Name: Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a isolar e fenotipar células-tronco mesenquimais de líquido sinovial e medula óssea de miniporcos usando centrifugação e citometria de fluxo. Este método não invasivo avança pesquisas em medicina regenerativa e terapias autólogas para doenças articulares.

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Reconhecemos com gratidão o apoio financeiro fornecido pelo Programa Next-Generation BioGreen 21 (No. PJ007969), Administração de Desenvolvimento Rural e a Fundação Nacional de Pesquisa (concessão nº. NRF-2015R1D1A1A01056639) da República da Coreia.

Experimentos em animais foram autorizados pelo Centro animal for Biomedical Experimentação da Universidade Nacional de Gyeongsang. 1. Preparativos para o Procedimento de animal <ol><li> Prepara-se o adulto porquinhos do sexo feminino para a recolha não-invasivo de MSCs a partir de medula óssea e no fluido sinovial. Realizar o exame clínico dos porquinhos um dia antes da anestesia e coleta de amostras. <ol><li> Fornecer animais clinicamente normais de exames físicos, que incluem a temperatura corporal, freqüência respiratória e freqüência cardíaca, e pela observação do comportamento e hematológicos status dos porcos, utilizando hemograma completo. Nota: intervalos de parâmetros para miniporcos clinicamente saudáveis ​​são 11-29 / min para a taxa de respiração, 68-98 / min para o ritmo cardíaco, e 37-38 ° C para a temperatura do corpo. </li></ol></li><li> Remover todas as camas comestível da gaiola durante o período de jejum pré-operatório de 6 - prio 12 hrr para a administração de anestesia para jovens e adultos minipigs, 3 horas de jejum deve ser observado para os recém-nascidos. Fornecer água potável até o momento da anestesia. </li></ol> 2. Preparação dos animais para anestesia <ol><li> Medicar os porquinhos antes da administração da anestesia com acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), e atropina (0,04 mg / kg). <ol><li> Injectar todos os medicamentos por via intramuscular (IM) utilizando uma agulha G 21 com um comprimento de pelo menos 30 mm para porquinhos adultos. Realizar a injecção IM 1-3 cm atrás da orelha no músculo cervical lateral ou no músculo da coxa. Nota: Execute todos os procedimentos, sem provocar medo ou estresse nos animais ou que exijam manuseio brusco para injetar com segurança a pré-medicação. </li></ol></li><li> Coloque os porquinhos em posição dorsal-deitada. </li><li> Quinze minutos após a administração da medicação pré-anestésica, iniciar a anestesia utilizando 1,5% de administração de isofluranoregis- por inalação. <ol><li> Continuar a inalação de isoflurano (1,5%) através de um tubo endotraqueal, seguido de um aumento na concentração de 2,5%, com o oxigénio (1,5 L / min) como o gás portador. </li></ol></li><li> Monitorar continuamente a frequência cardíaca, temperatura corporal, e saturação de oxigênio no sangue percutânea (SpO2) dos porquinhos durante a anestesia. Usar um cobertor de água em circulação a uma temperatura de 38-39 ° C para manter a temperatura corporal. Aplicar uma pomada oftalmológica para proteger os olhos de secar durante a anestesia. </li><li> Siga classificação de Guedel para avaliar a profundidade da anestesia 13. </li></ol> 3. Preparativos para o isolamento de células e Cultivo <ol><li> Para cultivar as MSC derivadas de medula óssea e de fluido sinovial, preparar 500 ml de meio de Dulbecco modificado avançada águia (ADMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico factoR (bFGF), e 1,0% de penicilina-estreptomicina (10.000 UI e 10000 ng / mL, respectivamente, Pen-Strep). <ol><li> Incubar a ADMEM a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 num incubador de CO 2. </li></ol></li><li> Preparar 500 ml de solução salina de tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) de acordo com as instruções do fabricante para o isolamento de células e de lavar roupa. </li></ol> 4. Recolha de Medula Óssea a partir do miniporcos <ol><li> Seleccionar uma área de aproximadamente 15 x 15 cm de tamanho na crista ilíaca (Figura 1), e remover o cabelo a partir desta área usando lâminas de barbear de segurança esterilizados ou corta-eléctricos. Uma vez que o minipig está posicionado, alternadamente esfregar o local procedimento três vezes com os seguintes agentes de esterilização: iodopovidona e 70% de etanol. Depois que a área está completamente seco, aplique campos estéreis. </li><li> Pré-revestimento da seringa de 10 ml com 100 U / ml de heparina, enxaguando-a com 3 - 4 ml de heparina antes ejecting o agente anti-coagulante. Nota: Execute esta etapa para evitar a coagulação na seringa durante a aspiração de medula óssea. </li><li> Extrair um mínimo de 5 ml de medula óssea a partir do osso da crista ilíaca de minipig sob anestesia, utilizando um extractor de medula óssea (3,0 × 100 mm) firmemente ligado à heparina pré-revestidos seringa de 10 ml. </li></ol> 5. Isolamento de células extraídas da medula óssea e cultivo in vitro <ol><li> Isolar as células da medula óssea extraída. <ol><li> Dilui-se a medula é extraída com um volume igual de DPBS num tubo cónico de 15 ml à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 3 ml de meio de centrifugação de densidade (Ficoll-Paque) para o tubo de 15 ml. </li><li> Dilui-se uma camada de 4 ml de medula óssea com DPBS, que é colocado no suporte de centrifugação de densidade, sem misturar, e centrifuga-se que a 400 x g durante 40 min à temperatura ambiente. </li><li> Colher a camada de células mononucleares(PTM) do creme leucocitário entre as duas camadas contendo o plasma (camada superior) e os meios de centrifugação de densidade (camada inferior), e transferir as multinacionais em um tubo de 15 ml. </li><li> Diluir os EMNs transferidos com 7 - 8 mL de DPBS e centrifugar-los a 500 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com DPBS. </li><li> Suspende-se o sedimento celular em 2 ml de ADMEM e transferi-lo para um prato de cultura de tecidos de 35 mm. Incubar a placa de cultura a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. </li></ol></li><li> O cultivo in vitro de células isoladas a partir de medula óssea. <ol><li> Após 48 horas, aspirar o meio com as células que não se ligaram aos prato, e substitui a 2 ml de ADMEM e incubar-lo a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Alterar o meio em cada três dias. </li><li> Na 70 - 80% de confluência, lavar as células com DPBS, dissociar-los com 1 ml de 0,25%tripsina / EDTA, e incubar a 37 ° C durante 3-5 minutos até que as células de separar. </li><li> Colher as células por meio de 10 ml de ADMEM, transferi-los para um tubo de 15 ml e centrifugar-los em 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. </li><li> Suspender as células colhidas em 1 ml de ADMEM fresco e contá-los usando um hemocitômetro. </li><li> Colocar as células em de 5 - 7,5 x 10 5 / 25T balão contendo 4 ml de ADMEM e incubar a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Mudar o meio cada três dias. </li></ol></li></ol> 6. Recolha de líquido sinovial das miniporcos <ol><li> Semelhante ao procedimento de aspiração da medula óssea, selecione uma área adequada de aproximadamente 15 x 10 cm (comprimento / largura) sobre a articulação femoral, e remover o cabelo usando lâminas de barbear de segurança esterilizados ou clippers elétricos, siga por procedimentos de higienização (passo 4.1). </li><li> Inserir uma seringa de 3 ml com um 23 Gagulha na articulação após os marcos de palpação (patela e da crista da tíbia). <ol><li> Aplicar sucção suave para as seringas para a aspiração do líquido sinovial na articulação. O volume aproximado de fluido sinovial recolhidas de uma junta é de 0,5 - 1 ml, mas isto varia de acordo com o tamanho do minipig ou da articulação. Lave através DPBS na cavidade sinovial, se o volume recolhido de fluido sinovial é muito pequeno. </li><li> retirar imediatamente a seringa para evitar a contaminação com sangue. </li></ol></li></ol> 7. cela de isolamento do Collected líquido sinovial e cultivo in vitro <ol><li> Isolar as células do fluido sinovial aspirado. <ol><li> Dilui-se o fluido sinovial aspirado com um volume igual de DPBS em um tubo de 15 ml à temperatura ambiente. </li><li> Para remover os detritos, filtrar o fluido sinovial diluída usando um coador de células de nylon de 40? M. </li><li> Adicionar 10 ml de DPBS para o tubo contendo o filtrado sinovialfluido e centrifugar-lo a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com DPBS. </li><li> Suspende-se o sedimento celular em 2 ml de ADMEM, colocar as células em um 2 - prato de cultura de tecidos de 3 x 10 5 células / 35 mm, com 2 ml de ADMEM, e incubar a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Repita o passo 5.2 para o cultivo in vitro de MSCs derivadas do líquido sinovial isoladas. </li></ol> 8. pós-procedimento Cuidado dos miniporcos <ol><li> Se necessário, fechar a pele no local da injecção extractor de medula óssea com um único fio de sutura com agrafos da pele, após a recolha de medula óssea. </li><li> Após o processo é completado, administrar uma injecção intramuscular de enrofloxacina (5 mg / kg) e meloxicam (0,2 mg / kg) para os porquinhos uma vez por dia durante 3 dias. </li><li> Após o processo é completado, desinfectar a medula óssea e o local de recolha de fluido sinovialcom 0,1% de iodo povidona, uma vez por dia durante 3 dias. Observe cuidadosamente diariamente para monitorar os sinais de complicações (por exemplo, inchaço, pus ou vermelhidão). </li></ol> 9. A fenotipagem celular utilizando Citometria de Fluxo <ol><li> Quando as MSCs são de 70 - 80% confluentes em passagens 3 - 5, lavar as células com DPBS e tratá-los com 1 ml de 0,25% (v / v) de tripsina / EDTA. Em seguida, incubam-los a 37 ° C durante 3-5 minutos até que as células são separadas. </li><li> Colher as células utilizando 10 mL de DPBS, transferi-los para um tubo de 15 ml e centrifugar-los em 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar a solução sobrenadante. </li><li> Para fixar as células, suspender o sedimento celular em 10 ml de uma solução de formaldeído a 3,7% e mantê-los a 4 ° C durante um dia antes da análise. <ol><li> Um dia após a fixação, lavar as células duas vezes com DPBS utilizando centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante. </li><li> Suspende-se o sedimento de células em 4 mlde DPBS, que é suplementado com 1% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), e incuba-se o sedimento durante 1 hora a 4 ° C para bloquear interacções não específicas mediada por Fc. </li><li> Distribuir alíquotas de 500 ul da suspensão de células em tubos de 1,5 ml. </li><li> Para os anticorpos não conjugados (CD29 e vimentina), lavar as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min. Descartar a solução sobrenadante. </li><li> Suspende-se o sedimento celular em 500 ul de uma diluição de 1: 100 do anticorpo primário e incubar por 1 h a 4 ° C. </li><li> Lavar as células duas vezes com 1% de albumina de soro bovino por centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante. </li><li> Suspende-se o sedimento celular em 500 ul de uma diluição 1: 100 de conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo secundário e incubar-lo durante 1 hora no escuro a 4 ° C. </li></ol></li><li> Para os anticorpos conjugados com FITC (de isotipo, CD34, CD44 e CD45), lavar as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min. Descartar a solução sobrenadante. <ol><li> Suspende-se o sedimento celular em 500 uL de anticorpo a 1: 100 conjugado com FITC e incubar-lo durante 1 hora no escuro a 4 ° C. </li><li> Para ambas as condições de coloração, lavar as células duas vezes com DPBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante. </li><li> Suspender as células em 500 ul de DPBS, transferi-los para um tubo de 5 ml de fundo redondo, e analisar os resultados usando um citómetro de fluxo 8. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Miniporcos foram utilizados para estabelecer o isolamento MSCs a partir de medula óssea e no fluido sinovial. Para eliminar várias condições fisiológicas, tais como idade, sexo, e as doenças, minipigs de isogï¿½nicas doadores fundo foram escolhidos para avaliar com precisão a caracterização depende fonte de células. Os porcos são conhecidos por serem anatomicamente, fisiologicamente, e geneticamente semelhantes aos seres humanos, e em particular, podem produzir miniporcos órgãos pareados por tamanho; portanto, eles pode...

As células-tronco mesenquimais (CTMs) multipotentes podem ser classificadas em linhagens de células mesenquimais, e as CTMs foram estabelecidas e isoladas de várias fontes teciduais, como medula óssea, cordões umbilicais, placentas, tecido adiposo, pele dérmica, músculo esquelético, folículos pilosos, membranas sinoviais e dentes1-5. Atualmente, a atenção tem sido dada às CTMs derivadas da sinovial, pois essas células podem ajudar a tratar doenças articulares, como fração óssea, osteoartrite e artrite reumatoide (AR), e devido ao potencial regenerativo das CTMs na cartilagem ou osso danificado, elas também podem ajudar a tratar a modulação imunológica ou doenças autoimunes6-8. A maioria das pesquisas de CTMs derivadas de fontes sinoviais empregou CTMs da membrana sinovial em vez de líquido sinovial2,9; assim, a compreensão biológica das MSCs derivadas do líquido sinovial é limitada.
O líquido sinovial é uma fonte facilmente acessível de MSCs, que pode ser aspirada durante os diagnósticos ou tratamentos de pacientes e durante confirmações diagnósticas de várias condições de artrite que não requerem procedimentos invasivos, como osteoartrite ou AR. A população de CTMs derivadas do líquido sinovial na cavidade sinovial é significativamente aumentada em pacientes artríticos em comparação com pacientes não artríticos10-12. Portanto, o líquido sinovial é uma excelente fonte candidata para MSCs, particularmente para terapia com células-tronco autólogas em pacientes com articulações inflamadas ou lesionadas. Além disso, as MSCs derivadas do líquido sinovial têm capacidade condrogênica, habilidades de imunomodulação e alta taxa de proliferação. Este estudo estabeleceu protocolos para extração de medula óssea e aspiração de líquido sinovial de miniporcos usando métodos não invasivos e para a expansão in vitro de células isoladas e análise de fenótipos celulares.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco Avançado' s meio de águia modificado (ADMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-023</td><td>MSC meio</td></tr><tr><td>de cultura Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Meio de lavagem celular, livre de Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Componente do meio MSCs</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Componente do meio MSCs</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Componente do meio MSCs</td></tr><tr><td>Fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF)</td><td>Simga</td><td>F0291</td><td>Componente de MSCs meio</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>Componente de MSCs meio</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reagente de dissociação celular&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Componente do meio MSCs</td></tr><tr><td>Anticorpo isotípico</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 550616</td><td>Controle de isotipo</td></tr><tr><td>CD29 anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 552369</td><td>Integrina beta-1 MSCs marcador</td></tr><tr><td>CD44 anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 553133</td><td>Glicoproteína de superfície celular MSCs marcador</td></tr><tr><td>CD45 anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 340664</td><td>Marcador de células-tronco hematopoiéticas</td></tr><tr><td>anticorpo CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555821</td><td>Marcador de células-tronco hematopoiéticas</td></tr><tr><td>anticorpo CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555595</td><td>Marcador de glicoproteína de membrana Thy-1 MSCs MHC</td></tr><tr><td>Anticorpo Classe II</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32247 Marcador de</td><td>células apresentadoras de antígeno</td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>Sigma Sigma-S6389</td><td></td><td>Marcador de MSCs de filamento intermediário tipo III</td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td>Mistura de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e nitro azul de tetrazólio (NBT)</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Centrifugação com gradiente de densidade</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro; m filtro de células de nylon</td></tr><tr><td>tubo cônico de poliestireno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>351095</td><td>Coleta de amostras e isolamento celular</td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>Placa de cultura de células</td></tr><tr><td>Extrator de medula óssea</td><td>GmbH Medizintechnologie, Alemanha</td><td>1145-1W010</td><td>TrokaBone, 3,0 x 100 mm</td></tr><tr><td>Câmara de hematócrito</td><td>Marinfeld</td><td>640130</td><td>Câmara</td></tr> <tr>de contagem de células<td>Atropina</td><td>Jeil Pharmaceutical Co, Coreia</td><td></td> do Sul <td>Sulfato de Atropina Hidrato</td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Samu Median, Coreia</td><td></td> do Sul <td>Medicamento pré-anestésico sedativo e antiemético</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Anestésico e analgésico</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer Healthcare, Alemanha</td><td></td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Sobre Medicina Veterinária, Argentina</td><td></td><td>Anti-inflamatório e analgésico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Hana pharm, Coreia</td><td></td> do Sul <td>Anestesia inalatória</td></tr><tr><td>Povidona iodo&nbsp;</td><td>Korea Pharma, Coreia</td><td></td> do Sul <td>Agente de esterilização</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Agente de esterilização</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Agente anticoagulante</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Agente de fixação celular</td></tr><tr><td>Pomada oftalmológica&nbsp;</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Oxitetraciclina HCl com sulfato de polimixina B Manta</td></tr><tr><td>de água circulante</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td>Sistema de aquecimento durante e após a anestesia</td></tr><tr><td>Grampeador de pele</td><td>Covidien, EUA</td><td></td><td>Sutura fechamento da pele</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Forma</td><td>3111</td><td>Equipamento de cultura de células</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analisador celular</td></tr><tr><td>Minipig</td><td>PWG Genetics Korea, Ltd.</td><td>Porco miniatura</td> <td>tipo T</td></tr></tbody></table>

isolation and cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e medula Óssea de miniporcos

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

As células-tronco mesenquimais (MSCs) foram estabelecidas após o isolamento de várias fontes de tecido, incluindo medula óssea e líquido sinovial. Recentemente, foi relatado que as MSCs derivadas do líquido sinovial têm potencial de diferenciação de múltiplas linhagens e características imunomoduladoras, o que indica que essas células podem ser usadas para engenharia de tecidos e tratamentos sistêmicos. Este estudo apresenta um protocolo para isolamento simples e não invasivo de CTMs derivadas da medula óssea e líquido sinovial de minipigs para análise de marcadores de superfície celular para fenotipagem celular e cultura in vitro. Usando miniporcos de seis meses de idade sexualmente maduros, a medula óssea foi extraída do osso da crista ilíaca usando um extrator de medula óssea e o líquido sinovial foi aspirado da articulação femorotibial. Os procedimentos para a coleta de amostras de ambas as fontes foram não invasivos. São fornecidos os protocolos para o isolamento efetivo de MSCs de fontes de células colhidas e para a criação de condições de cultivo in vitro para expandir MSCs estáveis de minipigs e a aplicação de tratamentos autólogos sistêmicos. Para a fenotipagem celular, os marcadores de superfície celular de ambas as células foram analisados por citometria de fluxo. Nos resultados, as MSCs foram isoladas do líquido sinovial dos minipigs e mostraram que as MSCs derivadas do líquido sinovial têm morfologia e fenótipo celular semelhantes às MSCs derivadas da medula óssea. Portanto, o líquido sinovial obtido de forma não invasiva é uma fonte valiosa de MSCs.

Estabelecimento de MSCs derivadas da medula óssea e do fluido sinovial de miniporcos MSCs foram isolados com sucesso a partir da medula óssea e das articulações sinoviais articulares dos porquinhos e expandidas in vitro (Figura 2). Seringa de aspiração de fluido sinovial é simples, e é possível obter células aderentes suficientes durante a cultura in vitro das células primári...

Um protocolo que estabelece células-tronco mesenquimais (MSCs) isoladas do líquido sinovial e da medula óssea de miniporcos e coletadas de forma não invasiva por aspiração com seringa é apresentado. A fenotipagem celular foi realizada por citometria de fluxo após isolamento celular e cultivo in vitro de medula óssea e fluidos sinoviais derivados de MSCs.

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

O objetivo geral deste procedimento é a coleta não invasiva de líquido sinovial e medula óssea de miniporcos para obter células-tronco mesenquimais a serem utilizadas em estudos de regeneração e imunomodulação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de terapia com CSM para otologistas, como a forma de estabelecer o líquido sinovial em CSM e como caracterizá-las em comparação com as CSM derivadas de medula óssea. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de estabelecer efetivamente as propriedades-chave das CSM derivadas de líquido sinovial e de medula óssea de miniporcos, o que será útil para aplicações em pacientes.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de diversas doenças articulares, pois a população de MSC derivadas do líquido sinovial na cavidade sinovial é significativamente aumentada em pacientes atléticos. Embora este método possa fornecer subsídios para a medicina regenerativa, também pode ser aplicado a outros estudos, como a pesquisa sobre doenças autoimunes. Como as MSC de miniporco são autólogas, a imunossupressão pode interessar aos seres humanos.Além dos outros cientistas, os responsáveis por demonstrar o procedimento serão Hyeon-Jeong Lee e Won-Jae Lee do meu nível três. Para começar, posicione um miniporco anestesiado para ter acesso à crista ilíaca. Em seguida, depile uma região de 15 centímetros quadrados na crista ilíaca, utilizando uma lâmina de barbear ou tesoura elétrica.Em seguida, esfregue alternadamente a pele exposta três vezes com poviodine-iodo e etanol a 70%. Após secagem completa, aplique campos estéreis. Agora, pré-revesta uma seringa de dez mililitros com heparina, utilizando uma lavagem de três a quatro mililitros.Isso impedirá que a medula óssea coagule durante a extração. Em seguida, exatamente na crista do osso ilíaco, acople firmemente um extrator de medula óssea à seringa revestida com heparina e extraia pelo menos cinco mililitros de medula óssea. Para isolar as células da medula óssea obtida, primeiramente dilua-a com um volume igual de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros à temperatura ambiente.Em seguida, carregue três mililitros de meio de centrifugação em gradiente de densidade em um segundo tubo cônico de 15 mililitros. Depois, transfira cuidadosamente quatro mililitros da medula óssea diluída para cima do meio de centrifugação em gradiente de densidade, formando duas camadas de solução. Agora, centrifugue o tubo a 400 Gs por 40 minutos à temperatura ambiente.As MNC desejadas são coletadas na camada branca central. Aspire apenas esta camada. Ejecte a camada de MNCs em um tubo cônico de 15 mililitros e dilua com sete a oito mililitros de DPBS.Em seguida, centrifugue as células a 500 Gs durante dez minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e lave as células em pellet duas vezes com dez mililitros de DPBS, repetindo o ciclo anterior de centrifugação. Após as duas lavagens, suspendemos os MNCs em dois mililitros de ADMEM.Em seguida, plaque as células em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros e incube-as a 38,5 graus Celsius em uma estufa com atmosfera úmida contendo 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas, aspire o meio juntamente com os MNCs não aderidos. Então, adicione novamente dois mililitros de ADMEM fresco e continue a incubação, trocando o meio a cada três dias.Quando as células atingirem de 70 a 80% de confluência, lave o cultivo com DPBS fresco. Em seguida, dissocie as células utilizando um mililitro de Tripsina-EDTA 0,25% por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Colete as células em dez mililitros de ADMEM e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, centrifugue as células a 300 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Agora, suspenda os MNCs colhidos em um mililitro de ADMEM fresco e meça sua densidade. Finalize semeando entre meio milhão e três quartos de milhão de células em frascos T25 com quatro mililitros de ADMEM.Incube os frascos da mesma forma que as placas e troque o meio a cada três dias. Prepare uma seção de pele de 15x10 centímetros sobre a articulação femoral, como foi feito ao preparar para a coleta de medula óssea. Em seguida, palpe para identificar a patela e as cristas da tíbia abaixo da pele, a fim de localizar a articulação sinovial, e insira uma seringa de três mililitros com agulha de 23 graus, precisamente na articulação.Usando sucção suave, extraia entre meio e um mililitro de fluido e retire imediatamente a agulha. Se o volume do fluido sinovial for muito pequeno, lave a cavidade com DPBS para coletar o fluido sinovial com DPBS. O volume de DPBS a ser usado varia conforme o tamanho da cavidade sinovial.O volume ideal de líquido sinovial é limitado na articulação saudável. O volume varia conforme o tamanho e a condição patológica da articulação. Para isolar as células do líquido sinovial, dilua o líquido com um volume igual de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros à temperatura ambiente.Em seguida, removemos os detritos filtrando a diluição através de um filtro de células de náilon de 40 micrômetros. Depois, adicione mais dez mililitros de DPBS e centrifugue a suspensão a 400 Gs durante dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, descarte o sobrenadante e lave as células duas vezes, utilizando DPBS.Suspendemos o pellet celular lavado em dois mililitros de ADMEM. Em seguida, prosseguimos com o cultivo das células conforme demonstrado com as MSCs. As MSCs foram isoladas com sucesso da medula óssea e das articulações sinoviais dos miniporcos e expandidas in vitro.A morfologia das MSCs derivadas de líquido sinovial é semelhante à das MSCs derivadas de medula óssea: ambas apresentam formato fusiforme fibroblástico e são homogeneamente aderentes. As MSCs mostraram expressão positiva para coloração de fosfatase alcalina após a conclusão da terceira subcultura. Em seguida, os marcadores de superfície foram analisados em ambas as culturas.Como esperado, ambos os tipos de MSCs expressaram significativamente CD29, CD44 e Vimentina. Em contraste, a expressão de CD34 e CD45 foi negativa e baixa. Esses resultados foram idênticos aos obtidos por meio de MSCs distintivas, incluindo células isoladas do líquido sinovial.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aspirar de forma não invasiva o líquido sinovial e a medula óssea para isolar suas CMM do miniporco e como realizar a comparação e o fenotipagem dessas CMM. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de localizar o ponto objetivo na crista ilíaca e na região sinovial, determinado por palpação cuidadosa. Após este procedimento, outros métodos, como em modelos de osteoartrite ou artrite reumatoide, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se não apenas as CMM da medula, mas também as CMM do líquido sinovial possuem a mesma capacidade de iniciar a formação de cartilagem ou osso e de promover imunossupressão.Após seu desenvolvimento, esta técnica avançou a terapia autóloga de doenças articulares ao auxiliar na caracterização de CMMs derivadas de articulações afetadas ou inflamadas em pacientes com artrite.

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JoVE Journal

Medicine

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