Name: Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprenda o método de sequenciamento de RNA direcionado para enriquecer transcritos específicos e analisar expressão gênica, mutações e fusões gênicas. Esta técnica permite avaliação rápida e custo-efetiva em biologia molecular.

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Agradecemos especialmente a Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto e Eric Samorodnitsky pelo suporte técnico. Também gostaríamos de agradecer a Jenny Badillo por seu apoio administrativo à nossa equipe. Agradecemos ao Ohio Supercomputer Center (OSC) por fornecer espaço em disco, capacidade de processamento e suporte para executar nossas análises. Agradecemos ao Comprehensive Cancer Center (CCC) do Wexner Medical Center da Ohio State University por seu apoio administrativo a este trabalho. SR e equipe são apoiados pela American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), um Prêmio Jovem Investigador da Prostate Cancer Foundation, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association e Pelotonia.

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<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. recebe financiamento da Novartis e da Ariad Pharmaceuticals para a realização de ensaios clínicos. Os membros da família imediata de SR possuem ações da Johnson and Johnson.

RNA-Seq Capture é uma estratégia intermediária entre RNA-Seq e microarray abordagens para avaliar uma parte selecionada do transcriptoma. As vantagens de captura incluem o custo, tempo de resposta rápido reduzida num sequenciador de mesa, de alto rendimento, e a detecção de alterações genómicas. O método pode ser adaptado para caracterizar ARN não codificadoras 23, um único nucleótido detectar variantes 4-6, examinar o RNA splicing, e para identificar fusões de genes ou de rearranjos estruturais <s...

O transcriptoma completo ou sequenciamento de RNA (RNAseq) é um método de sequenciamento imparcial para avaliar todos os produtos de RNA. O objetivo do RNAseq direcionado (captura) é uma avaliação focada de transcritos selecionados com maior sensibilidade, faixa dinâmica, custo ou escala reduzida e maior rendimento em comparação com o RNAseq padrão. Semelhante ao RNAseq padrão, abordagens de enriquecimento direcionadas podem ser usadas para avaliar a expressão gênica, várias espécies de RNA, como mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, outros RNAs não codificantes2, fusões gênicas3 e mutações4-6.
A captura envolve a hibridização de oligonucleotídeos complementares para enriquecer as bibliotecas de cDNA para sequenciamento. A justificativa para a captura de RNAseq é semelhante às abordagens de microarray, onde oligonucleotídeos ou sondas complementares são hibridizados em amostras e, em seguida, medidos quanto à abundância relativa. Para tecnologias de microarray, a expressão é baseada no sinal relativo medido para transcritos ligados a essas sondas. Os microarrays são, portanto, limitados pelo alcance, pelo ruído de fundo potencial da ligação não específica e pela hibridização cruzada das sondas. Além disso, as matrizes têm faixa dinâmica limitada para transcritos baixos e altamente expressos em comparação com o RNAseq1. Os microarrays são amplamente utilizados devido ao seu custo reduzido e alta capacidade de rendimento em comparação com o RNAseq. 
Aqui, demonstramos um método para captura de RNAseq que oferece um meio-termo entre as abordagens de RNAseq e microarray para avaliar o transcriptoma. O RNAseq Capture tem rendimento intermediário, maior faixa dinâmica e sensibilidade e é dimensionado para retorno rápido em sequenciadores de desktop. A captura de RNAseq também requer recursos computacionais reduzidos em termos de espaço de armazenamento e processamento de dados.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de Grau de Biologia Molecular</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Reagentes MiSeq v2 (300- ciclos)</td><td>Sequenciador</td> de Desktop MiSeq <td>Illumina MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Controle Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX v3</td> Kit de RNA Total Encalhado <td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq com Conjunto de Ouro RiboZero Illumina</td><td></td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Bloqueio Universal Oligo - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Bloqueio Universal Oligo - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Bloqueio Universal Oligo - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - Esferas de purificação PCR</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT DNA Humano, Grau Fluorométrico, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Tubos de Ensaio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Kit de Ensaio</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; Kits de Hibridização e Lavagem EZ&nbsp; (24 ou 96 reações)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 ou 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit&reg; 2.0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Termociclador com 96&ndash; Módulo de Reconstrução Rápida</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Kits de Hibridização e Lavagem</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcrição Reversa 200 U/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Tela de RNA</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Escada de Tela de RNA</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de amostra de fita de tela de RNA</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 LADO CADA</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Banho Seco</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagentes</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

targeted rna sequenciação ensaio para caracterizar expressão gênica e genômica alterações

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

sequenciação de ARN (RNA-Seq) é um método versátil que pode ser utilizado para detectar e caracterizar a expressão do gene, mutações, fusões de genes, e RNAs não codificantes. Padrão RNA-Seq requer 30-100.000.000 sequenciamento lê e pode incluir vários produtos de RNA, tais como mRNA e RNAs não codificantes. Demonstramos como alvejado RNA-Seq (captura) permite um estudo focado em produtos de RNA selecionados usando um sequenciador de desktop. captura de RNA-Seq pode caracterizar transcrições não anotadas, baixa ou transitoriamente expressas que podem de outra forma ser atendidas através de métodos RNA-Seq tradicionais. Aqui nós descrevemos a extração de RNA a partir de linhas celulares, depleção de RNA ribossomal, síntese de cDNA, a preparação de bibliotecas de código de barras, hibridação e captura de transcritos alvo e sequenciamento multiplex num sequenciador desktop. Nós também destacar o pipeline de análise computacional, que inclui a avaliação de controle de qualidade, o alinhamento, a detecção de fusão, a quantificação expressão genética e identificação de único nucvariantes leotide. Este ensaio permite a sequenciação transcrição direccionada para caracterizar a expressão do gene, fusões de genes e mutações.

A destacando esquemática passos chave na captura de RNA-Seq é mostrado na Figura 1. Quatro linhas celulares de cancro com mutações conhecidas foram usadas para demonstrar a eficácia da técnica de captura de RNA-Seq (K562 com ABL1 fusão, LC2 com fusão Ret, EOL1 com PDGFRalpha fusão e RT- 4 com a fusão FGFR3). As quatro amostras foram reunidas e sequenciados com 2x 100 pb lê num sequenciador de desktop, que gera arquivos FASTQ. arquivos ...

Descrevemos um método baseado em sequenciamento de RNA direcionado que inclui a preparação de bibliotecas de cDNA indexadas, hibridização e captura com sondas personalizadas e análise de dados para interrogar transcritos selecionados quanto à expressão gênica, mutações e fusões gênicas. O RNAseq direcionado permite uma avaliação rápida e econômica de transcritos selecionados em um sequenciador de desktop.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

O objetivo geral deste ensaio é enriquecer os transcritos-alvo para sequenciamento de nova geração. Este ensaio de sequenciamento direcionado de RNA é um procedimento multietapas que começa com o esgotamento de RNA ribossômico do RNA total, seguido por fragmentação química e síntese de DNA complementar, preparação de bibliotecas com códigos de barras, hibridização e captura dos transcritos-alvo, sequenciamento multiplexado e, por fim, análise de dados. Este vídeo demonstrará os procedimentos de hibridização, captura do alvo e amplificação por PCR pós-captura para quatro amostras.Portanto, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia molecular, como a identificação de fusões gênicas, variações de nucleotídeo único, expressão gênica relativa e splicing alternativo envolvendo transcritos específicos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser personalizada para quaisquer genes de interesse. Para iniciar o procedimento de hibridização, retire do congelador a 20 graus Celsius e descongele no gelo os seguintes reagentes: sondas hidratadas personalizadas, DNA Cot-1, oligos bloqueadores universais e oligos bloqueadores específicos para adaptadores.Em um

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Biologia

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Aqui, descrevemos um em situ ensaio de hibridização que permite detecção sensível e específica de sequências tão curtas quanto 50 nucleótidos com single-nucleotide resolução a nível de célula única. O ensaio, que pode ser executado manualmente ou automaticamente, pode habilitar a visualização de variantes da tala, sequências curtas e mutações dentro do contexto de tecido.

Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Aprenda o método de sequenciamento de RNA direcionado para enriquecer transcritos específicos e analisar expressão gênica, mutações e fusões gênicas. Esta técnica permite avaliação rápida e custo-efetiva em biologia molecular.

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