Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide
16 de outubro de 2016
Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.
O objetivo geral deste experimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas, ou IPCs, a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos isolados do tecido sinovial de uma articulação inflamada com artrite reumatóide. Atualmente, os iPSCs podem ser gerados a partir de várias células primárias humanas. Geramos com sucesso iPSCs a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos humanos, que são as principais células patológicas das articulações reumatóides.
Isso pode ajudar a investigar a patologia da artrite reumatóide. Este periódico pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a degeneração de IPSCs, usando RA-FLSs. Comece colocando o tecido sinovial em um prato de 100 milímetros e lavando o tecido com 5 mililitros de PBS suplementado com antibióticos.
Remova o tecido adiposo amarelado e o resíduo ósseo. Em seguida, transfira o tecido aparado para um poço de uma placa de seis poços contendo 5 mililitros de DMEM suplementado com FBS e use uma tesoura para picar o tecido até que os pedaços sejam pequenos o suficiente para penetrar em uma ponta de pipeta descartável. Transfira o meio para um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, adicione 5 mililitros de DMEM fresco mais FBS ao poço para coletar qualquer tecido restante e transferir todo o conteúdo do poço para o tubo.
Em seguida, adicione colagenase descongelada com gelo a uma concentração final de 0,01% ao tubo e sele o tubo com parafilme para incubação em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação. Após quatro horas, encher o tubo com DMEM fresco mais FBS até um volume final de 50 mililitros e coletar os fragmentos de tecido por centrifugação. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e, em seguida, ressuspender as células em 40 mililitros de meio fresco para uma nova centrifugação.
Ressuspenda o segundo pellet em 25 litros de DMEM fresco mais FBS e deixe os grandes aglomerados de tecido assentarem. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo prato de 100 milímetros e incube os sinoviócitos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 14 dias. Para expandir a cultura de sinoviócitos, descarte o meio usado e lave as células em 5 mililitros de PBS.
Remova o PBS e dissocie as células com 1 mililitro de EDTA na incubadora de cultura de células por 2 minutos. No final da incubação, bata suavemente no prato para separar as células aderentes restantes e transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspenda o pellet em 30 mililitros de DMEM e FBS e divida as células em 3 novos pratos de 100 milímetros.
Alimente os sinoviócitos com meio fresco a cada 3 dias, dividindo as células em 3 novas culturas a 80% de confluência, como acabamos de demonstrar. No dia zero de transdução, veja 3 x 10 elevado ao 4º FLS por poço em uma placa de 6 poços em meio de crescimento fresco para uma incubação noturna a 37 graus Celsius em 5% de CO2. No dia seguinte, descongele 1 frasco de Lenti-virus contendo 4 fatores Yamanaka a 4 graus Celsius e substitua o meio de cultura FLS por meio de crescimento FLS suplementado com brometo de hexadimetrina e ácido ascórbico.
Quando o conteúdo do frasco tiver descongelado, adicione 30 microlitros de lenti-vírus às células e misture suavemente para distribuir homogeneamente o vírus. Para melhorar a infecção, centrifugue a placa e retorne as células à incubadora, substituindo o meio todos os dias por meio de crescimento FLS fresco contendo butirato de sódio e ácido ascórbico por 3 dias. No 4º dia, substitua o meio por uma mistura de FLS growth e meio iPSC contendo butirato de sódio e ácido ascórbico.
No dia 5, adicione 60 microlitros de vitronectina a 6 mililitros de PBS sem cálcio e magnésio e cubra 3 poços de uma placa de 6 poços com 2 mililitros da solução cada por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Enquanto a vitronectina está endurecendo, lave as células transduzidas com PBS e separe-as com EDTA, conforme demonstrado. Depois de coletar as células dissociadas por centrifugação, ressuspenda o pellet em 900 microlitros de meio fresco.
Remova o excesso de vitronectina dos poços e adicione 300, 150 e 100 microlitros de células em poços individuais. Em seguida, retorne as células à incubadora, substituindo o meio diariamente por meio iPSC fresco até que as colônias apareçam. Para colher as colônias, primeiro adicione 500 microlitros de meio iPCS, suplementado com inibidor de ROCK a cada poço de uma placa de 48 poços revestida com vitronectina.
Em seguida, coloque as culturas FLS sob um microscópio de dissecação em uma bancada limpa e use uma ponta de pipeta de 10 microlitros para cortar ao redor de uma colônia de interesse. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, transfira a colônia escolhida para 1 poço da placa de 48 poços. Quando todas as colônias tiverem sido colhidas, coloque a placa na incubadora de cultura de células até que as colônias sejam grandes o suficiente para a transferência.
Dividir as células quando as colônias estão fora do campo visível do microscópio, conforme visto com ampliação de 100X. Nesta imagem, a morfologia do FLS isolado após uma cultura inicial de 14 dias pode ser observada. As células exibem as características dos fibroblastos em geral com uma expressão semelhante dos marcadores fibróticos vimentina e fibronectina, bem como uma baixa expressão do marcador de sinoviócito semelhante a macrófagos CD-68,8 a 11 dias após a transdução lenti-viral do fator Yamanaka, começam a aparecer pequenas colônias que podem ser captadas e amplificadas por 5 a 10 passagens.
Esses iPSCs de artrite reumatóide expressam fosfatase alcalina, indicando que permanecem indiferenciados. As células também expressam marcadores pluripotentes, conforme confirmado por RT-PCR e análise de imunofluorescência. Os iPCS de artrite reumatóide exibem um padrão cromossômico normal de 44 + XY, conforme determinado por cariótipo.
Além disso, 12 semanas após a injeção em camundongos SCID, a artrite reumatóide iPSC formou teratoma, que exibe diversos fenótipos de tecido. Com sua diferenciação da camada germinativa confirmada por coloração imunofluorescente. Uma vez dominados, os iPSCs podem ser gerados a partir de FLSs com sinóvia.
Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como isolar do tecido sinovial e como induzir a reprogramação usando-os. Esses iPSCs derivados de RAF-FLS podem ser úteis para estudar regeneração ou triagem de drogas em reumatologia. Uma vez que esses iPSCs são estabelecidos, vários tipos de células-alvo ou órgãos podem ser gerados.
O que pode ser útil para estudar a doença ou outras aplicações futuras, como edição de genes e assim por diante.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes com artrite reumatoide. O método utiliza um sistema lentiviral sem células de apoio, facilitando o estudo da patologia da artrite reumatoide.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Reumatologia
- Reprogramação Celular
Contexto
- Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem ser derivadas de várias células primárias humanas.
- Os sinoviócitos semelhantes a fibroblastos são células patológicas-chave na artrite reumatoide.
- Compreender a geração de iPSCs a partir dessas células pode auxiliar no estudo dos mecanismos da doença.
- Esta pesquisa pode fornecer insights sobre a degeneração de iPSCs utilizando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos da artrite reumatoide (RA-FLSs).
Objetivo do Estudo
- Gerar iPSCs a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes.
- Investigar a patologia da artrite reumatoide.
- Desenvolver um protocolo que não exija células de apoio (células alimentadoras).
Métodos Utilizados
- Isolamento de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide.
- Lavagem do tecido com PBS suplementado com antibióticos.
- Utilização de um sistema lentiviral para reprogramação de células.
- Cultivo de iPSCs derivadas para análises adicionais.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de iPSCs a partir de sinoviócitos com aspecto fibroblástico.
- Demonstração da viabilidade do protocolo sem células de apoio.
- Potencial para pesquisas futuras sobre a patologia da artrite reumatoide.
- Contribuição para o entendimento da degeneração de iPSCs utilizando FLSs-AR.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para gerar iPSCs a partir de pacientes com artrite reumatoide.
- Essa abordagem pode aprimorar o estudo dos mecanismos da doença e de terapias potenciais.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar aplicações de iPSCs na medicina regenerativa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A geração de iPSCs específicas para o paciente a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos permite a redução mecanicista de riscos na validação de alvos na artrite reumatoide, fornecendo um sistema relevante à doença para triagem fenotípica. Esta abordagem apoia a identificação de compostos líderes por meio de modelos escaláveis e reprodutíveis que refletem a fisiopatologia do paciente, melhorando a confiança preditiva nas decisões pré-clínicas. O método aumenta a continuidade translacional desde a descoberta até as fases pré-clínicas, fornecendo sistemas celulares validados para investigação de alvos e alinhamento de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando células derivadas de pacientes que mantêm os contextos genéticos e epigenéticos específicos da doença.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte renovável de células humanas para a validação funcional de alvos, sem dependência de modelos animais ou linhagens imortalizadas.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos biológicos ao permitir a avaliação da modulação de alvos em um contexto celular relevante para a doença, antes da otimização do composto líder.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados adequados para padronização de ensaios e leituras quantitativas em estudos de engajamento de alvo.
- Valor Operacional: Fornece plataformas celulares reprodutíveis e escalonáveis que reduzem a variabilidade no triagem de compostos e permitem consistência entre laboratórios.
- Valor Científico: Facilita a preparação de células relevantes para doenças, destinadas a triagens fenotípicas downstream e campanhas de identificação de compostos líderes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença por meio de iPSCs específicas do paciente que podem ser diferenciadas em linhagens sinoviais ou cartilaginosas para estudos mecanicistas.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, utilizando modelos celulares isogênicos e pareados com o paciente.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, permitindo a avaliação dos efeitos do alvo em células que refletem o ambiente articular inflamatório.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer sistemas celulares relevantes para a doença, utilizados na validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e modelagem pré-clínica, cujos resultados orientam a identificação de compostos líderes e decisões de triagem de portfólio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias utilizando células derivadas de pacientes que modelam a hiperplasia sinovial e a invasividade da artrite reumatoide.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de culturas padronizadas e expansíveis derivadas de iPSCs, que suportam a medição quantitativa de fenótipos celulares.
- Análises: Fornece indicadores de pluripotência e diferenciação (por exemplo, fosfatase alcalina, RT-PCR, imunofluorescência) que ajudam a comparar a eficiência de reprogramação e a identidade celular entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao gerar iPSCs capazes de formação de teratoma e diferenciação multilinhagem, validando sua utilidade para modelagem de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de gerar iPSCs específicos do paciente a partir de tecido sinovial, aplicável a múltiplas amostras de pacientes com AR e projetos de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio de modelos celulares relevantes para a doença que reduzem a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padronização e escalabilidade por meio da reprogramação com lentivírus sem células alimentadoras, simplificando os fluxos de trabalho de cultura.
- Valor Estratégico: Decisões mais assertivas de prosseguir ou interromper projetos, ao permitir a avaliação precoce dos efeitos do alvo em células derivadas de pacientes, reduzindo riscos biológicos em fases avançadas.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco mediante o uso de modelos isogênicos e específicos do paciente que refletem a fisiopatologia real da doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em isolamento de células primárias, transdução viral e cultivo de células-tronco pluripotentes.
- Depende da produção de vetores lentivirais, infraestrutura de biossegurança e triagem de células ativada por fluorescência ou microscopia para seleção de colônias.
- Necessita padronização entre equipes para o processamento de tecidos, monitoramento da eficiência de reprogramação e controle de qualidade das linhagens de iPSCs.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a diferentes amostras de tecido sinovial ou estados patológicos além da artrite reumatoide.
- Limitado pela disponibilidade de tecido sinovial de pacientes e pelo tempo necessário para caracterização e expansão de iPSCs antes do uso posterior.
