Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes In Vivo
26 de setembro de 2016
Um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), rápidas digitalização EPR (RS-EPR), é demonstrado para 2D imagens espaciais espectral, que é superior à técnica tradicional de onda contínua (CW) e abre novos espaços para imagiologia in vivo. Os resultados são demonstrados a 250 MHz, mas a técnica é aplicável em qualquer frequência.
O objetivo geral da Imagem Paramagnética Eletrônica de Varredura Rápida, ou RSEPRI, é fornecer informações quantitativas sobre concentração de oxigênio, pH, status redox e concentração de moléculas de sinalização que são úteis para pesquisas biomédicas. O EPRI é uma ferramenta que pode ser usada para responder a perguntas-chave na pesquisa do câncer em relação ao ambiente do tumor. A principal vantagem da imagem EPR de varredura rápida é que você pode adquirir mais informações em um tempo muito mais rápido, com uma variedade maior de moléculas de sonda em comparação com a imagem EPR de onda contínua ou CW.
As moléculas que são sensíveis ao status redox ou pH são um bom exemplo de onde o EPRI de varredura rápida realmente brilha. Inicie este procedimento com o cálculo das condições experimentais de varredura rápida, conforme determinado no protocolo de texto. Uma parte importante da varredura rápida é entender a dependência do sinal na largura de banda do ressonador e nas condições experimentais, como largura de varredura da frequência de varredura.
Para realmente otimizar o experimento, você precisa entender todos os três. O driver da bobina de varredura rápida possui dois amplificadores. Ao selecionar um capacitor, a caixa do capacitor precisa ser balanceada com uma capacitância igual em cada lado da caixa.
Os dois lados estão em série. Desaparafuse a tampa superior da caixa do capacitor e insira capacitores em ambos os lados que sejam iguais ao valor determinado. Recoloque a parte superior da caixa do capacitor e aparafuse-a para garantir que ela permaneça ligada.
Usando o painel frontal do driver da bobina ressonada, ajuste a frequência de saída até que a forma de onda senoidal tenha a amplitude máxima. Para preparar os radicais, remova o N-15 PDT do freezer e deixe o recipiente atingir a temperatura ambiente. Pese 1,4 miligramas de N-15 PDT usando uma balança analítica.
Adicione 1,4 miligramas de N-15 PDT a 15 mililitros de água deionizada para uma concentração final de 0,5 milimolar. Em seguida, combine 50 miligramas de BMPO com cinco mililitros de água em um tubo de irradiação de quartzo de 16 milímetros. Adicione 100 microlitros de peróxido de hidrogênio 300 milimolar.
Irradiar a mistura no tubo de irradiação de quartzo de 16 milímetros com uma lâmpada ultravioleta de 450 watts de média pressão durante cinco minutos. Usando uma pipeta de transferência de vidro, transfira dois vírgula cinco mililitros da solução BMPO-OH irradiada para fora do tubo de irradiação de quartzo e para um lado de um tubo de amostra de quartzo de 16 milímetros com um divisor de três milímetros. Transfira os dois vírgula cinco mililitros restantes de BMPO-OH irradiado para o outro lado do tubo de amostra de quartzo com o divisor.
Um segundo passo crítico é entender a curva de saturação de potência. À medida que a taxa de varredura aumenta, você acessa potências mais altas e amplitudes de sinal maiores antes que o sinal sature. Amplitudes de sinal maiores são outra maneira de diminuir o tempo de aquisição.
Primeiro, sintonize o ressonador com uma amostra aquosa do radical nitróxido, inserindo a amostra de 15 mililitros de 0,5 milimolar N-15 PDT em água em um tubo de ressonância paramagnética eletrônica de quartzo de 16 milímetros. Insira o tubo de quartzo no lado de detecção da ressonância paramagnética eletrônica de varredura rápida de loop cruzado ou ressonador RSEPR. Altere a frequência da fonte do instrumento até que corresponda à frequência do lado de detecção que contém a amostra.
Agora, altere a frequência do lado de excitação para corresponder às frequências da fonte do experimento e do lado de detecção do ressonador. Altere a frequência do lado de excitação girando um capacitor variável dentro da cavidade do ressonador. Para configurar o console de instrumentos e o ímã principal, ligue o espectrômetro e escolha um experimento que registre dados transitórios com o tempo na abscissa.
Execute uma curva de saturação de potência em uma amostra de radical nitroxídeo padrão sob as mesmas condições experimentais que serão usadas para observar radicais sensíveis ao pH ou status redox. Uma vez que o sistema é configurado, os gradientes são aplicados manualmente ou por meio de um programa de computador para o experimento de imagem. A intensidade do sinal EPR é diretamente proporcional ao campo de microondas no ressonador que faz com que o spin vá de um nível de energia para o próximo.
Este campo de microondas é denominado B1. B1 é proporcional à raiz quadrada da potência de microondas. À medida que a potência de micro-ondas é quadruplicada, B1 é dobrada. Nesta figura, a potência é quadruplicada de oito para 32 miliwatts, e B1 é duplicada de 18 para 36 miliGauss.
Uma curva de saturação de potência pode ser construída plotando a amplitude relativa em função da raiz quadrada da potência de microondas ou, se a eficiência do ressonador for conhecida, B1. A região dessa curva que é linear mostra a região de potência onde o sinal EPR não está saturado ou distorcido. Uma das vantagens de um experimento de varredura rápida é que a faixa de potência linear é estendida, representada pelos pontos coloridos, em comparação com o experimento CW regular representado pelos pontos pretos. Aqui é mostrada uma imagem espacial espectral bidimensional de fantasmas consistindo de um aduto BMPO-OH separado por três milímetros a uma concentração de cinco micromolares.
Uma fatia da imagem mostra a forma espectral em 250 megahertz. Esta imagem mostra o radical N-14 nitranila que pode ser usado para capturar óxido nítrico in vivo em um fantasma, onde uma parede de um ponto e cinco milímetros de espessura separa duas câmaras de amostra. A forma espectral a 250 megahertz é mostrada aqui.
A imagem bidimensional dos radicais triarilmetil sensíveis ao pH reflete a diferença nas características espectrais quando o pH do tampão fosfato é igual a sete vírgula zero ou o pH é igual a sete vírgula quatro. Esta imagem mostra o dinitróxido N-15 em um simulador de dois compartimentos com um espaçador de 10 milímetros. Inicialmente, ambos os compartimentos contêm sonda de 0,5 milimolar.
A adição de glutationa ao dinitróxido quebra a região do ligante reduzida e produz dois mononitróxidos, uma mudança que se reflete na imagem bidimensional. O desenvolvimento do EPR de varredura rápida é uma mudança total de paradigma em nossa capacidade de estudar moléculas com elétrons desemparelhados. Você viu hoje sua aplicação ao EPR in vivo, mas também tem possibilidades maravilhosas para estudos de baixa temperatura de compostos com metais e muitos outros tipos de sistemas.
Para todas as amostras que estudamos até agora, obtivemos melhorias na relação sinal-ruído de pelo menos uma ordem de magnitude e às vezes até mais.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (RPE), conhecido como RPE de varredura rápida (RPE-VR), para imageamento espectral espacial 2D. A RPE-VR oferece vantagens em relação às técnicas tradicionais de onda contínua (OC), particularmente no contexto de aplicações de imageamento in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imagem biomédica
- Ressonância paramagnética eletrônica
- Pesquisa sobre câncer
Antecedentes
- A imagem paramagnética eletrônica de varredura rápida (RSEPRI) fornece dados quantitativos sobre diversos parâmetros biológicos.
- É particularmente útil para avaliar ambientes tumorais na pesquisa do câncer.
- A técnica permite uma aquisição de dados mais rápida em comparação com métodos tradicionais.
- Pode utilizar uma maior variedade de moléculas marcadoras sensíveis ao estado redox e ao pH.
Objetivo do Estudo
- Aprimorar técnicas de imagem para pesquisa biomédica.
- Fornecer informações detalhadas sobre concentração de oxigênio, pH e moléculas sinalizadoras.
- Melhorar a compreensão do microambiente tumoral.
Métodos Utilizados
- Cálculo das condições experimentais de varredura rápida.
- Avaliação da dependência do sinal em relação à largura de banda do ressonador.
- Avaliação das condições experimentais, como a largura da varredura de frequência.
- Aplicação da RPE de varredura rápida a 250 MHz, com possibilidade de uso em outras frequências.
Resultados Principais
- Demonstração da superioridade do RS-EPR em relação ao CW EPR na obtenção de imagens.
- Capacidade de adquirir mais informações em um período de tempo mais curto.
- Obtenção bem-sucedida de imagens de moléculas sensíveis ao estado redox e ao pH.
- Potencial para aplicações mais amplas na imagem in vivo.
Conclusões
- A RSE-PR representa um avanço significativo nas técnicas de imagem por RPE.
- Abre novas possibilidades para pesquisas em câncer e outras áreas biomédicas.
- Estudos futuros podem expandir sua aplicação em diversas frequências.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem por RPE de varredura rápida permite a avaliação quantitativa e em tempo real de parâmetros fisiologicamente críticos, como tensão de oxigênio, pH, estado redox e moléculas sinalizadoras reativas em sistemas vivos. Essa capacidade apoia a redução de riscos mecanicistas na pesquisa de oncologia e doenças inflamatórias, fornecendo leituras diretas das condições do microambiente que influenciam a resposta terapêutica e a resistência. A sensibilidade aprimorada, a resolução espacial e a velocidade de aquisição do método aumentam a confiança preditiva em modelos pré-clínicos, facilitando decisões mais precoces de avançar ou interromper estudos na validação de alvos e na otimização de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento da oxigenação, pH e dinâmica redox em modelos relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas e com resolução espacial de biomarcadores do microambiente para esclarecer a atividade de vias e o engajamento de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao correlacionar alterações no sinal da sonda com fenótipos funcionais, aumentando a confiança nas relações entre alvo e doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera imagens espectro-espaciais padronizadas e reprodutíveis de moléculas sinalizadoras de radicais sensíveis a estímulos fisiológicos.
- Saída Quantitativa: Fornece alterações de sinal dependentes da concentração para oxigênio, pH e espécies redox, permitindo perfis de resposta à dose e de inibição.
- Reutilização da Plataforma: Compatível com diversas moléculas de sonda (por exemplo, BMPO-OH para •OH, nitrânio para NO•, triarilmetila para pH) em múltiplos arranjos experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Imagens diretas da hipóxia tumoral, acidose e estresse oxidativo—marcas fundamentais da progressão do câncer e resistência à terapia.
- Continuidade Tradutiva: Conecta descobertas mecanicistas da fase inicial com validação pré-clínica ao monitorar os mesmos biomarcadores em diferentes modelos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite o acompanhamento longitudinal de alterações no microambiente para orientar esquemas de dosagem e estratégias de combinação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A RPE de varredura rápida insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos promissores e a avaliação de eficácia pré-clínica, especialmente quando a modulação do microambiente representa um mecanismo de ação ou um fator de resistência.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao visualizar como perturbações genéticas ou farmacológicas alteram os parâmetros de oxigênio, pH ou redox em modelos celulares e teciduais.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para compostos que modulam a sinalização hipóxica, vias antioxidantes ou enzimas reguladoras de pH por meio de deslocamentos EPR mensuráveis.
- Análises: Fornece medidas quantitativas e ratiométricas da intensidade do sinal da sonda e da forma espectral, permitindo comparações entre diferentes condições e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à relevância in vivo por meio da imagem dos mesmos detectores de radicais em sistemas fantasma e vivos.
- Reutilização Empresarial: Funciona como um módulo de imagem não destrutivo e pronto para uso, compatível com conjuntos de imagem pré-clínicos existentes e adaptável a diversas químicas de sondas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade nas contribuições do microambiente para o fenótipo.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a produtividade por meio de aquisição mais rápida e maior relação sinal-ruído em comparação com a RPE contínua (CW-EPR).
- Valor Estratégico: Aprimora a triagem de portfólio ao identificar compostos que falham devido a interações microambientais desfavoráveis já nos estágios iniciais do desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Permite a alocação de recursos ajustada ao risco, priorizando agentes com efeitos favoráveis na oxigenação tumoral, normalização do pH ou equilíbrio redox.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em espectroscopia de RPE, química de radicais e manipulação de amostras biológicas.
- Exige acesso a um espectrômetro de RPE de varredura rápida com ressonador de cruz de laço e capacidades de gradiente para imageamento 2D.
- Demanda padronização na preparação do sensor, calibração e controles ambientais (temperatura, umidade) entre diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes sensores de radicais (por exemplo, sensíveis a pH versus sensíveis a redox) e tipos de tecidos (fantasmas, ex vivo, in vivo).
- As limitações práticas incluem estabilidade do sensor, biodisponibilidade e possíveis sinais de fundo provenientes de radicais endógenos em matrizes biológicas complexas.
