Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

O objetivo geral deste procedimento é a coleta não invasiva de líquido sinovial e medula óssea de miniporcos para obter células-tronco mesenquimais a serem utilizadas em estudos de regeneração e imunomodulação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de terapia com CSM para otologistas, como a forma de estabelecer o líquido sinovial em CSM e como caracterizá-las em comparação com as CSM derivadas de medula óssea. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de estabelecer efetivamente as propriedades-chave das CSM derivadas de líquido sinovial e de medula óssea de miniporcos, o que será útil para aplicações em pacientes.

As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de diversas doenças articulares, pois a população de MSC derivadas do líquido sinovial na cavidade sinovial é significativamente aumentada em pacientes atléticos. Embora este método possa fornecer subsídios para a medicina regenerativa, também pode ser aplicado a outros estudos, como a pesquisa sobre doenças autoimunes. Como as MSC de miniporco são autólogas, a imunossupressão pode interessar aos seres humanos.

Além dos outros cientistas, os responsáveis por demonstrar o procedimento serão Hyeon-Jeong Lee e Won-Jae Lee do meu nível três. Para começar, posicione um miniporco anestesiado para ter acesso à crista ilíaca. Em seguida, depile uma região de 15 centímetros quadrados na crista ilíaca, utilizando uma lâmina de barbear ou tesoura elétrica.

Em seguida, esfregue alternadamente a pele exposta três vezes com poviodine-iodo e etanol a 70%. Após secagem completa, aplique campos estéreis. Agora, pré-revesta uma seringa de dez mililitros com heparina, utilizando uma lavagem de três a quatro mililitros.

Isso impedirá que a medula óssea coagule durante a extração. Em seguida, exatamente na crista do osso ilíaco, acople firmemente um extrator de medula óssea à seringa revestida com heparina e extraia pelo menos cinco mililitros de medula óssea. Para isolar as células da medula óssea obtida, primeiramente dilua-a com um volume igual de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros à temperatura ambiente.

Em seguida, carregue três mililitros de meio de centrifugação em gradiente de densidade em um segundo tubo cônico de 15 mililitros. Depois, transfira cuidadosamente quatro mililitros da medula óssea diluída para cima do meio de centrifugação em gradiente de densidade, formando duas camadas de solução. Agora, centrifugue o tubo a 400 Gs por 40 minutos à temperatura ambiente.

As MNC desejadas são coletadas na camada branca central. Aspire apenas esta camada. Ejecte a camada de MNCs em um tubo cônico de 15 mililitros e dilua com sete a oito mililitros de DPBS.

Em seguida, centrifugue as células a 500 Gs durante dez minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e lave as células em pellet duas vezes com dez mililitros de DPBS, repetindo o ciclo anterior de centrifugação. Após as duas lavagens, suspendemos os MNCs em dois mililitros de ADMEM.

Em seguida, plaque as células em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros e incube-as a 38,5 graus Celsius em uma estufa com atmosfera úmida contendo 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas, aspire o meio juntamente com os MNCs não aderidos. Então, adicione novamente dois mililitros de ADMEM fresco e continue a incubação, trocando o meio a cada três dias.

Quando as células atingirem de 70 a 80% de confluência, lave o cultivo com DPBS fresco. Em seguida, dissocie as células utilizando um mililitro de Tripsina-EDTA 0,25% por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Colete as células em dez mililitros de ADMEM e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, centrifugue as células a 300 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Agora, suspenda os MNCs colhidos em um mililitro de ADMEM fresco e meça sua densidade. Finalize semeando entre meio milhão e três quartos de milhão de células em frascos T25 com quatro mililitros de ADMEM.

Incube os frascos da mesma forma que as placas e troque o meio a cada três dias. Prepare uma seção de pele de 15x10 centímetros sobre a articulação femoral, como foi feito ao preparar para a coleta de medula óssea. Em seguida, palpe para identificar a patela e as cristas da tíbia abaixo da pele, a fim de localizar a articulação sinovial, e insira uma seringa de três mililitros com agulha de 23 graus, precisamente na articulação.

Usando sucção suave, extraia entre meio e um mililitro de fluido e retire imediatamente a agulha. Se o volume do fluido sinovial for muito pequeno, lave a cavidade com DPBS para coletar o fluido sinovial com DPBS. O volume de DPBS a ser usado varia conforme o tamanho da cavidade sinovial.

O volume ideal de líquido sinovial é limitado na articulação saudável. O volume varia conforme o tamanho e a condição patológica da articulação. Para isolar as células do líquido sinovial, dilua o líquido com um volume igual de DPBS em um tubo cônico de 15 mililitros à temperatura ambiente.

Em seguida, removemos os detritos filtrando a diluição através de um filtro de células de náilon de 40 micrômetros. Depois, adicione mais dez mililitros de DPBS e centrifugue a suspensão a 400 Gs durante dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, descarte o sobrenadante e lave as células duas vezes, utilizando DPBS.

Suspendemos o pellet celular lavado em dois mililitros de ADMEM. Em seguida, prosseguimos com o cultivo das células conforme demonstrado com as MSCs. As MSCs foram isoladas com sucesso da medula óssea e das articulações sinoviais dos miniporcos e expandidas in vitro.

A morfologia das MSCs derivadas de líquido sinovial é semelhante à das MSCs derivadas de medula óssea: ambas apresentam formato fusiforme fibroblástico e são homogeneamente aderentes. As MSCs mostraram expressão positiva para coloração de fosfatase alcalina após a conclusão da terceira subcultura. Em seguida, os marcadores de superfície foram analisados em ambas as culturas.

Como esperado, ambos os tipos de MSCs expressaram significativamente CD29, CD44 e Vimentina. Em contraste, a expressão de CD34 e CD45 foi negativa e baixa. Esses resultados foram idênticos aos obtidos por meio de MSCs distintivas, incluindo células isoladas do líquido sinovial.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aspirar de forma não invasiva o líquido sinovial e a medula óssea para isolar suas CMM do miniporco e como realizar a comparação e o fenotipagem dessas CMM. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de localizar o ponto objetivo na crista ilíaca e na região sinovial, determinado por palpação cuidadosa. Após este procedimento, outros métodos, como em modelos de osteoartrite ou artrite reumatoide, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se não apenas as CMM da medula, mas também as CMM do líquido sinovial possuem a mesma capacidade de iniciar a formação de cartilagem ou osso e de promover imunossupressão.

Após seu desenvolvimento, esta técnica avançou a terapia autóloga de doenças articulares ao auxiliar na caracterização de CMMs derivadas de articulações afetadas ou inflamadas em pacientes com artrite.