Name: Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a quantificar a formação de tubos por células endoteliais em matrizes extracelulares normais e GFR para estudar angiogênese. Este método mensurável utiliza células HUVEC e inibidores de CXCR2 para investigar respostas angiogênicas.

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O trabalho foi financiado pelo Fundo para Pesquisa e Educação Médica, Wayne State University, Detroit, MI.

Cultura 1. celular <ol><li> Semente 3x10 5 células HUVEC em 10 ml de meio de crescimento completo 10 em um frasco de 75 cm. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO 2 a 70-80% de confluência. </li></ol> 2. ensaio de formação de túbulos <ol><li> Descongelar ou o crescimento da matriz extracelular reduzida-fator (TFG) ou matriz extracelular normal, durante a noite em gelo a 4 ° C. Nota: Por uma questão de brevidade &#39;matriz extracelular&#39; passarão a ser usado para fazer referência tanto TFG e matriz extracelular normal. O processo para prepará-los é idêntico. </li><li> Mantenha a placas de cultura de 96 poços sobre gelo, e adicionar 50 ul de matriz extracelular refrigerada por poço usando pontas pré-arrefecida. Prepare triplicado de 5 poços contendo apenas a matriz extracelular normal. Prepare outra triplicado de 5 poços contendo apenas TFG matriz extracelular. </li><li> Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lava-se a HUVECsuma vez com uma solução tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS), e adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Incubar a placa a 37 ° C durante 1-5 minutos, verificando as células a cada hora até que a maioria das células arredondar para cima. Desalojar as células tocando o frasco uma vez. <ol><li> Adicionar 5 ml de meio basal (ie, meio de crescimento de células endoteliais sem nada (por exemplo, suplementos) adicionado) com 1% de soro fetal bovino (FBS). Recolher as células no frasco através de pipetagem e transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender com 2 ml de meio basal, contar as células utilizando um hemocitómetro, e ajustar a concentração de células a 2-3 x 10 5 culas / ml. </li></ol></li><li> Preparação de 100 ul da concentração de inibidor 10x CXCR2 SB225002 seguintes em meio basal: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM e 0 uM (controlo). </li><li> Pipetar 300 ul da suspensão de HUVEC em cada 5 micrtubos ocentrifuge. Adicionar 33 ul de as concentrações de inibidor (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM e 0 pM) em um tubo de cada uma contendo a HUVEC, e vortex. </li><li> Pipetar 50 ul de cada uma das suspensões celulares (1-1,5 x 10 4 células) a poços individuais de matriz extracelular. Placa cada suspensão em triplicado e incubar durante 4-16 hr a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Após 4-16 horas, tome 4 imagens dos tubos formados por poço usando uma câmera microscópio invertido 11 (aumento original x 100). </li></ol> 3. Tubule Ensaio Disruption <ol><li> Preparar a matriz extracelular e as placas de acordo com as mesmas especificações, como a formação do tubo de ensaio (os passos 2.1 a 2.3). </li><li> Prepare suspensão de HUVEC como descrito nos Passos 2.4- 2.4.2 Formação do tubo de ensaio e alíquota numa placa de 96 poços contendo a matriz extracelular, a 50 uL por poço. Nota: Placa suficientes poços sO que há 3 poços por tratamento de droga. </li><li> Cultivar células em matriz extracelular durante 4 h a 37 ° C, 5% de CO 2. Tire fotos antes do início do tratamento medicamentoso. </li><li> Prepare concentrações 2x da SB225002 inibidor CXCR2 conforme descrito no Passo 2.5 do ensaio de formação do tubo, e adicionar 50 uL de cada concentração por poço da placa de 96 poços contendo a HUVEC. Placa cada concentração em triplicado. </li><li> Incubar a placa durante mais 2-12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Tomar 4 imagens dos tubos formados em cada poço usando um microscópio invertido câmara (ampliação original x 100) 11. </li></ol> 4. Dados Quantificação <ol><li> Avaliar a formação de tubo capturado nas imagens, medindo o comprimento total do tubo de tubos em quatro campos aleatórios utilizando o software da câmara microscópio. </li><li> Abra a imagem no software da câmera microscópio, e clique em &quot;Anotações e Medições9 ;. Na seção &#39;tamanho&#39;, selecione a ferramenta &quot;linha simples&quot;. Clique na imagem, em seguida, desenhar uma linha ao longo do comprimento do tubo, em seguida, clique direito. Nota: O software calcula automaticamente o comprimento da linha em pixels e colocar os dados em um arquivo. </li><li> Repita o procedimento para todas as linhas de metro na imagem, selecionando a ferramenta &quot;linha simples&quot;. Clique na imagem, em seguida, desenhar uma linha ao longo do comprimento do tubo, em seguida, clique direito. Nota: O software gravar o comprimento de cada linha e exibir os dados no ecrã. </li><li> Depois de medir cada tubo na foto, clique em &quot;Export&quot;, em seguida, escolheu &#39;Comprimento de planilha&#39;. Nota: Os dados de comprimento serão exportados para uma planilha. </li><li> Adicione todos os comprimentos de tubo a partir da folha de cálculo para obter o comprimento total do tubo. Calcular e registrar o comprimento médio dos tubos. Nota: Quatro repetições são recomendados com média e desvio padrão determinado. </li></ol> 5. recuperação das células da Matriz Extracelular Cultura <ol><li> Cultura e realizar um ensaio de formação de tubo (ver secção 2) numa escala maior como uma placa de 96 poços não irá produzir a contagem de células suficiente. Para placas de 12 poços, 500 ul de usar matriz extracelular e 500 ul da suspensão de células HUVEC (5 1,5x10 células). </li><li> Incubar as células durante 4-16 horas de modo a formar tubos. Em seguida, aspirar o meio de cultura celular. Lavar as células com 1 ml de frio 1x PBS sem cálcio e magnésio. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS frio-2,5-tampão de EDTA mM de gelo sobre a cultura e manter em gelo durante 10 min. </li><li> Desalojar as células e mistura de matriz extracelular do prato usando uma ponteira 1.000 l com a ponta cortada, e depois transferir para um resfriado tubo de 15 ml, lavar bem com 4 ml de PBS gelado-2.5 ​​EDTA mM e colocar no tubo . </li><li> Colocar os tubos em gelo durante 1-4 horas e inverter o tubo várias vezes até que todo o extracelularmatriz é dissolvido. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 1620 xg à temperatura de 0 ° C </li><li> Re-suspender as pelotas de células com PBS frio 1 ml para um tubo de 1.ml em gelo. </li><li> Centrifugar novamente durante 5 min a 3000 xg à temperatura de 0 ° C, em seguida, descartar o sobrenadante. </li><li> Armazenar as células em -80 ° C. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao realizar este ensaio, é essencial para manter a matriz extracelular em gelo ou a 4 ° C em todos os momentos, a menos que especificado de outra forma. Se a matriz extracelular é deixada aquecer acima de 4 ° C, ele irá polimerizar, e o ensaio será arruinado. É também importante assegurar que qualquer coisa que vem em contacto (por exemplo, pontas de pipeta, a placa), com a matriz extracelular é pré-arrefecida para a razão acima mencionada. O número de células semeadas em cada poço é crítica, muito poucas células não vai dar a teia esperado na amostra de controlo, muitas células irá formar grandes aglomerados de células ou uma monocamada e o ensaio não será válido. Outro factor importante para o sucesso deste ensaio é o número de passagens de células da HUVEC. O número de passagens deve ser sempre menor do que dez, caso contrário, a formação do tubo robusto pode não ocorrer. Além disso, deve-se assegurar que o meio de cultura celular a ser usado não expirou, ou as células não será viável. alternattivamente, pode-se alíquota do meio e dos seus componentes e armazená-las a -20 ° C para preservar, por um período de tempo após a data de validade. É claro, é ainda preferível utilizar a forma anterior à data de expiração Como todos os procedimentos, existem algumas desvantagens para a realização do ensaio de formao de tubo endotelial celular. Um problema importante é que, porque existem diferentes tipos de células endoteliais e matrizes de suporte, os resultados do ensaio podem variar muito dependendo de qual é utilizado o tipo de célula e matriz. As células endoteliais usadas (HUVECs, HAECs ou HMVECs) são células primárias, que são dispendiosos e têm de obter a variabilidade em relação a células imortalizadas. As células primárias têm passagens limitadas para utilização, e, por conseguinte, não são adequados para as experiências de angiogénese de longa duração 14. Para dados fiáveis, deve-se sempre usar os mesmos tipos para o ensaio. Tal como com outros ensaios in vitro, os resultados de um ensaio de formação de tubo deve ser confirmado in vivo, porque os resultados das condições controladas e artificiais de cultura de tecidos de duas dimensões não podem sempre ser reflectida na Biosystem complexo de um organismo vivo. É também importante ter em mente que este tipo de ensaio só pode ser utilizado para demonstrar a formação de tubos de células endoteliais, e não deve ser usada para testar outros, não endotelial, células tubo de formação. Este ensaio é um método bastante simples e rápido para quantificar o potencial angiogénico de um composto. Também constitui uma plataforma para outras experiências, como por si só, não fornecem informação a respeito do mecanismo específico pelo qual o composto atinge efectivamente o processo de formação de vasos. No entanto, a utilização de matrizes extracelulares variadas é um exemplo de como criar ainda uma estrutura para questões de investigação que não é vulgarmente utilizado. Existem abordagens para estudar os mecanismos de bio-químicas específicas do composto, incluindo os inibidores específicos de componentes que têm como alvoa via de angiogénese. Outra abordagem pode ser para extrair ARN a partir das células endoteliais e utilizar RT-PCR (PCR em tempo real) 12 analisar as alterações da expressão do gene que podem causar o comportamento de crescimento observada no ensaio. As aplicações futuras deste método incluem transfectadas HUVECs para criar knock-down ensaios para passos específicos da via da angiogénese. Existe potencial para aplicar esta abordagem para o estudo da via linfangiogénese. Ao alterar os componentes da matriz extracelular, a interacção da matriz e o processo celular de apoio angiogénese no cancro podem ser mais elucidado. A extração de RNA e proteínas a partir de células endoteliais sob estas condições específicas fornecer dados quantificáveis ​​adicional correspondente à imagem latente de dados.

A fim de obter os nutrientes necessários para a sobrevivência, tumores malignos requerem acesso à corrente sanguínea do paciente. Para obter esse acesso, as células tumorais libertar sinais químicos que estimulam o crescimento de novos vasos sanguíneos no tumor, sequestrando assim o processo fisiológico normal conhecido como angiogénese 2. É também através dos vasos sanguíneos criados através de angiogénese que a metástase (isto é, a propagação do cancro para outros órgãos) pode ocorrer. Uma vez que o processo de angiogénese é tão vital para a progressão de uma grande variedade de cancros, é um alvo atractivo na investigação terapia antineoplásica 3. Um dos métodos utilizados para quantificar a angiogénese é medir a capacidade da célula endotelial progenitor para formar tubos quando colocado sobre uma matriz extracelular. Uma vez que a formação desses tubos é um passo crítico na angiogénese precoce, teste de condições ambientais (por exemplo, presença ou ausência de um determinado acordompound) que pode estimular ou inibir a formação do tubo fornece insights sobre os passos específicos que podem ser direcionados para inibir a angiogênese. O ensaio de formação de tubo de células endoteliais é um dos 4 métodos mais amplamente utilizados in vitro que mede a capacidade das células para formar tubos. É um ensaio simples, que requer relativamente poucos componentes e um período de cultura de curto 5. Talvez mais importante, no entanto, é que os dados obtidos a partir deste tipo de ensaio é quantificável. Um exemplo para a utilização do ensaio de formao de tubo consiste em comparar o desenvolvimento de tubos a partir de células endoteliais vasculares cultivadas em matriz extracelular contra o factor de crescimento reduzida (TFG) da matriz extracelular. A matriz extracelular é um material de membrana do tipo cave isolado a partir de células de sarcoma e os seus principais componentes são laminina, colagénio tipo IV, factores de crescimento e proteoglicanos. Alguns compostos têm diferentes efeitos sobre a capacidade da célula para formar tubos quando emum ambiente com fatores de crescimento reduzidas e reduzidas proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs). HSPGs são um componente da matriz extracelular que é significativamente reduzida em TFG matriz extracelular. Como um exemplo, se a hipótese é a de que os inibidores de angiogénese, tais como SB225002, que bloqueia o receptor CXCR2, têm capacidade consideravelmente mais fraca para interromper a formação do tubo quando HSPGs são abundantes, em seguida, uma comparação entre a actividade de formação do tubo na matriz extracelular e a TFG matriz extracelular é importante em explorar a possibilidade de inibição da angiogênese através do controle de HSPGs. Outros ensaios que são vulgarmente utilizados para determinar os efeitos dos compostos sobre a angiogénese são métodos in vivo. Exemplos notáveis ​​disto são o pinto membrana corioalantï¿½ca (CAM) Ensaio 6 usando ovos de galinha, eo in vivo Matrigel ligar ensaio de angiogénese 7 utilizando camundongos. Enquanto os métodos in vivo medir a angiogénese em três dimensões e são mais representativas do corpo humano em comparação com o ensaio de formação in vitro de tubo, eles sofrem o defeito de que requer muito mais tempo e é consideravelmente mais difícil de executar. Tanto o ensaio de CAM e o ensaio de tampão extracelular demorar pelo menos uma semana 8 para fazer, enquanto que na comparação, o ensaio de formação de tubo pode ser feito de um único dia e que não requer o uso de animais. É importante notar que as células endoteliais usadas neste relatório são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Estas células desempenham um papel chave em broto vascular e o crescimento de vasos sanguíneos, e são suficientemente semelhante às células endoteliais em cancros a ser utilizado para avaliar a actividade anti-angiogénese, tanto in vitro e in vivo 9. podem também ser utilizadas outras células, tais como células endoteliais microvasculares primárias. É também importante notar que, além de ter baixaníveis de HSPGs, a matriz extracelular de GFR também tem níveis reduzidos de muitos componentes, quando comparado com a matriz extracelular normal. Isto inclui, mas não está limitado a: EGF, IGF-1, PDGF e TGF-beta. Esses realização de experimentos que estudam o significado destes compostos em relação à angiogênese pode estar interessado em usar GFR matriz extracelular.

<table><tbody><tr><td>Meio de crescimento completo EGM-2 (kit de bala EGM-2 CC-3162)</td> Meio de crescimento completo <td>Fisher</td><td>NC9525043</td><td>HUVEC: Meio de base EGM-2 misturado com BBE (Extrato de Cérebro Bovino), hEGF (Fator de Crescimento Epidérmico Humano), Hidrocortisona, GA-1000 (Gentamicina, Anfotericina-B), 2% FBS (Soro Fetal Bovino), VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular), hFGF-&beta; (Fator de Crescimento de Fibroblastos Humanos Beta), R3-IGF-1 (Fator de Crescimento Longo R Semelhante à Insulina Um), Ácido Ascórbico e Heparina. Alíquota do meio e seus componentes e armazene-os a -20&nbsp; &deg; C, quente em 37&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>MATRIZ MATRIGEL 10ML Fator de Crescimento Reduzido (TFG); 10&nbsp; Ml; Fisher</td><td></td><td>CB-40230</td><td>Livre de LDEV Matriz extracelular reduzida pelo fator de crescimento (TFG), mantenha em -20&nbsp; &deg; C, quente em 4&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>MATRIZ MATRIGEL 10ML; 10&nbsp; Ml; Matriz</td> extracelular <td>Fisher</td><td>CB-40234</td> livre de LDEV<td>, mantenha em -20&nbsp; &deg; C, quente em 4&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>SB225002</td><td>Fisher</td><td>559405</td><td>inibidor CXCR2, mantenha em -20&nbsp; &deg; C, aqueça em temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVEC)&nbsp;</td><td>Laboratórios de Pesquisa ScienCell&nbsp;</td><td>8000</td><td>cultura de acordo com a referência&nbsp; 10.Tripsina</td></tr> <tr><td>0.05%-EDTA fenol vermelho</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>mantenha em 4&nbsp; &deg; C, quente em 37&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscópio de Pesquisa Invertido.&nbsp;</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bits</td><td>Nikon</td><td></td><td>Inverted Research Microscope software</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 5</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>software científico de gráficos e estatísticas 2D, para calcular IC50.</td></tr></tbody></table>

endotelial estratégica assay formação de células do tubo: comparando matriz extracelular e fator de crescimento reduzido matriz extracelular

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Os tumores malignos requerem um suprimento de sangue para sobreviver e se espalhar. Esses tumores obtêm o sangue necessário da corrente sanguínea do paciente, sequestrando o processo de angiogênese, no qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de vasos sanguíneos existentes. O receptor CXCR2 (receptor 2 de quimiocina (motivo CXC)) é uma molécula ligada à proteína G transmembrana encontrada em muitas células que está intimamente associada à angiogênese1. O bloqueio específico do receptor CXCR2 inibe a angiogênese, medida por vários ensaios, como o ensaio de formação do tubo endotelial. O ensaio de formação de tubos é útil para estudar a angiogênese porque é um excelente método de estudar os efeitos que qualquer composto ou condição ambiental pode ter na angiogênese. É um ensaio in vitro simples e rápido que gera dados quantificáveis e requer relativamente poucos componentes. Ao contrário dos ensaios in vivo, não requer animais e pode ser realizado em menos de dois dias. Este protocolo descreve uma variação da matriz extracelular que suporta o ensaio de formação do tubo endotelial, que testa o receptor CXCR2.

formação do tubo considerável, saudável endotelial pode ser facilmente contrastadas para a formação do tubo inibida nas imagens de microscopia. Formação do tubo saudável aparece como uma teia organizada das estruturas do tipo capilar (Figura 1). Em comparação, a formação do tubo inibida manifesta-se como células dispersas (Figura 2). Tubo de ensaio de formao de dados é quantificada medindo o comprimento total do tubo de tubos capilares (Tabela 1). Além disso o comprimento total do tubo, o comprimento médio do tubo, o número total de tubos, ou o número total de pontos de ramificação pode ser medido. formação do tubo estruturado produz uma maior comprimento do tubo de líquido do que o crescimento do tubo inibido dispersos. Na Figura 3, uma curva de resposta à dose permite o cálculo da IC 50 sob as condições experimentais de células HUVEC na matriz extracelular de GFR e um inibidor de CXCR2 SB225002. Figura 1. endotelial formação t Ube na matriz extracelular e crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida-fator. Duas imagens mostram a formação do tubo de sucesso na matriz extracelular (A) e GFR matriz extracelular (B). A rede interligada de tubos mostra claramente que o crescimento dos tubos é saudável nestas células HUVEC. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> Figura 2. A inibição da formação do tubo em extracelular e crescimento reduzido fatores (TFG) da matriz extracelular por um SB225002 inibidor CXCR2 (5,6 mM). Duas imagens mostram tuboformação que foi inibida por um inibidor de SB225002 CXCR2 (5,6 ^ M) na matriz extracelular (A) e GFR matriz extracelular (B). Os aglomerados isolados de células HUVEC visto nesta imagem mostra que as células não foram capazes de formar os tubos necessários para conectar uns aos outros. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> Figura 3. curva de resposta à dose sobre o crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida do factor. O eixo dos X mostra o comprimento do tubo e o eixo Y mostra a concentração de um inibidor de CXCR2. A curva de resposta à dose que mostra a resposta de HUVEC ao inibidor em GFR CXCR2 matriz extracelular é dependente da dose. A (inibidor máximo metade IC50Y concentração) foi calculada usando o software 13 e pode ser comparado com uma curva de resposta à dose para a matriz extracelular, por exemplo. IC50 é a concentração do inibidor que reduz a resposta a 50%. As barras de erro representam o desvio padrão. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fator de Crescimento reduzida (TFG) da matriz extracelular e inibidor (4 repetições cada) </td><td> Total de tubo comprimento médio (pixels) (1 pixel = 0,34 mm) </td><td> Desvio padrão </td><td> P Valor </td></tr><tr><td> controle de matriz extracelular GFR </td><td> 2447 </td><td> 168,174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR extracelular SB225002 matriz + 0,56 mM </td><td> 1422,5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>TFG extracelular SB225002 matriz + 1,1 uM </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2,14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz + 5,6 uM </td><td> 519,25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4,19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz + 11 uM </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1,21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Quantificação comprimentos totais do tubo sobre o crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida-fator sob várias condições. Uma porção de uma tabela usando comprimentos totais do tubo gravadas em amostras crescidas na matriz extracelular de GFR com concentrações variáveis ​​de inibidor de CXCR2. Os dados indicam que o inibidor de CXCR2 inibe a formação do tubo. Incluem-se os valores associados, tais como média de quatro repetições, desvio padrão e valor P. Medido em pixels para mostrarOs dados que são exportados. CI 50 podem ser calculados usando software estatístico 13. (1 pixel = 0,34 uM)

Este manuscrito descreve um ensaio de formação de tubo para quantificar os efeitos de um determinado composto ou condição na angiogênese usando a formação de tubo de células endoteliais em um ambiente controlado.

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

O objetivo geral deste experimento é quantificar a dependência da formação de tubos por células endoteliais em relação a quimiotáticos angiogênicos, utilizando duas matrizes extracelulares diferentes que contêm componentes capazes de se associar a diversas moléculas angiogênicas. Este método pode responder perguntas fundamentais na área de angiogênese tumoral, como, por exemplo, por que a angiogênese é sustentada por vias alternativas por meio de alterações na matriz extracelular? As principais vantagens desta técnica são sua mensurabilidade e o uso de um número reduzido de variáveis.Demonstrando o procedimento estará a Srta. Donghong Ju, pesquisadora associada do laboratório. Para iniciar este procedimento, descongele a matriz extracelular GFR ou a matriz extracelular normal, durante a noite a quatro graus Celsius. Mantenha a placa de cultura de 96 poços em gelo e adicione 50 microlitros de matriz extracelular gelada por poço, utilizando ponteiras pré-resfriadas.Prepare trêplicas de cinco poços contendo apenas a matriz extracelular normal, seguidas por trêplicas de cinco poços contendo apenas a matriz extracelular GFR. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, lave as HUVEC uma vez com PBS, sem cálcio e magnésio, e adicione um mililitro de Tripsina EDTA a 05%.Posteriormente, incubar as células a 37 graus Celsius por um a cinco minutos, verificando a cada minuto até que a maioria das células se arredonde. Em seguida, desprender as células batendo no frasco. Depois, adicionar cinco mililitros de meio basal com um por cento de FBS ao frasco.Transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 200 vezes G durante cinco minutos. Após cinco minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células com dois mililitros de meio basal.Conte as células utilizando um hemocitômetro e ajuste a concentração celular para duas a três vezes 10 à quinta células por mililitro. Em seguida, prepare 100 microlitros de cinco concentrações diferentes 10X do inibidor CXCR2 em meio basal. Pipete 300 microlitros da suspensão de HUVEC para cada um dos cinco tubos microcentrífugos individuais.Posteriormente, adicione 33 microlitros do inibidor 10X em cada concentração aos tubos contendo HUVEC e vórtex. Em seguida, pipete 50 microlitros de cada uma das suspensões celulares em poços individuais da matriz extracelular. Plaque cada suspensão em triplicata e incube por quatro a 16 horas a 37 graus Celsius.Posteriormente, tire quatro imagens por poço usando uma câmera de microscópio invertido. Neste procedimento, prepare a matriz extracelular e as placas de acordo com as mesmas especificações do ensaio de formação de tubos. Posteriormente, prepare a suspensão de HUVEC e alíquota em uma placa de 96 poços contendo a matriz extracelular, com 50 microlitros por poço.Em seguida, cultive as células na matriz extracelular por quatro horas a 37 graus Celsius. Então, adquira imagens antes do início do tratamento com fármaco. A seguir, prepare cinco concentrações diferentes duas X do inibidor de CXCR2 em meio basal.Adicione 50 microlitros de inibidor de CXCR2 de cada concentração a cada um dos 96 poços contendo HUVEC. Em seguida, incube a placa por mais duas a doze horas a 37 graus Celsius. Então, capture quatro imagens de cada poço utilizando uma câmera de microscópio invertido.Para avaliar a formação de tubos capturada nas imagens, meça o comprimento total dos tubos em quatro campos microscópicos aleatórios utilizando o software da câmera do microscópio. Para isso, abra a imagem no software da câmera do microscópio e clique em Anotações e Medições. Na seção Comprimento, selecione a ferramenta de linha simples.Clique na imagem, depois desenhe uma linha ao longo do comprimento do tubo e clique com o botão direito para realizar o cálculo. Em seguida, repita o procedimento para todas as linhas dos tubos na imagem, selecionando a ferramenta de linha simples. Clique na imagem, desenhe uma linha ao longo do comprimento do tubo e clique com o botão direito.O software registrará o comprimento de cada linha e exibirá os dados na tela. Após medir todos os tubos da imagem, clique em Exportar e, em seguida, escolha Comprimento para Planilha para exportar os dados de comprimento para uma planilha. Some todos os comprimentos dos tubos na planilha para obter o comprimento total dos tubos.Em seguida, calcule e registre o comprimento médio dos tubos. Neste procedimento, cultive e realize um ensaio de formação de tubos na placa de 12 poços. Incube as células por quatro a 16 horas para formação dos tubos.Posteriormente, aspire o meio de cultura celular e enxágue as células com um mililitro de PBS 1X frio sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione um mililitro de tampão PBS gelado contendo 2,5 milimolar de EDTA sobre a cultura e mantenha-o em gelo por 10 minutos. Após 10 minutos, desprenda a mistura de células e matriz extracelular da placa utilizando uma ponteira de pipeta de 1.000 microlitros com a ponta cortada.Em seguida, transfira as células para um tubo frio de 15 mililitros. Lave o poço com quatro mililitros de PBS gelado e coloque no mesmo tubo. A seguir, coloque o tubo no gelo por uma a quatro horas e inverta o tubo algumas vezes até que a matriz extracelular esteja dissolvida.Em seguida, centrifugue por 10 minutos a zero graus Celsius. Então, re-suspenda o pellet celular com um mililitro de PBS frio em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo. Centrifugue novamente por cinco minutos a zero graus Celsius.Em seguida, descarte o sobrenadante e armazene as células a 80 graus Celsius. Essas duas imagens mostram a formação bem-sucedida de tubos endoteliais na matriz extracelular normal e na matriz extracelular GFR. A rede interconectada de tubos demonstra claramente que o crescimento dos tubos é saudável nessas HUVEC.Essas duas imagens mostram a inibição da formação de tubos por um inibidor de CXCR2, SB225002, a 5,6 micromolar na matriz extracelular normal e na matriz extracelular GFR. Os agregados isolados de HUVEC vistos nesta imagem indicam que as células não foram capazes de formar os tubos necessários para se conectarem umas às outras. Este gráfico mostra que a resposta de HUVEC ao inibidor de CXCR2 na matriz extracelular GFR é dependente da dose.Após o procedimento, outros métodos como qRT-PCR ou sequenciamento de RNA podem ser realizados utilizando as células preparadas. Dados como comprimento médio dos tubos, número total de tubos ou número total de pontos de ramificação podem ser obtidos por meio das imagens para caracterizar o processo de angiogênese sob condições experimentais.

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Medicine

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A formação do tubo de ensaio é usado para avaliar a atividade vascular das células tumorais.

A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

O ensaio de formao de tubo é um método rápido, quantificável para medir a angiogénese in vitro. As células endoteliais são combinados com meios condicionados e semeadas em extracto de membrana basal. A formação do tubo ocorre dentro de poucas horas e túbulos recém-formados facilmente quantificada.

Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Descreve-se um bioensaio baseado em células simples para a detecção, quantificação e a monitorização da actividade de membros da família de ligandos vasculares factor de crescimento endotelial. O ensaio utiliza receptores quiméricos expressos numa linha celular dependente de factores para proporcionar uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa de ligação ao receptor e a reticulação pelo ligando.

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Aqui, nós avaliamos os efeitos do extrato da água de Ruta graveolens na formação da rede do vaso usando um ensaio da formação do tubo em uma matriz gelada do porão.

Tubo HUVEC-ensaio de formação para avaliar o impacto dos produtos naturais na angiogênese

O sistema esferóide tridimensional do ensaio da angiogênese da cocultura é projetado imitar a angiogênese fisiológica. Os esferoides da co-cultura são dados forma por dois precursores vasculares humanos da pilha, por ecfcs e por MSCS, e incorporados no gel do colagénio. O novo sistema é eficaz para avaliar moduladores angiogênicos e fornece informações mais relevantes para o estudo in vivo.

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).

Sistema de matriz 3D derivado do fibroblasto aplicável ao ensaio de formação do tubo endotelial

Apresentado aqui é um protocolo para análise de hibridização de RNA in situ in situ em zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de células-tronco derivadas do paciente para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

Aprenda a quantificar a formação de tubos por células endoteliais em matrizes extracelulares normais e GFR para estudar angiogênese. Este método mensurável utiliza células HUVEC e inibidores de CXCR2 para investigar respostas angiogênicas.

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular (Vídeo) | JoVE Journal

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

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