Name: Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a melhorar o alinhamento axonal e a mielinização de neurônios do gânglio da raiz dorsal usando um sistema de cultura celular pré-estático. Este método promove a regeneração nervosa.

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Os autores gostariam de agradecer a Eric Vasco por sua ajuda na preparação dos substratos PDMS, Dr. Shiyong Wang no laboratório do Dr. Marina Mata da Universidade de Michigan para sugestões e formação do isolamento DRG votos, e Dr. Mark Tuszynski e Dr . W. Marie Campana na UC San Diego para sugestões úteis e protocolo para o isolamento SC. Este estudo foi apoiado em parte pela National Science Foundation (CBET 0.941.055 e 1.510.895 CBET), o Instituto Nacional de Saúde (R21CA176854, R01GM089866 e R01EB014986).

Todos os procedimentos para o isolamento das células foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual de Michigan. 1. Preparação de pré-esticado superfície anisotrópica <ol><li> Misturar a 10: solução de base e um agente de cura e verter a mistura em um prato de cultura de tecidos (12 cm de diâmetro). Use 4,900 mg de base e 490 mg de agente de cura para a mistura total de reticulação. </li><li> Manter a mistura de gel sob vácuo durante 20 min para remover as bolhas de ar. </li><li> Coloque a mistura de gel no forno de cura durante a noite a 60 ° C. </li><li> Após a cura da membrana PDMS, tratar a superfície com plasma de oxigénio utilizando um sistema de limpeza / gravação por plasma durante 3 min a 165 mTorr 65 e fluxo sccm de O2. </li><li> Corte um pedaço de membrana rectangular (5 × 3,5 cm) do prato, ao ser consciente de que lado é tratada com oxigênio, verifique se o lado tratado com oxigênio é voltado para cima e fixar em um quadro de alongamento. Coloque o quadro em uma<html> alongamento fase e esticar uniformemente girando o botão na fase até atingir 10% de alongamento (ou algum outro extensível pré-determinado, o alongamento pode ser lida directamente a partir da fase de alongamento), em relação ao maior eixo 9. Corrigir o estiramento, apertando os parafusos da moldura. </li><li> Retire a armação do palco. Certifique-se de superfície da membrana é seca e livre de poeira, em seguida, coloque uma câmara de silicone para a membrana permitindo que o lado adesivo da câmara para prender firmemente à membrana. Nota: A câmara de silicone fornece um poço para reter o meio de células na membrana de PDMS. O design do dispositivo é mostrado na Figura 1. </li><li> Esterilizar a superfície com UV durante 10 min. </li><li> Adicionar 1 ml de poli-L-lisina (PLL) (0,01% em tampão fosfato salino) para a superfície de PDMS no interior da câmara, dentro de seis horas de tratamento com plasma e incubar durante 2 horas a 37 ° C antes de semear os neurónios DRG. Isto aumenta a fixação das células. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Isolamento de DRG <ol><li> Prepare meio de crescimento padrão para os neurônios do GRD. </li><li> Antes do isolamento, autoclave o equipamento e os reagentes de isolamento de filtro. Adicionar 5 ml de tampão de isolamento para um poço de uma placa de 6 poços, e colocar a placa em gelo. Preparar 10 ml de meio de dissociação por adição de 1 ml de colagenase A (500 U / ml) a 9 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtra-se as soluções com um filtro de 0,22 um e colocar em gelo. </li><li> Use dez a doze 5-7 velhos ratos Sprague-Dawley &#39;dias para o isolamento. Pulverize os filhotes com 75% isopropanol, e sacrifício por decapitação. </li><li> Cortar a pele que recobre a medula espinhal da parte de trás e remover qualquer excesso de tecido em torno da coluna. Sob uma lupa cirúrgica com as luzes do ponto cirúrgicos em, fazer a primeira incisão do pescoço e, em seguida, um corte ao longo da coluna em ambos os lados com uma tesoura. Retire a coluna vertebral do corpo dos filhotes e remover os músculos em excesso. Em seguida, use uma tesoura para cortar ao longo da long eixo da coluna vertebral e utilizar uma pinça para abrir completamente a coluna vertebral e extrair o cord.Remove a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml. </li><li> Usando um belo par de pinças, retire o gânglio do bolso óssea e recolher cerca de 10-16 DRG de ambos os lados. Aparar as raizes nervosas e transferir os gânglios para o tampão de isolamento arrefecido em gelo. </li><li> Remover a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml. Após a dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min. </li><li> Deixe os tecidos assentar no fundo do tubo suavemente e remover o tampão de isolamento na parte superior e adicionar 10 ml de meio de dissociação para dentro do tubo. </li><li> Incubar os tecidos dissecados no meio de dissociação, em um banho de água a 37 ° C durante 1 h enquanto se agita o tubo a cada 5-10 min. </li><li> Depois dea dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de crescimento standard e vortex. </li><li> Centrifugar as células dissociadas como indicado na secção 2.9, mais uma vez. </li><li> Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 12 ml de meio de crescimento standard e vortex. </li></ol> 3. Cultura do DRG na superfície pré-esticado <ol><li> Antes de semear as células, as soluções remover PLL a partir da câmara e lavar a superfície de PDMS com água estéril e seca ao ar. </li><li> Depois de re-suspender as células, deixar que o conjunto de suspensão de 1 - 2 minutos para permitir que os detritos assentem no fundo do tubo. Adicionar 1,5 ml de suspensão de células em cada câmara de estiramento e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Para eliminar as células gliais, com 1 dia in vitro (DIV), adicionar 10 ul (ou 15 ul) de uma mistura de 2-fluoro-desoxi uridina e uridina (FDU-L) da solutiem (Ver Tabela de Materiais) para cada poço. Após 7 h, substituir este meio com meio de crescimento fresco padrão e colocar o dispositivo de cultura pré-esticado numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Durante o período de cultura de células (2 - 3 semanas), alterar o suporte de dois em dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio fresco. Nota: Após cultura nas superfícies estiradas e não estiradas de 2 semanas, SCs purificados são adicionados à câmara e cultivadas durante mais uma semana (fase 4.7). </li></ol> 4. Co-cultura de células de Schwann (SCS) com DRG neurônios na superfície pré-esticado <ol><li> Isolar SCs como descrito por grupo previamente 15 do Dr. Campana. <ol><li> Resumidamente, isolar o SCs de um filhote de cachorro 1 dia de idade. Coletar e dissociar o nervo ciático tanto química (tripsina-EDTA e colagenase A) e mecanicamente (18 gauge agulha / seringa de 10 ml) 15. </li><li> Semear as células dissociadas em poli-D-lisina (PDL) coATED balão T25 e a cultura a 37 ° C em 5% de CO 2. No dia 5, purificar as células através de selecção de anticorpos utilizando anti-thy 1,1 de anticorpo e complemento de coelho e subcultura das células purificadas a passagem 2 - 4. média Utilização de cultura contendo de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS) , 1% de penicilina / estreptomicina (pen / Strep), 21 ug / ml de pituitária de bovino Extracto (BPE), e 4 | iM Forskolin. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura a partir do SC, e adicionam-se 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para o balão. Incubar as células a 37 ° C em CO2 5% durante 2-3 min. </li><li> Verificar as células ao microscópio óptico usando uma objectiva de 10X para ver se eles levantam a partir do frasco, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e misturar com as células do frasco. </li><li> Adicionar a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg e 20 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 7 ml med crescimento DRG padrãoI a. </li><li> Tomar 10 ul de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, misturar com 10 uL de azul de tripano, e depois contar o número de células utilizando um hemocitómetro sob microscopia óptica utilizando uma objectiva de 10X. Dilui-se a suspensão de células a 5000 células por ml pela adição de meio de crescimento DRG. </li><li> Retirar 0,5 mL de meio de cultura a partir do DRG na câmara esticada e adicionar 0,5 ml de suspensão de SC para a cultura de DRG. </li><li> Cultura as células durante 1 semana a 37 ° C e 5% de CO 2. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio de crescimento padrão fresco para DRG. Após co-cultura uma semana, o processo as células por imuno-histoquímica 10. </li></ol>

<ol><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+C+%22Layer-by-Layer+Films+for+Biomedical+Applications%22">Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).</li>
<li>Faweett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral Nerve Regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li>
<li>Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+adult+rat+corticospinal+tract+by+transplants+of+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.</a> Science. 277, 2000-2002 (1997).</li>
<li>Geller, H. M., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+bridge%3A+Engineering+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Building a bridge: Engineering spinal cord repair.</a> Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).</li>
<li>Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+is+accompanied+by+chronic+progressive+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination.</a> J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).</li>
<li>Chua, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+neurites+sense+the+depth+of+the+underlying+topography+during+neuronal+differentiation+and+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance.</a> Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).</li>
<li>Dowell-Mesfin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographically+modified+surfaces+affect+orientation+and+growth+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons.</a> J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).</li>
<li>Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+small+on+large%3A+Potential+utility+in+computations+of+fluid-solid+interactions+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Method+Appl+M%22%5BJournal%5D)">Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries.</a> Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Static+Pre-stretch+Induced+Surface+Anisotropy+on+Orientation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+pre-stretch+induced+surface+anisotropy+on+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Berns, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+neurite+outgrowth+and+directed+cell+migration+in+self-assembled+monodomain+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels.</a> Biomaterials. 35, 185-195 (2014).</li>
<li>Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron%2Fastrocyte+co-culture+on+polyelectrolyte+multilayer+films%3A+A+template+for+studying+astrocyte-mediated+oxidative+stress+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons.</a> Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neurite+growth+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+and+increased+colocalization+with+Schwann+cells+on+aligned+poly%28methyl+methacrylate%29+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers.</a> Brain Research. 1565, 18-27 (2014).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+Extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+%28LRP1%29+Regulates+Rac1+and+RhoA+Reciprocally+to+Control+Schwann+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).</li>
<li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li>
<li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li>
<li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChandra%2C+G+%22Organosilicon+Materials%22">Organosilicon Materials</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li>
<li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesse a divulgar.

Para induzir o alinhamento axónio na superfície pré-esticado, existem dois passos essenciais: 1) a membrana PDMS tem de ser plana e de espessura homogénea; e 2) células gliais deve ser removido a partir do DRG. Depois de misturar os PDMS e agente de reticulação e cura em um forno, o gel PDMS reticulado deve ser mantido no topo de uma bancada plana e manuseadas com cuidado para evitar qualquer inclinação. O tratamento com plasma de oxigénio da membrana PDMS deve ser seguido dentro de 6 horas por revestimento de PLL, uma ...

Em lesões nervosas, os cotos proximal e distal do nervo são muitas vezes impedidos de realinhamento direta dos fascículos nervosos devido ao local da lesão 1-2. Normalmente, intervalos de axônios são compostos por feixes altamente ordenadas e alinhadas de axônios, que formam complexas redes de conectividade. No entanto, a regeneração do nervo é um processo caótico devido ao alinhamento axônio mal organizado 3-4. Por isso, para gerar um número suficiente de regeneração de axónios que preenchem o local da lesão, é necessário para induzir o alinhamento axonal bem organizada. Além disso, a desmielinização acompanha lesões nervosas devido à morte das células mielinizantes no local da lesão. Desde desmielinização prejudica fortemente a capacidade condutora de sobreviver axônios, os tratamentos visam desmielinização ou promover remielinização são significativos para a recuperação funcional após a lesão do nervo 5. Assim, o objetivo deste protocolo é para ilustrar uma abordagem de engenharia que aborda estas duas questõesda regeneração do nervo. Anisotropia de superfície, que é definido como a diferença, quando medida ao longo de eixos diferentes, nas propriedades físicas ou mecânicas de um material, tem sido aplicado para influenciar alinhamento de células, o crescimento, a migração e 6-7. Além de topografia, existem outros métodos para induzir a anisotropia. Anteriormente, foi investigada anisotropia superfície induzida por processos mecânicos de pré-alongamento estático de poli-dimetil-siloxano (PDMS) de membrana. A teoria da &quot;Super pequena deformação imposta em grande&quot; previu que a rigidez efectiva das células sentir na direcção esticada difere da direcção perpendicular, e esta diferença de rigidez efectiva é devido à superfície de anisotropia 8. As células estaminais mesenquimais (MSCs) cultivadas numa membrana pré-esticado PDMS são capazes de detectar a anisotropia puxando de forma activa à superfície e, como resultado, alinham na direcção pré-esticado 9. Da mesma forma, uma superfície AR anisotrópicaisinger a partir de uma superfície pré-esticado mecânica afeta o alinhamento, assim como o crescimento e a mielinização do gânglio da raiz dorsal (DRG) axônios 10. Aqui nós fornecemos um protocolo para a indução de anisotropia de superfície sobre um substrato pré-estirado estática PDMS para melhorar a regeneração do axônio 10. Para obter o alinhamento axônio, características topológicas com padrões desejados, relatou para fornecer orientação contato através de fibras e canais 6,11-12 alinhados, foram demonstrados para facilitar o alinhamento axônio 11,13. No entanto, relataram técnicas para induzir alinhamento axónio através características topológicas, tais como fibras, e canais de modelação, não foram capazes de prolongar e aumentar a espessura dos axónios. Em contraste, gradual estiramento mecânico levou ao alinhamento axónio na direcção do estiramento, com axónios compridas e espessas, que aumentaram com a magnitude do troço 14. No entanto, com dispositivo de motor movido in vivo não éfactível. Em contraste, anisotropia induzida pré-esticado estática é menos complicado e pode ser mais facilmente incorporados em futuros desenhos de andaime para aplicações in vivo. Neste protocolo, um sistema de cultura de células pré-esticado estático é usado para induzir a anisotropia superfície sem características topológicas. O sistema de cultura de pré-esticado é constituído por uma membrana de PDMS, um quadro esticável e uma etapa de alongamento, após o que a membrana é fixada sobre a armação e um troço magnitude predeterminada é aplicada sobre a fase de alongamento. neurónios DRG isoladas de fresco de cultura na superfície pré-esticado por até 21 dias são monitorados para o alinhamento axónio e espessura. Posteriormente, as células de Schwann (SCs) co-cultivadas com os axônios alinhados são monitorados para a mielinização. Ao incorporar pré-estiramento induzido anisotropia superfície fomos capazes de aumentar a célula Alinhamento de diferenciação e axônio Alinhamento de crescimento de MSCs e neurônios DRG 9-10, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Meio Neurobasal 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Nervoso-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Trevigen</td><td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-2 desoxi-uridina</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada (HBSS)</td> <td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Tampão de isolamento</td></tr><tr><td>tipo I colagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>de soro bovino fetal inativado por calor</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BPE Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de silicone</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de limpeza/gravação de plasma</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Thy 1.1</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Complemento de Coelho</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> <td>de crescimento padrãoPara 500 ml de meio neurobasal 1x, adicione 10 ml de B-27 50x, 5 ml de Glutamax-I 100x, 2,5 ml de penicilina / estreptomicina (Penn / Strep), 1 ml de Albumax-I e 1 &mu; l de NGF-- 7S (50 &mu; g/ml).</td></tr><tr><td>FDU Solução-mãe</td><td></td><td></td> de uridina <td>FDU 100 mg em 10 ml de ddH2O (10 mg/ml), filtrar no exaustor e dividido em 500 &mu; l alíquotas e conservar a -20 &C. Uridina 5 g em 166,7 ml de ddH2O (33 mg/ml), filtrar no capô, dividir em 200 &mu; l alíquotas e armazenar a -20 &ordm;C.
Pegue 61,5 &mu; l de FDU (10 mg/ml) e 20,5 &mu; l de uridina(33 mg/ml) e adicionar 4.918 &mu; l de ddH2O até uma concentração final de matéria-prima, dividir em alíquotas de 1 ml e conservar a -20 °C.</td></tr></tbody></table>

uma abordagem para reforçar alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

A regeneração do axônio é um processo caótico devido em grande parte ao alinhamento desorganizado do axônio. Portanto, para que um número suficiente de axônios regenerados faça a ponte sobre o local da lesão, é necessário um alinhamento axonal adequadamente organizado. Como a desmielinização após lesão nervosa prejudica fortemente a capacidade condutora dos axônios sobreviventes, a remielinização é fundamental para o funcionamento bem-sucedido dos nervos regenerados. Anteriormente, demonstramos que as células-tronco mesenquimais (MSCs) se alinhavam em uma superfície anisotrópica induzida por pré-estiramento porque as células podem sentir uma rigidez efetiva maior na direção esticada do que na direção perpendicular. Também mostramos que uma superfície anisotrópica decorrente de uma superfície pré-esticada mecânica afeta de forma semelhante o alinhamento, bem como o crescimento e a mielinização dos axônios. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para preparar uma superfície anisotrópica pré-esticada, o isolamento e a cultura de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) em uma superfície pré-esticada e mostramos o comportamento de mielinização de uma co-cultura de neurônios DRG com células de Schwann (SCs) em uma superfície pré-esticada.

O sistema de cultura de células pré-esticado promovido DRG alinhamento 10 axónio. neurónios DRG foram cultivadas em superfícies pré-esticado e não estiradas durante 12 dias. Os axónios foram corados para β-III-tubulina para demonstrar o seu alinhamento. A Figura 2 compara a orientação axonal nas PDMS pré-esticado e não estiradas substratos após 12 dias de cultura. Os axónios DRG alinhados paralelamente à direcção esticada, enquanto que eles mostraram alinhamen...

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

O objetivo geral deste protocolo é melhorar o alinhamento dos axônios e a mielinização de neurônios de gânglios da raiz dorsal utilizando um sistema de cultura celular estático e pré-esticado. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de engenharia de tecidos nervosos, como o alinhamento dos axônios e o crescimento de sua espessura. A principal vantagem desta técnica é que o método pré-esticado não apenas melhora o alinhamento dos axônios, mas também promove a mielinização.Para iniciar este procedimento, despeje a mistura de base e agente de cura em uma placa de cultura de tecidos. Mantenha a mistura de gel sob vácuo por 20 minutos para remover bolhas de ar. Em seguida, coloque a mistura de gel no forno a 60 graus Celsius para cura durante a noite.Após a membrana de PDMS ter curado, trate a superfície com plasma de oxigênio no sistema de limpeza e gravação a plasma por três minutos. Em seguida, corte um pedaço de membrana retangular do recipiente. Fixe-a em um quadro de alongamento com o lado tratado com oxigênio voltado para cima.Em seguida, coloque o quadro em uma plataforma de alongamento e estique-o uniformemente girando o botão da plataforma até atingir 10% de alongamento no eixo mais longo. Depois, fixe o alongamento apertando os parafusos do quadro. Após isso, remova o quadro da plataforma.Certifique-se de que a superfície da membrana esteja seca e livre de poeira antes de colocar uma câmara de silicone sobre a membrana. Deixe o lado adesivo da câmara aderir firmemente à membrana. Em seguida, esterilize a superfície com UV por 10 minutos.Posteriormente, adicione um mililitro de PLL à superfície de PDMS na câmara dentro de seis horas após o tratamento com plasma. Em seguida, incube por duas horas a 37 graus Celsius antes de semear os neurônios de gânglios da raiz dorsal para melhorar a adesão celular. Nesta etapa, prepare o meio de crescimento padrão para os neurônios de gânglios da raiz dorsal.Antes do isolamento, autoclave o equipamento de isolamento e os reagentes filtrados. Adicione cinco mililitros de tampão de isolamento em um poço de uma placa de seis poços e coloque a placa sobre gelo. Em seguida, prepare 10 mililitros de meio de dissociação adicionando um mililitro de colagenase A a nove mililitros de Tripsina-EDTA 0,05%.Filtre a solução com um filtro de 0,22 micrômetro e coloque-a em gelo. Em seguida, sacrifique 10 a 12 ratos SD com idade entre cinco e sete dias e remova a pele sobrejacente à medula espinhal do dorso de cada um. Remova qualquer tecido em excesso ao redor da coluna vertebral.Sob uma lupa cirúrgica, faça o primeiro corte a partir do pescoço e, em seguida, um corte ao longo da coluna vertebral em ambos os lados com uma tesoura. Desprenda a coluna vertebral do corpo da ninhada e remova os músculos em excesso. Em seguida, corte ao longo do eixo longitudinal da coluna vertebral e use pinças para abrir completamente a coluna e extrair a medula espinhal.Em seguida, remova o gânglio do bolsão ósseo. Retire as raízes nervosas e transfira os gânglios para o tampão de isolamento gelado. Colete aproximadamente de 10 a 16 gânglios da raiz dorsal de ambos os lados.Repita o procedimento de dissecção para os demais filhotes. Agora, transfira os gânglios da raiz dorsal com o tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 mililitros. Deixe o tecido sedimentar no fundo do tubo e remova cuidadosamente o tampão de isolamento da parte superior.Em seguida, adicione 10 mililitros do meio de dissociação ao tubo. Incube os tecidos dissecados no meio de dissociação em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora, agitando o tubo a cada cinco a 10 minutos. Após a dissociação química, centrifugue os gânglios a quatro graus Celsius por cinco minutos.Após cinco minutos, remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de crescimento padrão e vortex. Em seguida, centrifugue as células dissociadas mais uma vez. Então, remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 12 mililitros de meio de crescimento padrão e vortex.Antes de semear as células, remova a solução de PLL da câmara. Enxágue a superfície de PDMS com água estéril e seque ao ar. Após a ressuspensão das células, deixe a suspensão em repouso por um a dois minutos para permitir que os detritos sedimentem no fundo do tubo.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de suspensão celular em cada câmara esticada e incube-a a 37 graus Celsius com 5%CO2. Para eliminar células gliais após um dia in vitro, adicione 10 microlitros ou 15 microlitros da solução estoque da mistura FDU-U a cada poço. Após sete horas, substitua este meio por meio de crescimento padrão fresco e coloque o dispositivo de cultura pré-esticado em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5%CO2.Durante o período de cultivo celular, troque o meio a cada dois dias, substituindo metade do meio usado por meio fresco. Neste procedimento, remova o meio de cultura das células de Schwann e adicione cinco mililitros de Tripsina-EDTA 0,05% ao frasco. Incube as células a 37 graus Celsius em 5%CO2 por dois a três minutos.Verifique as células sob o microscópio óptico utilizando uma objetiva de 10X para ver se elas se destacam do frasco. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de cultura às células no frasco e misture. Posteriormente, adicione a suspensão celular a um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a 20 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em sete mililitros de meio de crescimento padrão para DRG. Após isso, transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Misture com 10 microlitros de azul de tripano e então conte o número de células utilizando um hemocitômetro com objetivo de 10X.Adicione o meio de crescimento DRG para diluir a suspensão celular a 5.000 células por mililitro. Em seguida, remova 0,5 mililitro do meio da cultura de DRG na câmara esticada e adicione 0,5 mililitro da suspensão de células de Schwann à cultura de DRG. Incube as células por uma semana a 37 graus Celsius em 5%CO₂.Substitua metade do meio usado por meio de crescimento padrão fresco a cada dois dias. Após o cultivo em superfícies esticadas e não esticadas por duas semanas, células de Schwann purificadas foram adicionadas à câmara e cultivadas por mais uma semana. Aqui é mostrada a marcação para beta-III tubulina em axônios na superfície esticada.E esta é a sobreposição da marcação de beta-III tubulina e P0 na superfície esticada, sugerindo que as células de Schwann estão aderidas e provavelmente mielinizando os axônios. Esta imagem mostra a marcação de beta-III tubulina para axônios na superfície não esticada. E a sobreposição da marcação de beta-III tubulina e P0 na superfície não esticada sugere que as células de Schwann não estão aderidas aos axônios.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter a membrana de PDMS plana e com espessura homogênea. Após este procedimento, podem ser realizados atomizadores como microcanais pré-esticados, a fim de responder a questões adicionais, como o crescimento de axônios e a migração de células de Schwann.Após seu desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para pesquisadores na área de engenharia de tecidos explorarem o papel da anisotropia da superfície na regeneração nervosa na medula espinhal e no nervo ciático. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir o alinhamento dos axônios e a mielinização utilizando um dispositivo pré-esticado.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.

Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

O vídeo demonstra a co-cultura de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) com células de Schwann. Os neurônios DRG são cultivados primeiro em uma membrana pré-esticada para o crescimento do axônio alinhado. As células de Schwann são então introduzidas, que se ligam aos axônios, isolando-os e promovendo a sobrevivência e a função das células neurais.

Co-cultura de células de Schwann com neurônios DRG em uma membrana pré-esticada

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer culturas neuronais dos gânglios da raiz dorsal por imunopanning, melhorando assim sua pureza e utilidade para pesquisas neurológicas.

Enriquecimento neuronal dos gânglios da raiz dorsal por imunopanning

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Fonte: Cheah, M., et al. Injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal como modelo para regeneração sensorial do axônio. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para injetar uma suspensão viral nos gânglios da raiz dorsal (DRGs) e induzir uma lesão axonal controlada por meio de um esmagamento da raiz dorsal em um rato anestesiado. O protocolo envolve a exposição dos DRGs, a entrega de um vetor viral promotor de crescimento para...

Modelagem da regeneração sensorial do axônio em um rato usando injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal

Fonte: Li, Q. et al. Investigando a regeneração do axônio de mamíferos: eletroporação in vivo do gânglio da raiz dorsal de camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a transfecção mediada por eletroporação de neurônios DRG de camundongos para estudar a regeneração do axônio. Ele descreve as etapas para fornecer construções de ácido nucleico aos neurônios DRG, induzir lesão do nervo ciático e avaliar a regeneração axonal.

Transfecção mediada por eletroporação de gânglios da raiz dorsal de camundongos para promover a regeneração sensorial do axônio

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são estruturas que contêm os neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico. Quando dissociada, podem ser co-cultivadas com células estaminais do tipo SC, derivadas de tecido adiposo (ASC), proporcionando um valioso modelo para estudar a regeneração de nervos em vitro e mielinização, simulando o ambiente in vivo, no local da lesão.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Este protocolo apresenta o uso de uma injeção de gânglio da raiz dorsal (DRG) com um vetor viral e uma lesão concomitante por esmagamento da raiz dorsal em um rato adulto como modelo para estudar a regeneração sensorial do axônio. Este modelo é adequado para investigar o uso da terapia gênica para promover a regeneração sensorial do axônio.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Este protocolo descreve métodos para estabelecer culturas de montagem inteira e dissociadas de gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG) e seu uso para avaliar as interações tumor-nervo.

Estabelecendo modelos in vitro de cultura de gânglios da raiz dorsal: abordagens complementares para investigar a diafonia câncer-nervo

Aprenda a melhorar o alinhamento axonal e a mielinização de neurônios do gânglio da raiz dorsal usando um sistema de cultura celular pré-estático. Este método promove a regeneração nervosa.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

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