Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

O objetivo geral deste ensaio é enriquecer as transcrições de destino para o sequenciamento de próxima geração. Este ensaio de sequenciamento de RNA direcionado é um procedimento de várias etapas que começa com a depleção do RNA ribossômico do RNA total, seguido pela fragmentação química e síntese de DNA complementar, preparação de bibliotecas com código de barras, hibridização e captura de transcritos direcionados, sequenciamento multiplexado e terminando com a análise de dados. Este vídeo demonstrará os procedimentos para hibridização, captura de alvo e amplificação de PCR pós-captura para quatro amostras.

Portanto, esse método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia molecular, como identificar fusões de genes, variações de nucleotídeo único, expressão gênica relativa e splicing alternativo envolvendo transcritos direcionados. A principal vantagem dessa técnica é que ela é personalizável para qualquer gene de interesse. Para iniciar o procedimento de hibridização, remova do freezer de 20 graus Celsius e descongele no gelo o seguinte: sondas hidratadas personalizadas, DNA Cot-1, oligos de bloqueio universais e oligos de bloqueio específicos do adaptador.

Em um tubo de 1,5 mililitro de baixa ligação, combine 500 nanogramas de amostras de DNA, 5 microlitros de DNA Cot-1, um microlitro de oligos de bloqueio universal, 0,5 microlitros de oligos de bloqueio específicos de seis adaptadores de nucleotídeos e 0,5 microlitros de oligos de bloqueio específicos de oito adaptadores de nucleotídeos. Colocar o tubo de recolha num concentrador de vácuo com a tampa aberta e virada para o sentido de rotação oposto. Seque o conteúdo a 45 graus Celsius por 20 minutos ou até a evaporação completa do líquido.

Em seguida, ressuspenda o conteúdo seco com 8,5 microlitros de tampão de hibridização 2x, 3,4 microlitros do componente de hibridização A e 1,1 microlitro de água livre de nuclease. Aguarde 10 minutos para ressuspensão, vórtice a cada 2,5 minutos. Transfira o material ressuspenso para um tubo de PCR de 0,2 mililitro e incube em um termociclador a 95 graus Celsius por 10 minutos.

Remova o tubo de amostra de hibridização do termociclador e adicione dois microlitros de sondas personalizadas ressuspensas a uma concentração de 1,5 picomoles por microlitro. Incube a reação de hibridização durante a noite a 65 graus Celsius. O próximo passo após a hibridização multiplexada é a captura de RNA direcionado usando esferas paramagnéticas acopladas à estreptavidina.

Remova uma garrafa de miçangas de quatro graus Celsius e equilibre-a em temperatura ambiente por 30 minutos. Prepare 1x soluções de trabalho de todos os buffers necessários. Alíquota de 140 microlitros de 1x tampão de lavagem um em um tubo novo de 1,5 mililitro.

Aqueça este tampão alicítico e toda a quantidade de tampão rigoroso 1x a 65 graus Celsius em um bloco de calor por pelo menos duas horas. Alíquota a quantidade apropriada de contas em um tubo de 1,5 mililitro. Coloque no rack de separação magnética e descarte o sobrenadante.

Adicione o tampão de lavagem do grânulo e o vórtice por 10 segundos. Colocar o tubo na grelha de separação magnética durante dois a cinco minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido. Descarte o sobrenadante.

Repita para um total de duas lavagens. Após a remoção do tampão de lavagem do grânulo, adicione um volume igual de tampão de lavagem do grânulo como volume inicial inicial. Ressuspender e transferir para um tubo de PCR de 0,2 mililitros.

Coloque o tubo no suporte magnético por dois a cinco minutos ou até que o sobrenadante esteja claro. Descarte o sobrenadante. Coloque o tubo com contas em um mini bloco de calor a 65 graus Celsius.

Transfira a amostra de hibridização para o tubo com esferas, pipete para cima e para baixo 10 vezes para misturar e incube a 65 graus Celsius por 45 minutos. A cada 15 minutos, vortex a amostra e gire para baixo por quatro segundos usando uma minicentrífuga de mesa de velocidade fixa. Quando a incubação de 45 minutos estiver concluída, remova o tubo de captura do bloco de calor.

Adicione 100 microlitros de tampão de lavagem pré-aquecido 1x um ao tubo e, em seguida, vórtice por 10 segundos para misturar. Transfira a mistura para um tubo novo de 1,5 mililitro de baixa ligação. Coloque o tubo no suporte magnético e aguarde de dois a cinco minutos para a separação, ou até que o sobrenadante esteja claro.

Descarte o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de tampão de lavagem rigoroso 1x pré-aquecido e pipete para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incube a 65 graus Celsius por cinco minutos.

Coloque o tubo no suporte magnético e aguarde de dois a três minutos para a separação. Descarte o sobrenadante. Repita a lavagem rigorosa uma vez para um total de duas lavagens.

Adicione 200 microlitros de temperatura ambiente 1x tampão de lavagem um e vórtice por dois minutos para misturar. Coloque o tubo no rack magnético, aguarde de dois a cinco minutos para a separação e descarte o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de temperatura ambiente 1x tampão de lavagem dois e vórtice por um minuto para misturar.

Coloque o tubo no rack de separação magnética por dois a cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de temperatura ambiente 1x tampão de lavagem três e vórtice por 30 segundos para misturar. Coloque o tubo no rack de separação magnética por dois a cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante.

Por fim, remova o tubo do rack de separação magnética e adicione 20 microlitros de água livre de nuclease para ressuspender as contas. Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Antes de configurar a amplificação de PCR pós-captura, remova os grânulos paramagnéticos de quatro graus Celsius e equilibre em temperatura ambiente por 30 minutos.

Remova a mistura pronta para PCR de início a quente 2x e a mistura de primer PCR do freezer de 20 graus Celsius, descongele em temperatura ambiente e coloque no gelo. Prepare um master mix de amplificação de biblioteca combinando 27,5 microlitros de 2x hot start PCR ready mix, 2,75 microlitros de PCR primer um e 2,75 microlitros de PCR Configure a reação em um tubo de PCR adicionando 20 microlitros de esferas mais DNA capturado com 30 microlitros da mistura mestre de amplificação da biblioteca.

Tampe o tubo corretamente e vortex para misturar. Centrifugue o tubo por quatro segundos usando uma mini centrífuga de mesa de velocidade fixa a seis vezes G.Coloque o tubo no termociclador e inicie a amplificação de PCR usando o seguinte programa de PCR. Uma desnaturação inicial a 98 graus Celsius por 45 segundos, 10 a 12 ciclos de desnaturação a 98 graus Celsius por 15 segundos, recozimento a 65 graus Celsius por 30 segundos e extensão a 72 graus Celsius por 60 segundos.

Um ciclo de extensão final a 75 graus Celsius por 60 segundos e mantenha a quatro graus Celsius. Quando a PCR estiver concluída, remova a amostra do termociclador. Adicione 75 microlitros de esferas paramagnéticas, misture bem e incube em temperatura ambiente por 15 minutos.

Coloque o tubo no rack magnético em temperatura ambiente por dois a três minutos e, em seguida, remova o sobrenadante. Lave as esferas do ímã adicionando 200 microlitros de etanol a 80%, incubando por 30 segundos e removendo o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens.

Depois de remover o sobrenadante da segunda lavagem com etanol, incubar à temperatura ambiente durante cinco a dez minutos para permitir que os grânulos sequem, mas não seque demasiado até rachar. Ressuspenda as esferas em 22 microlitros de Tris-EDTA pH 8,0 e aguarde três minutos para eluição. Coloque a amostra no ímã por três a cinco minutos.

Por fim, transfira 20 microlitros do produto eluído para um tubo novo de 1,5 mililitro de baixa ligação, garantindo que nenhuma gota seja transportada. Uma comparação da expressão gênica entre o método de captura e o sequenciamento de RNA não direcionado em quatro linhagens de células cancerígenas revelou que o método de captura enriqueceu os genes-alvo, mostrados em azul, de 10 a 1000 vezes em relação aos genes não-alvo, mostrados em cinza. Além disso, a porcentagem de leituras mapeadas para regiões-alvo foi aumentada em bibliotecas de sequenciamento de RNA de captura versus não direcionadas.

Uma avaliação das medidas de controle de qualidade mostrou que a captura e o sequenciamento de RNA não direcionado têm desempenho igual em termos de alinhamento com o transcriptoma e o tamanho da inserção principal. Usando o método de captura, uma porcentagem maior de regiões exônicas e uma porcentagem menor de regiões intrônicas foram sequenciadas. Como esperado, o sequenciamento de RNA não direcionado gerou mais de 50 vezes mais leituras totais de sequenciamento por amostra do que captura.

Usando o método de captura, a porcentagem de sequências de RNA ribossômico presentes em cada amostra foi menor. Finalmente, as comparações de variantes de nucleotídeo único chamadas em regiões sobrepostas de captura e sequenciamento de RNA para cada uma das quatro linhagens celulares demonstram uma alta concordância de variância entre captura e sequenciamento de RNA dentro da região alvo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente durante a captura de alvos hibridizados e garantir que a reação permaneça em 65 graus centígrados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia molecular estudarem transcritos de interesse de maneira econômica e de alto rendimento.