Name: Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos de pacientes com artrite reumatóide usando um sistema lentiviral sem células alimentadoras. Este método facilita o estudo da patologia da doença.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças da Coreia (HI13D2188).

Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861). 1. Isolamento e sinoviito de expansão <ol><li> Isolamento sinoviï¿½ito <ol><li> Esterilizar dois pares de tesouras cirúrgicas e um par de fórceps. </li><li> Transferir o tecido sinovial para uma placa de 100 mm e lava-se com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Cortar os resíduos de tecido de gordura e ossos amarelados. Transferir o tecido cortado para um poço de uma placa de 6 poços e adicionam-se 5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 20% (FBS). </li><li> Pique os tecidos com a tesoura até que as peças são pequenas o suficiente para penetrar uma pipeta descartável. </li><li> Transferir o meio contendo tecido para um tubo cónico de 50 ml. Colher o material remanescente por adição de 5 ml de DMEM com FBS a 20% para a placa de 6 poços e, em seguida, transferir para o tubo. &lt;/ Li&gt; <li> colagenase Thaw no gelo. Adicionar a colagenase a uma concentração final de 0,01% e selar o tubo com parafilme. Incubar em um banho de água a 37 ° C com agitação durante 4 h. </li><li> Após a incubação, encher o tubo com o meio DMEM com FBS a 20%, até que o volume total é de 50 ml e centrifugar a 300 xg, à ta durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicione 40 ml de meio para ressuspender o sedimento. </li><li> Repita os passos 1.1.10-1.1.11. </li><li> Ressuspender o sedimento em 25 ml de DMEM com 20% de FBS e esperar que as grandes aglomerações de tecido para desviar para o fundo. </li><li> Transferir o sobrenadante para uma placa de 100 mm e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 14 dias. </li></ol></li><li> Sinoviï¿½ito Manutenção e Expansão <ol><li> Descartar os meios utilizados a partir da placa e lavar as células com 5 ml de PBS. </li><li> Adicionar EDTA 1 ml de PBS / 1 mM e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Toque o prato delicadamente e transfer as células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células a 250 xg, TA, durante 2 min. </li><li> Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 30 ml de DMEM com 20% de FBS. </li><li> Transferir as células a 3 x 100 mm, sem deixar qualquer material restante visível. </li><li> Substituir a mídia com meios frescos a cada 3 d. Dividir as células a 80% de confluência utilizando EDTA 1 ml de PBS / 1 mM. Manter até 3 de passagem antes do uso. Divida cada prato de células em 3 pratos em cada divisão. NOTA: Depois de alcançar passagem 3, as células que não estão indo para ser utilizado de imediato pode ser congelado. </li></ol></li></ol> 2. Reprogramação FLSS Usando lentivírus que codificam fatores de Yamanaka <ol><li> Transdução (D0) <ol><li> Seed 3 x 10 4 culas por po de uma placa de 6 poços em meio de crescimento (500 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina). Incubar as células O / N a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> No dia seguinte, remover um frasco de lentivírus contendo 4 Yamanaka factores: Oct4, KLF4, Sox2 e c-Myc a partir do congelador e descongelamento, a 4 ° C. Nota: Lentivírus foi produzido pelo processo descrito no nosso estudo anterior 11. </li><li> Enquanto o descongelamento do vírus, alterar os meios de comunicação para a mídia de crescimento FLS (20% FBS além de antibióticos em DMEM) contendo / ml de brometo de Hexadimetrina 10 mg e ácido ascórbico 50 mg / ml. </li><li> Depois de alterar a mídia, adicionar 30 ul de lentivírus para as células e misture delicadamente. Para melhorar a infecção Centrifugar a placa a 680 x g, 35 ° C durante 30 min. </li><li> Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Manutenção Até reprogramação é visível <ol><li> Durante 3 dias, substitui os meios diariamente com meio de crescimento FLS contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml. </li><li> No dia seguinte, substituir a mídia com uma mistura de meios de crescimento FLS emeios iPSC (proporção 1: 1) contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml. Nota: Os componentes dos meios iPSC é dada na lista de materiais / equipamentos. </li></ol></li><li> As células de divisão de Formação de Colónias <ol><li> Prepara-se uma placa de 6 poços revestidas com vitronectina. <ol><li> Adicionar 60 ul de vitronectina a 6 ml de PBS, sem Ca 2+ e Mg 2+. Coloque 2 ml de cada mistura em poços e incuba-se temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Nota: A concentração de trabalho de vitronectina é de 5 ug / mL. </li></ol></li><li> No D5, lavar as células com PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS / 1 mM EDTA para separar as células e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Colheita das células e centrifugar a 250 xg, TA, durante 2 min. </li><li> Dividir as células em 3 diferentes proporções (1: 3, 1: 6 e 1: 9) para se conseguir diferentes confluencies. Adicionar 900 ul de meios de comunicação para a pelete de células e ressuspender. Adicionar 300, 150, e 100 uL da mistura de células por poço de uma 6-bem placa para conseguir uma proporção de 1: 3, 1: 6, e 1: 9, respectivamente. </li><li> Substitua os meios de comunicação diária com a mídia IPSC até colónias aparecer. Colónias aparece após cerca de D18. Nota: Nesta fase, as colónias IPSC co-existir com o FLSS não reprogramada. </li></ol></li><li> picking Colony <ol><li> Prepara-se uma placa revestida com vitronectina de 48 poços por adição de 500 ul de vitronectina aos poços, e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li><li> Coloque o microscópio sobre uma bancada limpa, e remover a placa de 6 poços da incubadora. </li><li> Remover a solução de vitronectina a partir da placa de 48 poços e adicionar 500 ul IPSC meios suplementados com 10 mM de Rho-associado, em espiral enrolada contendo proteína cinase (ROCHA) inibidor. </li><li> Usando uma ponta 10p pipeta, corte em torno da colônia. Transferir a colónia escolhido para um poço da placa de 48 poços. </li><li> Depois de escolher várias colónias, incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Manter as células até que as colónias são grandes enough para transferência. Nota: Normalmente as células derramado quando a colónia fica fora do campo visível do microscópio, quando visto uma ampliação de 100X. </li></ol></li></ol> 3. Imunofluorescência Coloração <ol><li> Preparação de Células <ol><li> Colocar uma tampa de vidro 18 milímetros estéril para uma placa de 12 poços. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS para esfriar e lave a tampa de vidro. </li><li> Substituir com 1 ml de uma solução / 10 ug mL de vitronectina. </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li><li> Descartar a solução vitronectina e iPSCs placa na placa de 12 poços revestida com vitronectina e cultura durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO 2, mudando os meios diariamente. </li></ol></li><li> A coloração celular <ol><li> Descartar o meio de cultura e lava-se as células uma vez com PBS. </li><li> Fixar as células em 0,4% de paraformaldeído (PFA) durante 30 min à TA. </li><li> Permeabilizar as células com 0,1% de Triton X-100 durante 5 min à TA. </li><li> Remover a permeabilizaçãosolução e bloco com PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se a anticorpos em PBS contendo BSA a 2% de acordo com a Tabela 1. Incubam-se as células com os anticorpos primários durante 2 h à RT. </li><li> Adicionar o anticorpo secundário (diluído 1: 200) e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente, evitando a luz. </li><li> Tratar as células com 1 ul / ml de DAPI durante 10 min. </li><li> Colocar a tampa de vidro na parte superior da lâmina de vidro com antifade reagente e incubar à TA durante 24 horas, evitando a luz. </li><li> Verificar a expressão com um microscópio de fluorescência. </li></ol></li></ol> 4. em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) <ol><li> Extrair ARNm a partir do sedimento celular utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção 11. </li><li> Amplificar o ADNc a partir de 2 ug de ARNm total usando transcrição reversa 11. </li><li> Misturar os componentes necessários para a PCR utilizando 2 ul de ADNc de METplaca 11. </li><li> Execute RT-PCR e verificar os resultados por eletroforese em gel de 11. </li></ol> 5. fosfatase alcalina (AP) Coloração <ol><li> IPSCs cultura durante 5-7 dias a 37 ° C, 5% de CO 2 antes da coloração. </li><li> Aspirar os meios de comunicação e corrigir as células com PFA 4% durante 1 min. </li><li> Descartar o fixador e lavar as células com tampão de lavagem 1X. </li><li> Prepare os reagentes para coloração com AP. Misturar os reagentes nas seguintes proporções Fast Red Violet: solução de fosfato de Naftol AS-BI: água = 2: 1: 1. </li><li> Incubam-se as células com a solução de coloração à TA durante 15 min, evitando a luz. </li><li> Descartar a solução de coloração e lavar as células com tampão de lavagem. </li><li> Cobrir as células com PBS para evitar a secagem e verificar a expressão utilizando um microscópio de campo brilhante. </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Antes da descoberta da iPSCs, os cientistas usaram principalmente os CES para estudar a biologia de células-tronco e outras linhagens de células através da diferenciação. No entanto, os CES originam a partir da massa interna de um blastocisto, que é um embrião de fase inicial. Para isolar os CES, a destruição do blastocisto é inevitável, levantando questões éticas que são impossíveis de superar. Além disso, embora os CES têm características stemness e pluripotência, eles não podem ser obtidos a partir de indivíduos e às...

células-tronco pluripotentes são a plataforma de próxima geração em vários campos clínicos e biológicos. Eles são uma ferramenta promissora que podem ser utilizados nos modelos de doença, o rastreio de drogas, e a terapia médica regenerativa. Human Embryonic Stem Cells (hESCs) foram usados ​​principalmente para estudar e compreender células pluripotentes. No entanto, isolado pela destruição do blastocisto humano, hESCs estão associados com vários problemas éticos. Em 2007, o Dr. Shinya Yamanaka e sua equipe reverteu o processo de programação celular e desenvolveu células-tronco de adultos humanos células somáticas 1,2. Portanto, ao contrário de hESCs, induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) podem ser gerados a partir de células somáticas adultas, evitando os obstáculos éticos. Normalmente, iPSCs são gerados através da entrega de quatro genes exógenos: Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc. Esses fatores Yamanaka são originalmente entregues usando sistemas de lentivírus e retrovirais. Os primeiros iPSCs foram derivadas de rato c somáticaells 3. Mais tarde, a técnica foi aplicada para fibroblastos dérmicos humanos 1,2. Estudos subsequentes com êxito iPSCs gerado a partir de várias fontes, tais como urina 4, sangue 5,6, queratinócitos 7, e vários outros tipos de células. No entanto, existem algumas células somáticas que não foram utilizados na reprogramação, e rastreio das capacidades de reprogramação de vários tipos de células específicas de tecidos no estado de doença, é ainda necessária. A artrite reumatóide (AR) é uma doença que pode atingir todas as articulações e levar a doenças auto-imunes em outros órgãos. RA afeta cerca de 1% dos adultos no mundo desenvolvido. É uma doença bastante comum e sua incidência aumenta a cada ano 8. No entanto, o RA é difícil identificar nas fases iniciais e oncebone destruição ocorre não há nenhum tratamento que pode recuperar o dano. Além disso, a eficácia do fármaco varia de paciente para paciente, e que é difícil prever a medicINE que é necessário. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de um método de rastreio de drogas, e um material de célula que pode reflectir as condições da AR é necessária. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) é um participante ativo celular na patogênese da AR 9,10. FLSS existem no revestimento sinovial da íntima entre a cápsula e a cavidade articular, a qual também é referida como a membrana sinovial. Ao apoiar a estrutura conjunta e fornecer nutrientes para a cartilagem circundante, FLSS geralmente desempenham um papel crucial na função e manutenção conjunta. No entanto, FLSS na AR têm um fenótipo invasivo. RA FLSS têm um fenótipo de câncer, como, eventualmente, destruir o osso circundante por uma proliferação infinita 10. Com esta característica única, FLSS pode ser usado como um material promissor que pode reflectir a patobiologia de RA. No entanto, estas células são raramente produzidos, e os fenótipos celulares como alterar as células passam por várias passagens in vitro </em&gt; condições. Portanto, pode ser complicado de usar RA FLSS como uma ferramenta que pode representar o estado do paciente. Teoricamente, RA iPSCs derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pode se tornar uma ferramenta ideal para o rastreio de drogas e novas pesquisas. IPSCs gerados têm capacidade de auto-renovação e pode ser mantido e expandido in vitro. Com pluripotência, essas células podem ser diferenciadas em linhagens de condrócitos e osteócitos maduras, que podem contribuir material celular para a pesquisa específica na AR e outras doenças relacionadas com os ossos 11. No presente estudo, nós demonstramos como isolar e expandir FLSS a partir de uma membrana sinovial removido cirurgicamente, e como gerar RA-iPSCs de FLSS usando lentivírus que contêm factores Yamanaka.

<table><tbody><tr><td>Prato de 100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Tubo córnico de 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Tubo córnico de 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta descartável de 10 ml</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta descartável de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS Materiais de Isolamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td>Cirúrgica</tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>Cirúrgica</tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>iPSC Generation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>ingrediente de mídia iPSC (500 ml)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 543 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Selenito de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>ingrediente de mídia iPSC&nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr>Ingrediente de mídia iPSC <td>Aldrich</td><td>T3705</td> da <td>Transfferin Sigma Humana</td><td>(Conc.: 10.7 &mu; g/ml)</td></tr> <tr><td>Ingrediente básico da mídia FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC (Conc.: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 20 &mu; g/ml)</td></tr> <tr><td>TGF&beta humano; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A8960</td><td>ingrediente de mídia iPSC&nbsp; (Conc.: 64 &mu; g/ml)</td></tr> <tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inibidor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais de Controle de Qualidade</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Vidro de Cobertura</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde (PFA)</td> <td>Tecnologia & Inovação</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo IgG (H+L) de cabra Ponta</td> de <td>prova molecular</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo IgG (H+L) de cabra anti-coelho</td><td>Sonda molecular</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>A ponta de prova molecular</td><td>D1306</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de DAPI prolonga o reagente antifade do ouro</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Vidro da corrediça, revestido</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Kit de Síntese de cDNA de Fita</td><td>Inicial Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polimerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>estrela de carregamento</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) marcador de escada de DNA</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de células-tronco pluripotentes induzida por usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

células somáticas adultas pode ser revertida em um estado de células estaminais pluripotentes-like usando um conjunto definido de fatores de reprogramação. Numerosos estudos têm gerado induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) a partir de vários tipos de células somáticas por transdução de quatro Yamanaka fatores de transcrição: Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc. O estudo das iPSCs permanece na vanguarda da pesquisa biológica e clínica. Em particular, iPSCs específicos do paciente pode ser usado como uma ferramenta para o estudo pioneiro de patobiologia doença, uma vez que iPSCs pode ser induzida a partir do tecido de qualquer indivíduo. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crónica, classificada pela destruição da cartilagem e do osso na estrutura da articulação. hiperplasia sinovial é uma das principais razões ou sintomas que levam a estes resultados em RA. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) são as principais células de componentes na membrana sinovial hiperplásica. FLSS na articulação limitlessly proliferam, eventualmente, invadindo o CARTIL adjacenteidade e osso. Actualmente, a sinóvia hiperplásica só pode ser removido por um procedimento cirúrgico. A sinóvia removido é utilizado para a investigação AR como um material que reflecte a condição inflamatória da articulação. Como um jogador importante na patogênese da AR, FLSS pode ser usado como um material para gerar e investigar as iPSCs de pacientes com AR. Neste estudo, foi utilizado o FLSS de um paciente com AR para gerar iPSCs. Utilizando um sistema de lentivírus, descobrimos que pode gerar FLSS RA iPSC específica para cada paciente. As iPSCs gerados a partir FLSS pode ser ainda utilizado como uma ferramenta para estudar a patofisiologia da RA no futuro.

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo para gerar iPSCs de FLSS usando um sistema lentiviral. A Figura 1A mostra um esquema simples do protocolo de isolamento FLS. A seguir à remoção cirúrgica da membrana sinovial, o tecido foi cortado em pequenos pedaços utilizando uma tesoura cirúrgica. A colagenase foi adicionado para isolar as células dos aglomerados de tecido. As células foram incubadas durante 14 dias antes de processamento adicional. A Figura ...

Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.

Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

O objetivo geral deste experimento é gerar células-tronco induzidas pluripotentes, ou CIPs, a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos isolados do tecido sinovial de uma articulação inflamada por artrite reumatoide. Atualmente, CIPs podem ser geradas a partir de várias células primárias humanas. Geramos com sucesso CIPs a partir de sinoviócitos humanos semelhantes a fibroblastos, que são as células patológicas-chave das articulações reumatoides.Isso pode ajudar a investigar a patologia da artrite reumatoide. Este periódico pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a degeneração de IPSCs, utilizando RA-FLSs. Comece colocando o tecido sinovial em uma placa de 100 milímetros e lavando o tecido com 5 mililitros de PBS suplementado com antibióticos.Remova o tecido adiposo esbranquiçado e os resíduos ósseos. Em seguida, transfira o tecido aparado para um poço de uma placa de seis poços contendo 5 mililitros de DMEM suplementado com FBS e use uma tesoura para picar o tecido até que os pedaços sejam pequenos o suficiente para atravessar a ponta de uma pipeta descartável. Transfira o meio para um tubo cônico de 50 mililitros, depois adicione 5 mililitros de DMEM fresco mais FBS ao poço para coletar qualquer tecido remanescente e transfira todo o conteúdo do poço para o tubo.Em seguida, adicione colagenase descongelada com gelo até uma concentração final de 0,01% ao tubo e feche o tubo com parafilm para incubação em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação. Após quatro horas, complete o tubo com DMEM fresco mais FBS até um volume final de 50 mililitros e colete os fragmentos de tecido por centrifugação. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet, então re-suspenda as células em 40 mililitros de meio fresco para outra centrifugação.Re-suspenda o segundo pellet em 25 mililitros de DMEM fresco acrescido de FBS e deixe os grandes agregados de tecido sedimentarem. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo recipiente de 100 milímetros e incube os sinoviócitos a 37 graus Celsius e 5% CO₂ por 14 dias. Para expandir o cultivo de sinoviócitos, descarte o meio usado e lave as células com 5 mililitros de PBS.Remova o PBS e dissocie as células com 1 mililitro de EDTA no incubador de cultura celular por 2 minutos. Ao final da incubação, bata suavemente no recipiente para destacar quaisquer células aderentes remanescentes e transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Re-suspenda o pellet em 30 mililitros de DMEM e FBS e divida as células em 3 novos recipientes de 100 milímetros.Alimente os sinoviócitos com meio fresco a cada 3 dias, dividindo as células em 3 novos cultivos na confluência de 80%, conforme acabou de ser demonstrado. No dia zero da transdução, semeie 3 x 10⁴ FLS por poço em uma placa de 6 poços com meio de crescimento fresco para uma incubação noturna a 37 °C em 5% de CO₂. No dia seguinte, descongele um frasco de lentivírus contendo os 4 fatores de Yamanaka a 4 °C e substitua o meio de cultura dos FLS por meio de crescimento suplementado com brometo de hexadimetrina e ácido ascórbico.Após o conteúdo do frasco ter descongelado, adicione 30 microlitros de lentivírus às células e misture suavemente para distribuir o vírus de forma homogênea. Para melhorar a infecção, centrifugue a placa e retorne as células ao incubador, substituindo o meio diariamente por meio de crescimento FLS fresco contendo butirato de sódio e ácido ascórbico durante 3 dias. No 4º dia, substitua o meio por uma mistura de meio de crescimento FLS e meio iPSC contendo butirato de sódio e ácido ascórbico.No dia 5, adicione 60 microlitros de vitronectina a 6 mililitros de PBS sem cálcio e magnésio e recubra 3 poços de uma placa de 6 poços com 2 mililitros da solução cada, por pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Enquanto a vitronectina está sendo incubada, lave as células transduzidas com PBS e desprenda-as com EDTA, conforme demonstrado. Após coletar as células dissociadas por centrifugação, re-suspenda o pellet em 900 microlitros de meio fresco.Remova o excesso de vitronectina dos poços e adicione 300, 150 e 100 microlitros de células em poços individuais. Em seguida, retorne as células ao incubador, substituindo o meio diariamente por meio fresco de iPSC até que as colônias apareçam. Para selecionar as colônias, adicione primeiro 500 microlitros de meio iPCS, suplementado com inibidor de ROCK, a cada poço de uma placa de 48 poços revestida com vitronectina.Em seguida, coloque as culturas de FLS sob um microscópio estereoscópico em uma bancada limpa e use uma ponteira de pipeta de 10 microlitros para cortar ao redor de uma colônia de interesse. Usando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros, transfira a colônia selecionada para 1 poço da placa de 48 poços. Quando todas as colônias tiverem sido selecionadas, coloque a placa no incubador de cultivo celular até que as colônias estejam grandes o suficiente para transferência.Divisão das células quando as colônias saem do campo visível do microscópio, observado em ampliação de 100X. Nesta imagem, pode-se observar a morfologia dos FLS isolados após um cultivo inicial de 14 dias. As células exibem as características gerais de fibroblastos, com expressão semelhante dos marcadores fibroticos vimentina e fibronectina, bem como baixa expressão do marcador de sinoviócito semelhante a macrófago CD-68. De 8 a 11 dias após a transdução com fatores de Yamanaka por lentivírus, pequenas colônias começam a surgir, podendo ser isoladas e amplificadas por 5 a 10 passagens.Essas iPSCs da artrite reumatoide expressam fosfatase alcalina, indicando que permanecem indiferenciadas. As células também expressam marcadores de pluripotência, conforme confirmado por RT-PCR e análise de imunofluorescência. As iPSCs da artrite reumatoide exibem um padrão cromossômico normal de 44+XY, conforme determinado por cariótipo.Além disso, 12 semanas após a injeção em camundongos SCID, os iPSCs de artrite reumatoide formaram teratomas, que exibem fenótipos teciduais diversos. Com sua diferenciação em camadas germinativas confirmada por coloração imunofluorescente. Uma vez dominada, as iPSCs podem ser geradas a partir de SFCs com sinóvio.Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma compreensão melhor de como isolar a partir de tecido sinovial e como induzir o reprogramamento utilizando essas células. As iPSCs derivadas de RAF-FLS podem ser úteis para estudar regeneração ou triagem de fármacos em reumatologia. Uma vez que essas iPSCs sejam estabelecidas, diversos tipos de células-alvo ou órgãos podem ser gerados.Que pode ser útil para estudar a doença ou outras aplicações futuras, como edição gênica e assim por diante.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-using-fibroblast-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

Nós demonstramos o protocolo para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas humanas usando lentivírus mediada entrega dos fatores humanos Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Pluripotência foi confirmado pela morfologia e pela presença de tronco embrionárias (ES) de células específicas marcadores.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Este vídeo mostra uma terapia baseada em células para artrite autoimune em camundongos. As células T reguladoras derivadas de iPSC que expressam receptores específicos de ovalbumina são injetadas com albumina de soro bovino metilado (mBSA) emulsionada em um adjuvante. As células apresentadoras de antígenos murinos (APCs) processam e apresentam o mBSA às células T, estimulando a ativação e migração das células T para a membrana sinovial da articulação do joelho. As injeções subsequentes envolvem...

Uma terapia baseada em células para artrite autoimune em um modelo murino

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Apresentamos aqui um protocolo para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cada derivado do somite (Miótomo, sclerotome, dermátomo e syndetome) em condições quimicamente definidas, que tem aplicações em modelagem de doenças futuras e terapias baseadas em células em cirurgia ortopédica.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

O presente estudo fornece um protocolo modificado para isolar macrófagos sinoviais e fibroblastos do tecido da artrite inflamatória murina.

Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

Desenvolvemos um sistema transwell ex vivo humano capaz de avaliar alterações inflamatórias agudas, infecciosas e estruturais na sinovia.

Um Modelo Pré-Clínico de Sinovite Utilizando Tecido Sinovial Humano Ex Vivo com Função e Arquitetura Preservadas

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos de pacientes com artrite reumatóide usando um sistema lentiviral sem células alimentadoras. Este método facilita o estudo da patologia da doença.

Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide

Explorar mais vídeos