Name: Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a monitorar o priming de neutrófilos em animais vivos usando repórteres fluorescentes e imagem intravital. Este método combina técnicas avançadas para visualizar comportamento celular em modelos de doenças raras.

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Os autores não têm agradecimentos.

Todos os experimentos com animais são realizadas de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Toledo. 1. A fenotipagem de pIL1-DsRed Mice NOTA: Offspring são gerados por meio de cruzamento ratos pIL1-DsRed heterozigotos com o tipo selvagem camundongos (WT) C57BL6. Três a quatro semanas filhotes velhos são considerados prontos para fenotipagem. Sangramento submandibulares de ratinhos segue um protocolo estabelecido com modificações menores 23. <ol><li> O isolamento de glóbulos brancos do sangue total de rato filhotes de cachorro <ol><li> Adicionar 20 ul de heparina a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adquirir um filhote da gaiola. Grave a etiqueta do filhote de identificação. Não é necessário para anestesiar filhotes antes de recolha de sangue a partir da veia submandibular. </li><li> Segure filhote de cachorro pela nuca do pescoço e perfurou a veia submandibular no thbolsa da bochecha e usando uma lanceta 5 mm. Aplicar uma força suficiente para criar um pequeno furo, de modo que as gotas de sangue exalam do ponto de penetração. Utilize uma agulha nova para cada filhote. </li><li> Recolhe 3 - 5 gotas de sangue por pup num tubo de microcentrífuga contendo heparina. Limpar o local da punção e aplicar pressão para facilitar a hemostasia. </li><li> Coloque cinzento em nova gaiola e observar durante 30 min antes de voltar a gaiola para a instalação para animais. </li><li> Recolha de sangue a partir de ratinhos adultos de um fenótipo conhecido como controlos positivos e negativos. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas do sangue a cada um dos tubos, os tubos de vórtice e incubar durante 5 - 10 min em gelo. </li><li> Adiciona-se lentamente 400 - 500 ul de soro de bovino fetal (FBS) por baixo das suspensões de células em cada tubo. Uma interface clara pode ser observado entre a suspensão de células da camada superior e a camada inferior de FBS. </li><li> tubos com tampas de amostras e centrifugar a 1.500 × g por 5 min. </li><li> Repita os passos 1.1.7 - 1.1.9 à peleterap remover as células vermelhas do sangue. Não repita se lise é suficiente pela primeira vez. O sedimento deve ser difícil de discernir, após a centrifugação. </li></ol></li><li> Lipopolissacarídeo (LPS) Estimulação e Cultura <ol><li> Ressuspender as células em 200 ul de completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Adicione LPS solução de trabalho através da mistura de 10 uL de solução de reserva de LPS (1 mg / ml) com 990 ul de meio RPMI 1640 completo. </li><li> Adicionar 20 ul de 10 ug / ml de LPS de solução de trabalho de 200 ul de suspensão de células. </li><li> Tampão tubos frouxamente e incubar as amostras durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Fluxo de Análise de Citometria <ol><li> Abra o programa de aquisição de dados para citometria de fluxo. Configurar o modelo de aquisição antes de provar aquisição. </li><li> Clique na ferramenta Dot-Plot na paleta ferramenta. Desenhar uma fodispersão rward (FSC) vs dispersão lateral (SSC) enredo. Defina os parâmetros de tensão FSC e SSC a escala linear. </li><li> Selecione os limites inferiores de FSC e SSC permitidos pelo citômetro. Aplicar limiares de 200 e 50 para o FSC e SSC, respectivamente. </li><li> Dentro do FSC vs SSC trama, desenhar um G1 portão que inclui monócitos, granulócitos e células dendríticas, e exclui detritos, células vermelhas do sangue e linfócitos. </li><li> Clique na ferramenta histograma na paleta ferramenta. Desenhar um histograma FL2 (canal de fluorescência vermelha). Usar uma amostra de controlo negativo para definir a linha de base dos sinais de FL2 e uma amostra de controlo positiva para desenhar um portão para incluir todos os eventos positivos DsRed. </li><li> No painel Fluidics Controle do citômetro, defina o modo fluido a &quot;RUN&quot; ea taxa de fluxo para &quot;HI&quot; (cerca de 60 mL / min). Adquirir 10.000 eventos para cada amostra. </li><li> Determinar pup fenótipo através da medição da percentagem de células positivas DsRed da porta G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. A indução da inflamação da pele em pIL1-DsRed Mice <ol><li> Anestesiar rato por injecção intraperitoneal (ip) de injecção de um cocktail anestésico contendo 100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg de xilazina, e 1 mg / kg de acepromazina. camundongos devidamente anestesiados não mostram retirada da pata traseira para pitada dedo do pé. </li><li> Aplique o creme de remoção de pêlos à superfície dorsal de ambas as orelhas do rato. Aguarde 30 segundos a 1 min. Limpe a superfície da orelha com algodão molhado em água e deixe secar ao ar. </li><li> Medir a espessura da orelha usando micrômetro e substituir rato em uma gaiola separada. Observar até à recuperação da anestesia (~ 15-30 min). Para resolver a inflamação da pele induzida pelo produto da remoção do cabelo, permitem mouse para descansar por 3 dias antes da experimentação adicional é realizada. </li><li> Prepare a 1,25% (w / v) OX dissolvendo 16,7 mg de OX em 1 ml de acetona e mistura de 750 ul de solução / acetona OX, com 250 ul de azeite. Preparar a solução de veículo através da mistura de 750 mL de acetona com 250 &amp;# 181; l de azeite. </li><li> Re-anestesiar o mouse através de injecção ip de cocktail anestésico (2,1). Medir a espessura da orelha como antes. </li><li> Aplicar 12,5 ul de 1,25% OX em cada lado da orelha direita. Aplicar 12,5 ul de solução veículo de acetona / azeite em cada lado da orelha esquerda. </li><li> Mantenha o mouse separar gaiola companheiros até que esteja totalmente recuperado para prevenir insulto aos seus ouvidos por outros ratos, em seguida, substituir o mouse em sua gaiola original e voltar a instalação de alojamento animal. NOTA: A remoção do cabelo pode resultar em inflamação de pele menor seguindo pela mudança da espessura da orelha. Esta inflamação menor será resolvido 3 dias mais tarde confirmada pela espessura do ouvido normal. Após a aplicação tópica, durante 24 h, tratada orelhas-OX mostram significativa (p &lt;0,01) em comparação inchaço solução de veículo sozinha ouvidos tratados. </li></ol> 3. Rotulagem de neutrófilos no pIL1-DsRed Mice NOTA: Na rotulagem vivo de neutrófilos pela baixa dose de fluorescence-conjugado mAb específicos de neutrófilos segue um protocolo recentemente desenvolvido 19. Injecções retro-orbital, são realizadas de acordo com um protocolo estabelecido com algumas modificações 24. <ol><li> Preparar solução de trabalho de anti-Ly6G mAb por diluição de 10 ul de 0,5 mg / mL de Alexa Fluor 647 conjugado com anti-Ly6G mAb (clone 1A8) em 90 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Transferir 100 ul da solução de trabalho Ly6G anti-mAb (50 ug / ml) para uma seringa de insulina U-100 com agulha de calibre 28. </li><li> Anestesiar um adulto pIL1-DsRed do mouse através de injecção ip do cocktail anestésico descrito anteriormente (2,1). Coloque o abdómen do rato anestesiado para baixo em uma placa de trabalho limpo. </li><li> Aplicar uma pressão descendente suave para a pele e dorsal ventral de um olho mouse para se projetam parcialmente o globo ocular da tomada. </li><li> Cuidadosamente colocar a agulha, o bisel para baixo, segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° no canto medial para a retro-orbitalseio. NOTA: O operador pode sentir a pressão, a penetração e resistência aliviada uma vez que as inserções de agulhas dentro do seio. </li><li> Lenta e suavemente injectar 100 ul de Ly6G mAb anti-solução (5 ug de mAb / murganho / injecção) no rato de trabalho. Remover a agulha rapidamente. Uma pequena quantidade de sangramento sugere uma injecção bem sucedida. </li><li> aplicar imediatamente 1,25% OX e solução de veículo para a orelha esquerda do rato e direita. </li><li> Após 8 h, administrar 100 ul de solução preparada de fresco de mAb anti-Ly6G de trabalho (5 ug de mAb / murganho / injecção) através de injecção retro-orbital no mesmo rato. </li><li> Para visualizar os vasos sanguíneos, imediatamente antes de imagem, administrar 100 ul de 30 mg / ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated dextrano (150 kDa) por meio de injecção de retro-orbital. </li></ol> 4. Imagem intravital de neutrófilos Priming em pIL-1-DsRed Mice <ol><li> Anestesiar rato com injeção ip de cocktail anestésico (2,1).0; Aplicar pomada veterinária para os olhos do mouse para evitar a secura sob anestesia para a imagem latente. <ol><li> Prepare 1 ml de meia-dose cocktail anestésico por diluição de 500 uL de mistura de anestésico original com um volume igual de PBS. </li><li> Transferir a metade da dose de cocktail de anestésico a seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 27 de borboleta. </li><li> Insira a agulha de borboleta no abdômen do rato por via intraperitoneal e corrigir a asa de borboleta para o abdômen gravando. </li></ol></li><li> Coloque uma lamela de vidro no centro da fase de imagem. Tape as bordas da lamela para segurá-la no lugar. </li><li> Colocar uma gota de PBS na superfície ventral da orelha de rato, bem como sobre a lamela. </li><li> Posição anestesiados rato com a sua orelha sobre a lamela. Montar a ponta da orelha, com o lado dorsal para baixo, como um sanduíche entre a orelha da lamela e uma lâmina de vidro, também mantida no seu lugar por meio de fita adesiva. </li><li> Ligue um multi-laser de microscópio de fluorescência confocal e todo o relacionado equipment. Desligue as luzes de quarto para minimizar a exposição de luz ambiente. </li><li> Abra o software de aquisição de imagem. Selecionar os canais de laser para detecção de corantes fluorescentes no menu Lista Dye. </li><li> Ajuste o foco na pele da orelha inflamado pela observação de sinais verdes dos vasos sanguíneos e sinais vermelhos das células DsRed + através da ocular. </li><li> Executar uma verificação rápida com velocidade de digitalização de 2 mS / pixel e resolução de 512 × 512 pixels. Selecione um pseudo para cada canal no menu Exibir Live. Ajuste o botão de foco para definir o fim e começar a localização da digitalização. </li><li> Realizar varreduras lentas com velocidade de digitalização de 4-8 ms / pixel e resolução de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Ajustar a alta tensão, ganhar, e deslocamento em cada canal para maximizar a intensidade de sinais, evitando saturação (pixels vermelhos). Deve haver apenas alguns pixels vermelhos em cada canal. </li><li> Criar conjuntos de imagens tridimensionais, digitalizando thpele e orelha começando superficialmente no estrato córneo e progredindo para baixo com x, y, os volumes z de 317 uM × 317 uM × 30 mm (objectiva 40x), 635 uM × 635 uM × 30 mm (objectiva 20x), ou 1.270 uM × 1.270 mm × 50 mm (objetiva de 10X) em 2 mm z-passos. NOTA: O estrato córneo é a camada mais externa da epiderme e pode ser facilmente localizado com base no seu sinal de autofluorescência forte. </li><li> Em experimentos com imagens de lapso de tempo, ficha imagens tridimensionais a cada 2 ou 4 min por até 8 horas. </li><li> De forma intermitente, como o rato começa a se recuperar da anestesia, observou baseada na observação de bigodes espasmos, administrar 5 - 10 l de meia dose cocktail anestesia através da agulha borboleta. NOTA: Tenha cuidado com a dose de anestesia - overdose pode causar a morte mouse. Alternativamente, a anestesia por inalação de um frasco pode ser aplicado para o rato para anestesia a curto prazo e umcone de nariz pode ser usado para imagiologia de longo prazo. </li><li> Remover o rato anestesiado do palco quando imaging está completa. Retire a fita e remover a agulha borboleta do abdómen do mouse. Devolver o mouse para uma gaiola separada na unidade de alojamento dos animais. NOTA: Para imagens de curto prazo (&lt;1 hora), os ratos se recuperar totalmente da anestesia rapidamente em 1-3 horas. Para imagiologia de longo prazo (~ 8 horas), os ratos recuperar lentamente, com um período de recuperação típico de 12 - 16 horas. Assim, a administração de água oral é recomendado, pelo menos várias vezes durante o período de recuperação para evitar a desidratação grave. </li><li> Conjuntos de dados de imagem de processo, rastrear células individuais, gerar rotas migratórias, e calcular a direção e velocidade de migração celular usando a imagem do software de análise 25. </li></ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse financeiros.

O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microscopia confocal ...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases 1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são &quot;preparada&quot; por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação 2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro 3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data. Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima 5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada 6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia 8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos. Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril 9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado 16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) 17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 - Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados - emergente em pele inflamada 18. In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 + neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus 19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes 20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce 21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação. IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados 22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. &lt;sup&gt; 18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.

<table><tbody><tr><td>Heparina</td><td>sódica APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampão de lise</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Church & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorpo anti-camundongo Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina U-100 com agulha 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de infusão de borboleta (agulha 27 G)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur citômetro</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Software</td><td>BD</td> Microscópio confocal BD <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem intravital de neutrófilos priming usando il-1-driven promotor dsred mice reporter

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed - usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos - alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.

Rastreio dos ratinhos pIL1-DsRed é realizada com base no sinal de fluorescência fenotípica DsRed produzido pelos seus leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Estimulação por LPS é capaz de induzir a produção de IL-1β em células mielóides, incluindo neutrófilos, monócitos, e células dendríticas 26-28. Assim, os leucócitos isolados foram incubados com LPS durante 4 h antes da análise de citometria de fluxo. Em seguida, é definida para propagação de células mieló...

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos. Este método pode ajudar a responder às questões-chave no campo da imunologia, como a visualização do comportamento e a função de preparar os neutrófilos em modelos animais de doenças e distúrbios mais raros. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina três metodologias estabelecidas, incluindo repórteres fluorescentes em marcação viral e imagens intravitais.Crie camundongos pIL1-DsRed heterozigotos com camundongos C57Black seis do tipo selvagem. Com três a quatro semanas, fenótipo de seus filhotes. Para cada filhote, prepare um tubo de 1,5 mililitro com 20 microlitros de heparina.Para coletar sangue, segure um filhote pela nuca e perfure a veia submandibular na bolsa da bochecha usando uma lanceta de 5 milímetros. Apenas uma pequena punção é necessária. Colete de três a cinco gotas de sangue por tubo.Depois de fazer a coleta, certifique-se de estancar o sangramento e observar os animais por 30 minutos antes de devolvê-los ao biotério. Para cada tubo de amostra, adicione 500 microlitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Em seguida, faça um vórtice dos tubos e incube-os por cinco a 10 minutos no gelo.Após a incubação, adicione lentamente 400 a 500 microlitros de soro fetal bovino sob as suspensões celulares em cada tubo. Uma interface clara deve se formar entre as camadas. Em seguida, centrifugue as amostras a 1.500 Gs por cinco minutos para coletar pellets de células.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de meio RPMI-1640 completo. Em seguida, transfira cada suspensão para um tubo de citometria de fluxo e adicione 20 microlitros de solução de trabalho LPS recém-feita a cada tubo. Incubar as amostras durante quatro horas antes de efectuar a citometria de fluxo.Para começar, anestesiar o camundongo com uma injeção intraparetoneal de um coquetel anestésico e confirmar a sedação adequada com um teste de pinça do dedo do pé. Em seguida, aplique o creme depilatório na superfície dorsal de ambas as orelhas, limpe-o em um minuto e lave a pele com água. Meça a espessura da orelha onde as aplicações foram feitas usando um micrômetro.Mais tarde, devolva o camundongo em sua própria gaiola depois de se recuperar da anestesia e deixe-o descansar por pelo menos três dias antes de fazer novos testes. Após três dias, reanestize o mouse e meça a espessura da orelha novamente para garantir que não esteja irritada. Em seguida, aplique 12,5 microlitros de 1,25% de oxazolona em cada lado da orelha direita e aplique 12,5 microlitros da solução veículo de azeite de acetona em cada lado da orelha esquerda.Como sempre, observe o camundongo se recuperar da anestesia. 24 horas depois, meça a espessura da orelha novamente sob anestesia para garantir que a inflamação da pele induzida por oxazolona ocorreu. Para começar, transfira 100 microlitros de anticorpo monocolonal XG anti-lisse para uma seringa de insulina U100 com uma agulha de calibre 28.Em seguida, anestesiar um camundongo tratado conforme descrito anteriormente. Com o abdômen do camundongo para baixo, aplique uma leve pressão para baixo na pele dorsal e ventral em um olho para projetar parcialmente o globo ocular. Em seguida, coloque cuidadosamente a agulha, chanfre para baixo, aproximadamente 30 graus em relação ao canto medial e insira cuidadosamente a agulha no seio retroorbital.A pressão de penetração será aliviada quando a agulha entrar no seio. Em seguida, ejete o conteúdo e remova a agulha rapidamente. Uma pequena quantidade de sangramento sugere injeção bem-sucedida.Agora, aplique imediatamente 1,25% de oxazolona e solução veicular nas orelhas direita e esquerda do rato como antes. Oito horas depois, administre uma segunda dose do mesmo anticorpo em cada camundongo. Além disso, para visualizar os vasos sanguíneos, administre retroorbitalmente 100 microlitros de fitc dextran.Para este procedimento, primeiro anestesie o mouse como antes. Em seguida, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a imagem. Em seguida, coloque uma lamínula de vidro no centro de um estágio de imagem e prenda as bordas da lamínula com fita adesiva.Além disso, adicione uma gota de PVS à lamínula. Agora, posicione a orelha do mouse sobre a lamínula, com o lado dorsal voltado para baixo. Em seguida, umedeça a superfície ventral da orelha do camundongo com uma gota de PVS.Em seguida, monte a ponta da orelha com uma lâmina de vidro na parte superior e prenda a lâmina com fita adesiva. Agora, ligue um microscópio confocal de fluorescência multilaser e o equipamento relacionado. Desligue as luzes da sala para minimizar a exposição à luz ambiente.Em seguida, registre imagens tridimensionais usando o microscópio confocal. Para experimentos de imagem com lapso de tempo, registre imagens tridimensionais a cada dois a quatro minutos por até oito horas. O tempo todo, observe se há bigodes se contraindo, o que indica que o mouse está começando a se recuperar da anestesia.Em tais situações, administrar de cinco a 10 microlitros de meia dose de coquetel anestésico por meio de uma agulha borboleta. Camundongos pIL-1-DsRed foram rastreados para fluorescência fenotípica de DsRed produzida em leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. As células mielóides circulantes de camundongos do tipo selvagem expressam minimamente DsRed, enquanto as mesmas células de camundongos pIL1-DsRed expressam sinais DsRed distinguíveis.A ativação do promotor beta de IL-1 é um marcador de priming de neutrófilos e pode ser melhor visualizada em camundongos pIL-1DsRed vivos. Em seguida, um sensibilizador cutâneo, oxazolona, foi aplicado topicamente na orelha direita. Posteriormente, os neutrófilos foram marcados antes e após uma segunda aplicação do sensibilizador de oxazolona via injeção retroorbital.Da mesma forma, fitc dextrana foi injetado para localizar vasos sanguíneos. Muitas células duplamente marcadas foram encontradas no espaço extravascular, que representam neutrófilos preparados. Um pequeno número de células foi marcado apenas pelo anticorpo lisa XG, que provavelmente eram neutrófilos em repouso.Além disso, foi observada uma pequena população de células DsRed positivas, que podem ser compostas por monócitos inflamatórios e macrófagos ativados. As rotas migratórias celulares foram rastreadas para comparar as duas populações de neutrófilos. Ambas as populações de neutrófilos mostraram uma migração aleatória uma vez que o espaço extracelular foi inserido.Curiosamente, os neutrófilos supostamente preparados exibiram uma velocidade significativamente maior em comparação com suas contrapartes supostamente em repouso. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia. Dois exploram o comportamento e a função de muitas células imunes em vários estados inflamatórios envolvendo diferentes células T.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar o processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este vídeo demonstra imagens in vivo para estudar a dinâmica de recrutamento de neutrófilos em um local de infecção em um camundongo transgênico imunocomprometido com neutrófilos que expressam GFP. Envolve a injeção de bactérias luminescentes para causar uma infecção. Isso leva ao recrutamento de neutrófilos para o local da infecção, cujo rastreamento é feito por imagem.

Monitoramento da dinâmica de recrutamento de neutrófilos e carga bacteriana no local da infecção em um modelo murino

Este vídeo demonstra uma técnica in vivo para avaliar um antígeno de teste induzindo inflamação da pele em um modelo murino. O antígeno de teste - um hapteno em uma solução de óleo / acetona - é aplicado topicamente na pele da orelha do camundongo e a inflamação da pele é avaliada após um período adequado.

Uma técnica para avaliar a resposta imune contra um antígeno induzindo inflamação da pele

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

Aprenda a monitorar o priming de neutrófilos em animais vivos usando repórteres fluorescentes e imagem intravital. Este método combina técnicas avançadas para visualizar comportamento celular em modelos de doenças raras.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

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