Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

O objetivo geral deste procedimento é a coleta não invasiva de líquido sinovial e medula óssea de minipigs para coletar células-tronco mesenquimais para serem usadas em estudos de regeneração e imunomodulação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia de MSC do otologista, como estabelecer o líquido sinovial nas MSC e como caracterizá-las em comparação com as MSC da medula óssea. A principal vantagem desta técnica é estabelecer efetivamente as principais propriedades do líquido sinovial e das MSCs derivadas da medula óssea de minipigs, o que será útil para aplicação em pacientes.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de várias doenças articulares, porque a população de MSC derivadas do líquido sinovial na cavidade sinovial é significativamente aumentada em pacientes atléticos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a medicina regenerativa, ele também pode ser aplicado a outros estudos, como a pesquisa de doenças autoimunes. Como as MSCs minipig são autólogas, a imunossupressão pode interessar aos humanos.

Além dos outros cientistas, demonstrando o procedimento estarão Hyeon-Jeong Lee e Won-Jae Lee do meu nível três. Para começar, oriente um minipig anestesiado para acessar a crista ilíaca. Em seguida, depile uma região de 15 centímetros quadrados na crista ilíaca, usando uma navalha ou tesoura

Em seguida, esfregue alternadamente a pele exposta três vezes com iodopovidona e etanol 70%. Depois de completamente seco, aplique cortinas estéreis. Agora, pré-cubra uma seringa de dez mililitros com heparina, usando um enxágue de três a quatro mililitros.

Isso evitará que a medula óssea coagule enquanto é extraída. Em seguida, precisamente na crista óssea ilíaca, prenda firmemente um extrator de medula óssea à seringa revestida de heparina e extraia pelo menos cinco mililitros de medula óssea. Para isolar as células da medula óssea extraída, primeiro dilua-a com um volume igual de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros à temperatura ambiente.

Em seguida, carregue três mililitros de meio de centrifugação de densidade em um segundo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, transfira cuidadosamente quatro mililitros da medula óssea diluída para o meio de centrifugação de densidade para criar duas camadas de solução. Agora, centrifugue o tubo a 400 Gs por 40 minutos em temperatura ambiente.

As MNCs desejadas são coletadas na camada branca central. Aspire apenas esta camada. Ejete a camada de MNC em um tubo cônico de 15 mililitros e dilua-a com sete a oito mililitros de DPBS.

Em seguida, centrifugue as células a 500 Gs por dez minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e lave as células paletizadas duas vezes com dez mililitros de DPBS, repetindo o ciclo de centrifugação anterior. Após as duas lavagens, suspendemos as multinacionais em dois mililitros de ADMEM.

Em seguida, carregue as células em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros e incuba-as a 38,5 graus Celsius em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5%. Após 48 horas, aspire o meio junto com as MNCs soltas. Em seguida, adicione novamente dois mililitros de ADMEM fresco e continue a incubação, trocando o meio a cada três dias.

Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, lave a cultura com DPBS fresca. Em seguida, dissocie as células, usando um mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Colete as células em dez mililitros de ADMEM e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, gire as células a 300 Gs por cinco minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Agora, suspenda as multinacionais colhidas em um mililitro de ADMEM fresco e meça sua densidade. Finalize com o plaqueamento entre 1/2 e três quartos de milhão de células em frascos T25 com quatro mililitros de ADMEM.

Incubar os frascos tal como as placas e mudar o meio de três em três dias. Prepare uma seção de pele de 15x10 centímetros sobre a articulação femoral, como foi feito ao preparar as coletas de medula óssea. Em seguida, palpe as cristas da patela e da tíbia abaixo da pele para identificar a articulação sinovial e insira uma seringa de três mililitros com uma agulha de calibre 23, precisamente na articulação.

Usando sucção suave, extraia entre 1/2 e um mililitro de fluido e retire imediatamente a agulha. Se o volume do líquido sinovial for muito pequeno, lave a cavidade com SPBD para coletar o líquido sinovial com SPBD. O volume de DPBS a ser usado varia com o tamanho da cavidade sinovial.

O volume ideal de líquido sinovial é limitado na articulação saudável. O volume varia com o tamanho e a condição patológica de sua articulação. Para isolar as células do líquido sinovial, dilua o fluido com um volume igual de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros à temperatura ambiente.

Em seguida, movemos os detritos filtrando a diluição através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons. Em seguida, adicione mais dez mililitros de DPBS e centrifugue a suspensão a 400 Gs por dez minutos em temperatura ambiente. Em seguida, descarte o sobrenadante e lave as células duas vezes, usando DPBS.

Suspendemos o palete de células lavadas em dois mililitros de ADMEM. Em seguida, prossiga com a cultura das células, conforme demonstrado com as MSCs. As MSCs foram isoladas com sucesso da medula óssea e das articulações sinoviais articulares dos minipigs e expandidas in vitro.

A morfologia das CTMs derivadas do líquido sinovial é semelhante à das CTMs derivadas da medula óssea: ambas têm uma forma de fuso fibroblástico e são homogeneamente aderentes. As CTMs mostraram expressão positiva para coloração de fosfatase alcalina após a conclusão do terceiro subcultivo. Em seguida, foram analisados marcadores de superfície em ambas as culturas.

Como esperado, ambos os tipos de MSCs expressaram significativamente CD29, CD44 e Vimentina. Por outro lado, a expressão de CD34 e CD45 foi negativa e baixa. Esses resultados foram idênticos aos obtidos por meio de MSCs distintas, incluindo células isoladas do líquido sinovial.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aspirar de forma não invasiva o líquido sinovial e a medula óssea para isolar suas MSC de minipigs e como realizar a comparação e fenotipagem desta MSC. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de localizar o ponto objetivo na crista ilíaca e na sinovial, determinado por palpação cuidadosa. Após este procedimento, outros métodos, como em modelos de osteoartrite ou artrite reumatóide, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se não apenas as MSC da medula, mas também as MSCs do líquido sinovial têm uma capacidade do mesmo tipo de iniciação e imunossupressões da cartilagem ou do osso.

Após seu desenvolvimento, essa técnica avançou na terapia autóloga de doenças articulares, ajudando a caracterizar as CTMs derivadas de articulações atacadas ou inflamadas em pacientes com artrite.