Name: Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a modelar distrofia miotônica 1 em células C2C12 usando transfecção plasmidial e transdução viral. Este método permite investigar mecanismos patológicos genéticos em mioblastos.

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Agradecemos aos Drs. Tom Cooper do Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan da Universidade de Wisconsin-Madison e Didier Trono da Universidade de Genebra pelos reagentes. Este trabalho é apoiado por um fundo inicial da Universidade de Houston (YL), uma bolsa da American Heart Association (YL, 11SDG5260033) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (XP, 81460047).

1. Cultura celular C2C12 <ol><li> Manter mioblastos de ratinho C2C12 em uma placa de 100 mm de meio de crescimento (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado com soro de bovino fetal a 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. Permitir células C2C12 passadas para tornar-se cerca de 50 - 60% confluentes. </li><li> Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com solução salina de 3 ml à temperatura ambiente de fosfato tamponada (PBS). Remover o PBS e adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para desprender as células. Colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min. </li><li> Neutralizar a tripsina, adicionando meio de crescimento de 3 ml. Pipetar 6 - 8 vezes para suspender as células. Adicionar 1 ml de suspensão de células para uma nova placa de 100 mm e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. C2C12 transfecção celular / transdução e Seleção <ol><li> C2C12 transfecção de plasmídeo <ol><li> 24 h antes da transfecção, pfinal 7,0 x 10 5 células C2C12 para um poço de uma placa de seis poços para cada transfecção. Nota: Isto conduz a 50 - 60% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Permitir que o reagente de transfecção de vir até à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Adicionar 2 ug de ADN de plasmídeo (GFP-CUG5 ou GFP-CUG200) em 200 ul de pré-aquecido meio isento de soro e vortex brevemente. Adiciona-se reagente de transfecção 6 ul para a forma e misturar imediatamente durante 30 segundos usando um vórtice. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Mudar os meios de comunicação das células C2C12 de 2,5 ml de meio de crescimento isento de soro. Adicionar a mistura de transfecção às células após a incubação. Devolver as placas para um 5% de CO2, 37 ° C incubadora. </li><li> Manter as células em meio de crescimento da mistura de transfecção / isento de soro durante 4 horas ou até a noite. Mudança de mídia de volta para os meios de crescimento no dia seguinte ou quando citotoxicidade é aparente. Nota: A citotoxicidade é avaliada através de inspecção microscópica da cells. Observar as mudanças na morfologia celular e descolamento celular. Enquanto não existe uma citotoxicidade evidente, incubação durante a noite em meio de crescimento isento de soro aumenta a transfecção. </li><li> Seleccionar as células 48 horas após a transfecção por adição de 1,2-1,6 mg / ml de G418 para ~ 10 dias até que a cultura de controlo (transfectadas sem os plasmídeos) não tem células vivas. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias com meio de crescimento suplementado com G418. </li><li> Manter as células resistentes a G418 em meio de crescimento e 5% de CO2 a 37 ° C para as experiências subsequentes. </li></ol></li><li> preparação de retrovírus e transdução retroviral C2C12 <ol><li> Prepare meio de cultura de células HEK 293, completando DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. <ol><li> Aproximadamente 24 horas antes da transfecção, 4,0 x 10 placa 6 células de empacotamento ecotrópicas HEK 293 com base em uma placa de 100 milímetros (80% de confluência em transfecção) Cmeio de cultura celular ontaining. </li></ol></li><li> Permitir que o reagente de transfecção de vir até à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Misturar 15 ug de ADN plasmídeo (pMSCV-puro ou pMSCV-Celf1Flag-Puro) em 1 ml de meio de crescimento isento de soro. brevemente Vortex. Adicionar 30 ul de reagente de transfecção a partir do passo 2.2.2 para dentro do tubo de meio de crescimento de DNA / isento de soro, e misture bem com vórtex. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionar gota a gota, a mistura de transfecção das células de empacotamento ecotrópico HEK 293 com base em. Agite suavemente as placas e devolvê-los de volta para o CO2 a 5%, 37 ° C incubadora. Após 24 h, alterar os meios de comunicação para meio de crescimento fresco 10 ml de pré-aquecido. </li><li> Colher o sobrenadante (contendo retrovírus) 48 horas após a transfecção utilizando uma pipeta e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml de novas mídias quentes para a placa e devolvê-lo para a incubadora. Manter o sobrenadante a 4 ° C. Nota: A mídia é adicionado delicadamente para tele lado do poço de modo a não perturbar a monocamada celular. </li><li> Colher o segundo lote de sobrenadante 60 horas ap a transfeco e permitir a sua com o sobrenadante a partir de 2.2.5. Centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min para remover os detritos celulares. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Use retrovírus para transduzir células C2C12 neste ponto por prosseguir para o passo 2.2.9 ou aliquota e armazenar o sobrenadante a -20 ° C para uso futuro. </li><li> Descongelar o retrovírus de 2.2.7, à temperatura ambiente, se um lote congelado é usado aqui. Nota: Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento. </li><li> Placa células C2C12 no mesmo dia de transdução apontando para 30 - 40% de confluência. <ol><li> Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com 3 ml de PBS temperatura ambiente. Remover o PBS, adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA, e incuba-se a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min. </li><li> Neutraliza-se a tripsina por adição de 3 mL de crescimento Medio. Pipetar 6 - 8 vezes para suspender as células. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e adicionar 8,0 x 10 5 células C2C12 para uma placa de 60 mm. </li></ol></li><li> Adicionar 0,5 ml de retrovírus para infectar uma placa 60 milímetros de células em 3 media ml crescimento. Retornar a placa para a incubadora. </li><li> Substituir com 3 ml de meios frescos completados com antibiótico de selecção (puromicina 1-3 ug / ml) 48 h após a infecção. Substitua 3 ml de meio com antibióticos todos os dias para a 5 dias até que a cultura de controle C2C12 não transduzidas morre. </li></ol></li><li> preparação lentivírus e transdução lentiviral C2C12 Nota: Execute todos os procedimentos relacionados com o lentivírus no Nível de Biossegurança 2 gabinete e seguir as orientações de segurança biológica. resíduos líquidos contendo o vírus devem ser desinfectados antes de serem eliminados. <ol><li> Placa de 4,0 x 10 6 células 293T em uma placa de 100 mm (~ 80% de confluência no dia da transfecção) com células HEK 293 de meio de cultura celular (DMEM de alto teor de glucose, suplementado com 10% de fetalde soro bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina) 24 h antes da transfecção. </li><li> Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente. Misturar os vectores de embalagem lentiviral (4 ug pMD2.G e 6 ug psPAX2) em conjunto com o vector de transferência de 8 ug de lentivírus (Celf1 shRNA controlo scrambled ou shRNA) em 1 ml de meio de cultura de células sem soro. brevemente Vortex. </li><li> Adicionar 36 ul de reagente de transfecção pré-aquecido para o tubo de DNA / DMEM e misturar bem por vórtice. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Remover as células 293T da incubadora e adicionar a mistura de transfecção para a placa. Agite suavemente a placa e devolvê-lo de volta para 5% de CO2, 37 ° C incubadora. Após 24 horas, substitui-se a mistura de transfecção com 10 ml de meio de cultura fresco. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante contendo lentivírus 48 h após a transfecção e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml quentes novos meios para a placa e devolvê-lopara incubadora. Armazenar o sobrenadante a 4 ° C. </li><li> Recolhe-se o segundo lote de sobrenadante 60 horas ap a transfeco e combiná-la com o sobrenadante a partir de 2.3.5. brevemente centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml fresco. Se estiver usando vírus fresco, avance para o passo 2.3.9. No futuro, a loja de vírus contendo o sobrenadante a -20 ° C em alíquotas de 10 ml. </li><li> Descongelar o vírus a partir de 2.3.7, à temperatura ambiente antes da sua utilização, se um lote congelado é usado. Nota: Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento. </li><li> células de chapa de C2C12-CUG200 (obtida na Secção 2.1), tal como descrito em 2.2.9, no mesmo dia da transdução. Nota: Apontar para 30 - 40% de confluência. </li><li> Adicionar 0,5 ml de vírus para infectar uma placa de 60 mm de C2C12-CUG200 e devolver a placa à incubadora. </li><li> Substituir o meio de cultura com meio fresco suplementado com o antibiótico de selecção (puromicina 1-3 ug / ml) 72 horas após a transdução.Atualizar meios de cultura todos os dias com o antibiótico de seleção para a 5 dias até que toda a cultura de controle C2C12-CUG200 não transduzidas morre. </li><li> Use Western blot para verificar a knockdown Celf1 em células transfectadas GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. Diferenciação Celular C2C12 <ol><li> Placa 2 X 10 6 células em um poço de uma placa de 6 poços em 2,5 ml de meio de crescimento 24 h antes do início da diferenciação. Nota: A densidade de revestimento pode ser ajustada de modo que confluência completa é atingida em 24 horas. <ol><li> Lavar as células confluentes com PBS e adicionar 2,5 ml de meio de baixa diferenciação de soro (meio de Eagle modificado suplementado com 2% de soro de equino, penicilina 100 U / ml de Dulbecco, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1? M de insulina) . Substituir o meio de dois em dois dias. Nota: Mantenha a insulina estoque congelado e adicioná-lo para a mídia em cada mudança de meio. </li></ol></li><li> Durante a diferenciação C2C12, coleta de amostras para quanquan- RT-PCR (ver secção 4) nos seguintes momentos: Day0, 1, 2, 4 e 6. Processo de cultura para a imunocoloração no dia 6-8 (ver secção 5). </li></ol> 4. Isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo <ol><li> Use o protocolo do fabricante para isolamento de RNA. Após o isolamento, ressuspender o sedimento de ARN em 30 de água livre de RNase mL e pipeta cima e para baixo várias vezes. Nota: As amostras podem prosseguir para RT-PCR quantitativo, ou pode ser armazenado a -80 ° C. </li><li> Use um kit de RT qPCR para RT-PCR quantitativa 10 e siga as instruções do fabricante. Preparar a mistura de reacção de acordo com a Tabela 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume (uL) </td><td> concentração final </td></tr><tr><td> tampão de reacção 2x </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> iniciador directo </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> iniciador inverso </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Probe </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Transcriptase reversa e RNase Inhibitor </td><td> 0,1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Modelo </td><td> 1 </td><td> 100 ng de ARN total </td></tr><tr><td> RNase água livre </td><td> 7,4 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> Mix total </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. RT-PCR quantitativo mestre preparação da mistura de <ol start="3"><li> Execute a 20 mL de reação RT-qPCR utilizando perfil térmico Tabela 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> passo de transcrição reversa </td><td> 30 min, 48 ° C </td></tr><tr><td> polímero de DNAactivação ase / inactivação transcriptase reversa </td><td> 10 min, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 ciclos </td><td> 15 seg, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela perfil térmico 2. RT-PCR quantitativo 5. A imunocoloração <ol><li> Fixar a cultura em monocamada em 2,5 mL preparada de fresco paraformaldeído a 4% / PBS à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Permeabilizar as amostras em 2,5 ml de 0,1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Transferir as amostras para uma câmara humidif içada. Bloquear as amostras em 2,5 ml de tampão (0,1% de surfactante não iónico / PBS, 10% soro normal de cabra) de bloqueio durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Descartar o tampão de bloqueio e aplicar primário 800 ul de anticorpo contra a cadeia pesada da miosina diluída em tampão (1: 100) de bloqueio. Incubar durante a noite numa câmara humidificada à temperatura ambiente. </li><li> Lave a placa 3 timES (10 min cada) com 2,5 ml de tampão de lavagem (0,1% de polisorbato 20 / PBS) no dia 2. </li><li> Remover o tampão de lavagem e aplicar 800 ul de anticorpo secundário (IgG de cabra anti-ratinho, 1: 500 diluído em PBS). Incubar numa câmara humidificada à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar duas vezes (10 min cada) com 2,5 ml de tampão de lavagem. </li><li> Incubar com DAPI 800 ul (1 ug / ml, diluiu-se em água destilada desionizada H2O) durante 5 min. </li><li> Lava-se com 2,5 ml de tampão de lavagem mais uma vez durante 10 min. </li><li> Mudar o tampão de lavagem de 2,5 ml de PBS e usar um microscópio fluorescente para capturar as imagens. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

A linha de células C2C12 foi usado como um modelo para estudar miogénese 11-14. Estas células manter uma aparência do tipo fibroblastos, proliferam rapidamente em meios contendo 20% de soro fetal bovino e facilmente diferenciar em meio contendo 2% de soro equino 15. O rápido crescimento e diferenciação são características vantajosas em um modelo de célula miogénese. Aqui, demonstramos a utilização de plasmídeo, retroviral, e vectores lentivirais para introduzir ADNc, 3&#39;-UTR, e shRNA em células ...

Distrofia miotônica (DM) é uma doença autossômica dominante que afeta vários sistemas, principalmente músculos cardíacos e esqueléticos 1. Existem dois subtipos da doença, DM1 e DM2. DM1 é mais comum e tem uma manifestação mais grave do DM2 2. A mutação genética subjacente DM1 é uma expansão de repetições de tripletos CUG localizado na região não traduzida 3 &#39;(UTR) do gene da proteína quinase MS (DMPK) 3. O número de repetição CUG em indivíduos não afectados varia de 5 a 37. Por outro lado, aumenta a mais de 50, e, por vezes, até milhares em doentes DM1 4. Como resultado, as proteínas de ligação a ARN, tais como muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP, e elav-1 como família (Celf1), são desregulada. Devido ao sequestro nas repetições CUG expandidas, MBNL1 perde a sua capacidade de regular a splicing alternativo 5. Celf1, por outro lado, é sobre-regulada 6,7. A sobre-expressão de Celf1 está associada com a perda de músculoe fraqueza, que não são atribuídos a perda da função MBNL1. Os modelos animais simulando alterações relacionadas-DM1, incluindo DMPK 3&#39;-UTR expansão CUG, perda de MBNL1, e superexpressão de Celf1, foram estabelecidas. No entanto, a modelagem DM1 em mioblastos oferece uma alternativa eficiente, especialmente para dissecar eventos celulares e moleculares relacionados-DM1. A linha celular de mioblastos C2C12 foi isolado pela primeira vez a partir de músculo de rato C3H feridos e amplamente utilizado para estudar diferenciação 8,9 miogénica. células C2C12 proliferam rapidamente em soro fetal bovino (FBS) molecular contendo meios e prontamente sofrer diferenciação de FBS quando se esgota. No entanto, usando este modelo de diferenciação de mioblastos apresenta dois desafios: células C2C12 são muitas vezes resistentes a transfecção de genes / transdução viral; e pequenas variações na manipulação celular e processo de diferenciação pode levar a alterações marcadas na formação de miotubos. Nosso laboratório utiliza rotineiramente mioblastos C2C12 como acmodelo ell e desenvolveu protocolos que efetivamente entregar genes por transfecção de plasmídeo, transdução retroviral, e transdução lentiviral em linha celular C2C12 10. No vídeo, demonstramos os procedimentos otimizados para transfecção / transdução C2C12 células e manter a consistência diferenciação no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>para meio de cultura</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>para meio de cultura</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>para meio</td></tr><tr><td>de cultura Insulina do pâncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>para meio de diferenciação</td></tr><tr><td>equino soro</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>para meio de diferenciação</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; Reagente de Transfecção HD</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>para transfecção</td></tr><tr><td>Sulfato G418</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-418-10</td><td>para seleção resistente a medicamentos</td></tr><tr><td>Cloridrato de puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>para seleção resistente a medicamentos</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 poços</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Suportado 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE saúde ciências da vida</td><td>10600015</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Banco de Hibridoma de Desenvolvimento</td><td>MF 20</td><td>Ab primário para imunocoloração</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-rato, conjugado Texas Red-X Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secundário Ab para imunocoloração</td></tr><tr><td>Uma etapa qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>para qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Reagente</td><td>de isolamento Roche</td><td>11667165001</td><td>para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Anticorpo (3B1)</td> <td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primário Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin Anticorpo</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>cabra policlonal IgG para controle de carga</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Células 631507 Clontech</td><td></td><td>para preparação de retrovírus</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>vetor retroviral vazio para preparação de retrovírus</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>construído em casa</td><td>não disponível</td><td>codificação de vetor retroviral Celf1Flag, usado na preparação de retrovírus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>presente de Didier Trono</td><td>não disponível</td><td>para preparação de lentivírus</td></tr><tr><td>Presente pMD2.G</td><td>de Didier Trono</td><td>não disponível</td><td>para preparação de lentivírus</td></tr><tr><td>Presente GFP-CUG5</td><td>de M.S. Mahadevan</td><td>não disponível</td><td>detalhes na referência 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Presente GFP- CUG200</td><td>de M.S. Mahadevan</td><td>não disponível</td><td>detalhes na referência 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritão&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>de paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>para imunocoloração</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>para imunocoloração</td></tr></tbody></table>

modelando myotonic distrofia 1 em células c2c12 de mioblastos

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

A distrofia miotônica 1 (DM1) é uma forma comum de distrofia muscular. Embora vários modelos animais foram estabelecidos para DM1, modelos celular de mioblastos ainda são importantes porque eles oferecem uma alternativa eficiente celular para estudar eventos celulares e moleculares. Embora as células C2C12 de mioblastos tem sido amplamente utilizado para estudar a miogenese, a resistência à transfecção do gene, ou a transdução virai, dificulta a pesquisa em células C2C12. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado que inclui procedimentos de manutenção diária, transfecção e transdução para introduzir genes em mioblastos C2C12 e a indução de diferenciação dos miócitos. Colectivamente, estes processos permitem melhores eficiências de transfecção / transdução, bem como os resultados consistentes de diferenciação. O protocolo descrito no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1 celulares beneficiaria o estudo de distrofia miotónica, bem como outras doenças musculares.

células C2C12 foram transfectadas com GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Após a selecção de resistência a drogas, estáveis ​​piscinas foram estabelecidas, que podem ser visualizados por expressão da GFP (Figura 1A). Formação de miotubos diferenciadas nos mioblastos foi detectado por imunocoloração miosina de cadeia pesada 10 (Figura 1B). A quantificação de formação de miotubos demonstrou que os índices de fusão foram diminuiu de 35,4 ± 4,1% para 2,6 ± 1,...

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.

Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

O objetivo geral desses procedimentos de manutenção, transfeção e transdução de mioblastos é estabelecer um modelo celular da distrofia miotônica tipo um para o estudo da distrofia miotônica e de outras doenças musculares. Este método pode auxiliar no estabelecimento de modelos celulares de mioblastos M1 que serão úteis para investigar o mecanismo detalhado da patogênese do tipo M1. Essa manipulação gênica em múltiplos níveis de mioblastos C2C12 permite modelar eventos patológicos genéticos sequenciais no tipo M1. Vinte e quatro horas antes da transfeção, plaque sete vezes 10 à quinta células C2C12 por poço em uma placa de seis poços.No dia seguinte, adicione dois microgramas do DNA plasmidial de interesse a 200 microlitros de meio sem soro, à temperatura ambiente, e vortexe brevemente a solução. Em seguida, adicione seis microlitros do reagente de transfeção à temperatura ambiente ao meio e vortexe imediatamente a solução por 30 segundos. Incube então o meio à temperatura ambiente por 30 minutos.Nos últimos cinco minutos da incubação, substitua o meio em cada poço por dois vírgula cinco mililitros de meio de crescimento fresco sem soro e adicione duzentos microlitros da mistura de transfeção a cada poço. Retorne a placa ao incubador de cultura celular por quatro horas.Em seguida, verifique as células ao microscópio quanto a alterações em sua morfologia e adesão. Se for observada citotoxicidade, substitua o meio livre de soro por meio de crescimento. 48 horas após a transfeção, adicione o antibiótico de seleção apropriado em meio de crescimento fresco a cada dois dias, durante 10 dias.Até que o controle transfectado sem plasmídeos não contenha células vivas. Para preparar o retrovírus, plaque inicialmente quatro vezes 10 à sexta células embaladoras HEK293 de tropismo ecológico em uma placa de 100 milímetros contendo meio de cultura celular. No dia seguinte, misture 15 microgramas do DNA plasmidial de interesse em um mililitro de meio de crescimento sem soro e vortexe brevemente o tubo.Em seguida, adicione 30 micro litros de reagente de transfeção à temperatura ambiente ao meio e vortexie imediatamente a solução por 30 segundos. Após 30 minutos à temperatura ambiente, adicione a mistura de transfeção gota a gota às células ecotrópicas e agite suavemente a placa. Retorne a placa ao incubador de cultura celular por 24 horas, substituindo o meio no dia seguinte por 10 mililitros de meio de crescimento fresco a 37 graus Celsius.48 horas após a transfeção, utilize uma pipeta para transferir os sobrenadantes contendo o retrovírus para um único tubo cônico de 50 mililitros, para armazenamento durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de novo meio aquecido pela lateral da placa e retorne a cultura ao incubador. Colete o segundo lote de retrovírus 60 horas após a transfeção.Reunindo-o com o retrovírus coletado às 48 horas. Centrifugue o sobrenatante para remover qualquer debris celular e transfira o retrovírus para um novo tubo de 50 mililitros. Agora lave cada poço de um cultivo celular C2C12 com três mililitros de PPS à temperatura ambiente, seguido pela adição de 500 microlitros de tripsina EDTA a zero vírgula vinte e cinco por cento para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.Quando as células se desprendem, neutralize a reação em cada poço com três mililitros de meio de crescimento e triture o cultivo de seis a oito vezes para dissociar as células em uma suspensão unicelular. Após a contagem, adicione oito vezes 10 à quinta potência de células a uma placa de 60 mililitros e acrescente três mililitros de meio de crescimento. Em seguida, infecte as células com zero vírgula cinco mililitros de retrovírus e retorne a placa ao incubador por 48 horas.Após dois dias, alimente as células com três mililitros de meio de crescimento fresco, suplementado com o antibiótico de seleção apropriado todos os dias durante cinco dias, até que a cultura controle de C2C12 não transduzidas não contenha mais células vivas. Para a transdução lentiviral de células C2C12, em uma cabine de segurança biológica nível dois, plaque quatro vezes 10 à sexta potência de células 293T em uma placa de 100 milímetros com meio de cultura de células HEK293.No dia seguinte, misture os vetores empacotadores lentivirais com oito microgramas do vetor de transferência lentiviral apropriado, em um mililitro de meio de cultura celular livre de soro. Agite brevemente a mistura em vórtex e adicione 36 microlitros de reagente de transfeção pré-aquecido. Em seguida, agite novamente o meio em vórtex por mais 30 segundos e incube a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos.No final da incubação, adicione a mistura de transfeção às células 293T, gire suavemente a placa e retorne as células para a incubadora. Após 24 horas, substitua a mistura de transfeção por 10 mililitros de meio de cultura fresco. Após 48 horas, transfira o sobrenadante contendo lentivírus para um tubo cônico de 50 mililitros para armazenamento a quatro graus Celsius e adicione 10 mililitros de meio fresco e pré-aquecido à placa.Após 60 horas, reúna o segundo lote do sobrenadante com o lentivírus coletado às 48 horas e centrifugue o vírus para remover qualquer debris celular. Em seguida, adicione zero vírgula cinco mililitros de lentivírus a uma cultura de células C2C12 CUG200 com confluência de 30 a 40 por cento, cultivadas em uma placa de 60 milímetros, conforme acabou de ser demonstrado. 72 horas após a transfeção, substitua o sobrenadante do lentivírus por meio fresco, suplementado com o antibiótico de seleção apropriado.Renove o meio de cultura diariamente durante cinco dias com meio fresco suplementado com antibiótico de seleção, até que todas as células controle C2C12 CUG200 não transduzidas estejam mortas. Após a seleção por resistência ao fármaco, a expressão de GFP e a formação de miotúbulos em mioblastos diferenciados podem ser avaliadas por meio de uma análise manofluorescente. A quantificação da formação de miotúbulos neste experimento representativo demonstra que os índices de fusão e as áreas dos miotúbulos são significativamente reduzidos pela expansão anormal de CUG e pelas células transfectadas com GFP CUG 200.A superexpressão de Celf1 também está associada à expansão de CUG na distrofia miotônica tipo um. Além disso, o western blot demonstra consistentemente um aumento nos níveis da proteína Celf1 com a inibição da expressão de MyoD, MyoG e Mef2C durante a diferenciação. O que sugere que a expansão de CUG induz defeitos em miotubos e diferenciação prejudicada de mioblastos.A análise por Western blot também revela que a proteína Celf1 com marcação FLAG está presente apenas em culturas transduzidas com vetor retroviral e que sua expressão é aumentada nessas culturas. De fato, a formação de miotúbulos é rara em células que superexpressam Celf1 em comparação com culturas controle, sugerindo que a superexpressão de Celf1 prejudica severamente a diferenciação de mioblastos.Além disso, o nível de proteína endógena Celf1 e de células GFP CUG 200 transduzidas com vetor lentiviral selecionado por duplo antibiótico é acentuadamente reduzido na presença de RNA de interferência em alça curta (shRNA) contra Celf1. Com isso, observa-se a recuperação da formação de miotubos, dos índices de fusão de miotubos e das áreas de miotubos nessas culturas. Enquanto isso, os resultados de RT-PCR em tempo real sugerem que a expressão de MyoD, MyoG e Mef2C está significativamente aumentada em células que expressam shRNA contra Celf1, sustentando a possibilidade de que a deficiência na diferenciação de miócitos provocada pela redução de Celf1 tenha sido revertida nessas culturas.Ao realizar este procedimento, é importante monitorar a densidade das células C2C12 para que esteja abaixo de 70 por cento de confluência. Após a transfeção celular, trate as células com meio livre de soro por pelo menos quatro horas, mas não mais que 12 horas. Enquanto monitora a citotoxicidade celular.Por meio do uso de transfeção de plasmídeo, transdução retroviral e lentiviral, estabelecemos com sucesso um modelo celular de distrofia miotônica que beneficiará a pesquisa nesta e em outras doenças musculares.

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