância igual em cada lado da caixa.

Os dois lados estão em série. Desparafuse a tampa superior da caixa de capacitores e insira capacitores em ambos os lados iguais ao valor determinado. Substitua a tampa da caixa de capacitores e parafuse-a para garantir que permaneça fixa.

Usando o painel frontal do driver da bobina ressonante, ajuste a frequência de saída até que a forma de onda senoidal tenha a amplitude máxima. Para preparar os radicais, retire o PDT com N-15 do congelador e deixe o recipiente atingir a temperatura ambiente. Pese 1,4 miligramas de PDT com N-15 utilizando uma balança analítica.

Adicione 1,4 miligramas de PDT com N-15 a 15 mililitros de água deionizada para obter uma concentração final de 0,5 milimolar. Em seguida, combine 50 miligramas de BMPO com cinco mililitros de água em um tubo de irradiação de quartzo de 16 milímetros. Adicione 100 microlitros de peróxido de hidrogênio 300 milimolar.

Irradie a mistura no tubo de irradiação de quartzo de 16 milímetros com uma lâmpada ultravioleta de 450 watts de pressão média durante cinco minutos. Usando uma pipeta de transferência de vidro, transfira dois vírgula cinco mililitros da solução de BMPO-OH irradiada para fora do tubo de irradiação de quartzo e para um lado de um tubo de amostra de quartzo de 16 milímetros com um divisor de três milímetros. Transfira os dois vírgula cinco mililitros restantes da solução de BMPO-OH irradiada para o outro lado do tubo de amostra de quartzo com o divisor.

Um segundo passo crítico é compreender a curva de saturação de potência. À medida que a taxa de varredura aumenta, você alcança potências mais altas e amplitudes de sinal maiores antes que seu sinal sature. Amplitudes de sinal maiores são outra maneira de reduzir seu tempo de aquisição.

Primeiro, ajuste o ressoador com uma amostra aquosa do radical nitroxila inserindo a amostra de 15 mililitros de PDT N-15 0,5 milimolar em água em um tubo de ressonância paramagnética eletrônica de quartzo de 16 milímetros. Insira o tubo de quartzo no lado de detecção do ressoador de varredura rápida com laço cruzado, ou RSEPR. Altere a frequência da fonte do instrumento até que ela coincida com a frequência do lado de detecção que contém a amostra.

Agora, altere a frequência do lado de excitação para igualar as frequências da fonte do experimento e do lado de detecção do ressonador. Altere a frequência do lado de excitação girando um capacitor variável dentro da cavidade do ressonador. Para configurar o console do instrumento e o ímã principal, ligue o espectrômetro e escolha um experimento que registre dados transitórios com o tempo na abscissa.

Realize uma curva de saturação de potência em uma amostra padrão de radical nitroxila sob as mesmas condições experimentais que serão utilizadas para analisar radicais sensíveis ao pH ou ao estado redox. Uma vez que o sistema esteja configurado, gradientes são aplicados manualmente ou por meio de um programa de computador para o experimento de imagem. A intensidade do sinal de RPE é diretamente proporcional ao campo de micro-ondas no ressonador que provoca a transição do spin de um nível de energia para o próximo.

Esse campo de micro-ondas é denominado B1. O valor de B1 é proporcional à raiz quadrada da potência de micro-ondas. Quando a potência de micro-ondas é quadruplicada, B1 é duplicado. Nesta figura, a potência é quadruplicada de oito para 32 miliwatts, e B1 é duplicado de 18 para 36 miligauss.

Pode-se construir uma curva de saturação de potência traçando a amplitude relativa em função da raiz quadrada da potência de micro-ondas, ou, se a eficiência do ressonador for conhecida, em função de B1. A região linear dessa curva indica a faixa de potência na qual o sinal de RPE não está saturado nem distorcido. Uma das vantagens de um experimento de varredura rápida é que a faixa linear de potência é estendida, representada pelos pontos coloridos, em comparação com o experimento convencional de onda contínua representado pelos pontos pretos. É mostrada aqui uma imagem espectral espacial bidimensional de fantasmas constituídos por um aduto BMPO-OH separados por três milímetros numa concentração de cinco micromolar.

Um corte na imagem mostra a forma espectral em 250 megahertz. Esta imagem mostra o radical nitranila de N-14, que pode ser usado para capturar óxido nítrico in vivo em um fantoma, onde uma parede com espessura de um milímetro e meio separa duas câmaras de amostra. A forma espectral em 250 megahertz é mostrada aqui.

A imagem bidimensional de radicais triarilmetila sensíveis ao pH reflete a diferença nas características espectrais quando o pH do tampão fosfato é igual a sete vírgula zero ou quando o pH é igual a sete vírgula quatro. Esta imagem mostra dinitroxida com N-15 em um fantasma de dois compartimentos com espaçador de 10 milímetros. Inicialmente, ambos os compartimentos contêm sonda na concentração de 0,5 milimolar.

A adição de glutationa ao dinitroxídeo quebra a região do ligador reduzido e produz dois mononitroxídeos, uma mudança que se reflete na imagem bidimensional. O desenvolvimento da RPE de varredura rápida representa uma mudança total de paradigma na nossa capacidade de estudar moléculas com elétrons não emparelhados. Você viu hoje sua aplicação à RPE in vivo, mas ela também possui excelentes possibilidades para estudos em baixa temperatura de compostos com metais em sua estrutura e muitos outros tipos de sistemas.

Para todas as amostras que estudamos até agora, obtivemos melhorias na relação sinal-ruído de pelo menos uma ordem de grandeza e, às vezes, ainda mais.