Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos

O objetivo geral desses procedimentos de manutenção, transfecção e transdução de mioblastos é estabelecer um modelo de distrofia miotônica de uma célula para o estudo da distrofia miotônica e outras doenças musculares. Este método pode ajudar a estabelecer os modelos de células de mioblastos M1 que serão úteis na investigação do mecanismo detalhado da patogênese M1. Esta manipulação gênica em várias camadas de mioblastos C2C12 permite a modelagem de eventos patológicos sequenciais e genéticos nas M1.24 horas antes de sua placa de transfecção sete vezes 10 para a quinta célula C2C12 por poço em uma placa de seis poços.

No dia seguinte, adicione dois microgramas do DNA do plasmídeo de interesse em 200 micro litros de temperatura ambiente, sem soro, médio e brevemente vórtice da solução. Em seguida, adicione seis micro litros de reagente de transfecção à temperatura ambiente ao meio e imediatamente vortex a solução por 30 segundos. Em seguida, incube o meio em temperatura ambiente por 30 minutos.

Durante os últimos cinco minutos da incubação. Substitua o meio em cada poço por dois vírgula cinco mililitros de meio de crescimento livre de soro fresco e adicione 200 microlitros de mistura de transfecção a cada poço. Retorne a placa para a incubadora de cultura de células por quatro horas.

Em seguida, verifique as células ao microscópio quanto a alterações em sua morfologia e fixação. Se for observada citotoxicidade, substitua o meio livre de soro por meio de crescimento. 48 horas após a transfecção, adicionar o antibiótico de seleção apropriado em meio de crescimento fresco a cada dois dias durante 10 dias.

Até o controle transfectado sem plasmídeos bem não contém células vivas. Para preparar o retrovírus, primeiro coloque quatro vezes 10 elevado a sexto ecotrópico HEK293 em uma placa de 100 milímetros contendo meio de cultura celular. No dia seguinte, misture 15 microgramas do DNA do plasmídeo de interesse em um mililitro de meio de crescimento livre de soro e faça um vórtice breve do tubo.

Em seguida, adicione 30 microlitros de reagente de transfecção à temperatura ambiente ao meio e imediatamente vortex a solução por 30 segundos. Após 30 minutos em temperatura ambiente, adicione a mistura de transfecção gota a gota às células ecotrópicas e gire suavemente a placa. Retorne a placa à incubadora de cultura de células por 24 horas, substituindo o meio por 10 mililitros de meio de crescimento fresco a 37 graus Celsius no dia seguinte.

48 horas após a transfecção, use uma pipeta para transferir os sobrenadantes contendo retrovirais para um único tubo cônico de 50 mililitros para armazenamento noturno a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio quente novo na lateral da placa e retorne a cultura à incubadora. Colha o segundo lote de retrovírus 60 horas após a transfecção.

Agrupando-o com o retrovírus coletado em 48 horas. Gire o sobrenadante para remover quaisquer detritos celulares e transfira o retrovírus para um novo tubo de 50 mililitros. Agora lave cada poço de uma cultura de células C2C12 com três mililitros de PPS em temperatura ambiente, seguido pela adição de 500 microlitros de EDTA de tripsina de ponto zero e dois cinco por cento para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.

Quando as células se desprenderem, neutralize a reação em cada poço com três mililitros de meio de crescimento e triture a cultura de seis a oito vezes para dissociar as células em uma única suspensão celular. Após a contagem, adicione oito vezes 10 às quintas células a uma placa de 60 mililitros e adicione três mililitros de meio de crescimento. Em seguida, infecte as células com zero vírgula cinco mililitros de retro vírus e devolva a placa à incubadora por 48 horas.

Após dois dias, alimente as células com três mililitros de meio de crescimento fresco, suplementado com o antibiótico de seleção apropriado todos os dias durante cinco dias. Até que a cultura de controle C2C12 não transduzida não contenha mais células vivas. Para transdução lentiviral de células C2C12, em um gabinete de nível de biossegurança dois, coloque quatro vezes 10 para as sextas células 293T em uma placa de 100 milímetros com meio de cultura de células HEK293.

No dia seguinte, misturar os vectores de embalagem lenitviral com oito microgramas do vector de transferência lenitviral adequado, num mililitro de meio de cultura de células livres de soro. Vortex a mistura brevemente e adicione 36 micro litros de reagente de transfecção pré-aquecido. Em seguida, vórtice o meio por mais 30 segundos e incube a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos.

No final da incubação, adicione a mistura de transfecção às células 293T, gire suavemente a placa e retorne as células à incubadora. Após 24 horas, substitua a mistura de transfecção por 10 mililitros de meio de cultura fresco. Após 48 horas, transfira o sobrenadante contendo lentivírus para um tubo cônico de 50 mililitros para armazenamento de quatro graus Celsius e adicione 10 mililitros de meio fresco e quente à placa.

Após 60 horas, agrupe o segundo lote de sobrenadante com o lentivírus coletado em 48 horas e centrifugue o vírus para remover quaisquer detritos celulares. Em seguida, adicione cinco mililitros de lentivírus a uma cultura confluente de 30 a 40 por cento de células C2C12 CUG200 assentadas em uma placa de 60 milímetros, como acabamos de demonstrar. 72 horas após a transfecção, substituir o sobrenadante do lentivírus por meio fresco, suplementado com o antibiótico de selecção adequado.

Atualizando o meio de cultura todos os dias durante cinco dias com meio suplementado com antibiótico de seleção fresca, até que todas as células de controle C2C12 CUG200 não transduzidas estejam mortas. Após a seleção da resistência aos medicamentos, a expressão de GFP e a formação de miotubos de miobastões diferenciados podem ser avaliadas por uma análise manofluorescente. A quantificação da formação de miotubos neste experimento representativo demonstra que as indecisas de fusão e as áreas do miotubo diminuem significativamente pela expansão anormal do CUG e células transfectadas GFP CUG 200.

A regulação positiva de Celf1 também está associada à expansão do CUG na distrofia miogênica um. Além disso, o western blotting demonstra consistentemente a elevação dos níveis de proteína Celf1 com CUG inibindo a expressão de MyoD, MyoG e Mef2C durante a diferenciação. Sugerindo que a expansão do CUG induz defeitos do miotubo e prejudica a diferenciação de mioblastos.

A análise de Western blot também revela que o Celf1 marcado com FLAG está presente apenas em culturas transduzidas por vetores retrovirais e que sua expressão é regulada positivamente nessas culturas. De fato, a formação de miotubos é rara em células superexpressas de Celf1 em comparação com culturas de controle. Sugerindo que a superexpressão de Celf1 prejudica gravemente a diferenciação de mioblastos.

Além disso, o nível de proteína Celf1 endógena e células GFP CUG 200 transduzidas por vetor lentiviral selecionado por antibiótico duplo é marcadamente reduzido na presença de RNA de grampo curto Celf1. Com o resgate da formação do miotubo, a fusão do miotubo indecisa e as áreas do miotubo observadas nessas culturas. Enquanto isso, os resultados de RTPCR em tempo real sugerem que a expressão de MyoD, MyoG e Mef2C está significativamente aumentada em células que expressam RNA de grampo curto Celf1, apoiando a possibilidade de uma deficiência de diferenciação de miócitos resgatada por Celf1 nessas culturas.

Ao tentar este procedimento, é importante monitorar a densidade celular C2C12 para estar abaixo de 70% de confluência. Após a transfecção celular, trate as células com meio livre de soro por pelo menos quatro horas, mas não mais que 12 horas. Enquanto monitora a citotoxicidade das células.

Através do uso de transfecção de plasmídeo, transdução retroviral e lentiviral, estabelecemos com sucesso um modelo de célula de distrofia miotônica que beneficiará a pesquisa nesta e em outras doenças musculares.