Name: Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda o ensaio de faixas para estudar atração ou repulsão de neurônios hipocampais usando matrizes de silicone. Este método permite visualizar múltiplos cones de crescimento simultaneamente em neurociência.

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Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (23700412, 25122707 e 26670090 to S.Y.).

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal em Hamamatsu University School of Medicine. 1. Preparação de Matrizes <ol><li> Ferver 4-8 matrizes de silicone em um forno de microondas ou num prato quente durante 5 minutos e deixar secar completamente durante 1 h sob um fluxo laminar (lado listrado para cima). Nota: Os seguintes procedimentos devem ser realizados sob fluxo laminar. </li><li> Soprar ar comprimido ou com fita adesiva transparente para remover qualquer poeira do lado listrado das matrizes. Mantenha o lado limpo listrado para que ele possa aderir firmemente à superfície da chapa. </li><li> Com cuidado, coloque as matrizes em placas de plástico de 6 cm, pressionando com um dedo (uma matriz por prato; tarja lado de baixo). Evite ficar bolhas de ar entre a matriz eo prato. Marcar a localização das tiras no lado inferior da placa de cultura. </li><li> Se a matriz não anexar, repita a partir do passo 1.2. </li></ol>2. Stripe Geração e laminina Revestimento de Cultura Neuron <ol><li> Prepare a proteína recombinante marcada com fluorescência (25 ul cada injectável [passo 2.2] ou 100 ul de cada um para o método de colocação [passo 2.2.1]) misturando a proteína Fc-tag (10-50 ug / ml) e uma dye- fluorescente anticorpo anti-Fc humano conjugado (1 a 3 rácio: 30-150 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, incuba-se a mistura durante 30 min à TA. </li><li> Utilizando uma seringa de 22-L, 25 ul de injectar a proteína recombinante foi preparada na etapa anterior (2.1) através do pequeno orifício no lado da matriz (setas na Figura 1A, 1C, 1E e). <ol><li> Em alternativa, colocar 100 ul da proteína recombinante no topo fenda da matriz e aspirado de cerca de metade da solução do pequeno orifício (setas na figura 1A, 1C e 1E), de modo que a proteína recombinante permanece nas regiões listradas. </li></ol></li><li> Incubar o prato durante 30 miN a 37 ° C numa incubadora de cultura de células. </li><li> Coloque 300 ul de PBS na fenda superior (Figura 1B) e aspirado a partir do pequeno orifício localizado no lado da matriz (setas na figura 1A, C e E) para remover as proteínas recombinantes não acopladas. Não aspirar o PBS completamente, porque as proteínas vai secar. Repita esta etapa duas vezes. (3 vezes no total) </li><li> Cuidadosamente remover a matriz e colocar imediatamente ~ 100 ul de proteína de controlo (10-50 ug / ml de Fc) para cobrir a área listrada inteira, criando um revestimento alternativo. Em seguida, o prato incubar durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células. </li><li> Depois de se lavar a superfície do prato três vezes com PBS, revesti-la com ~ 100 mL de 20 ug / ml em PBS laminina. Nota: A laminina devem ser descongeladas em gelo para evitar a solidificação. </li><li> Incubar a placa durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de cultura de células. </li><li> Lavar a superfície do prato três vezes com PBS e adicionar cultura Medium. Colocar a cápsula revestida com meio de cultura numa incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. A cultura neurônios do hipocampo de embriões de camundongos E15.5 <ol><li> Euthanize mãe via deslocamento cervical e isolar três E15.5 embriões. </li><li> Cortar a pele do crânio e sagital na linha média da cabeça com uma tesoura, e remover o cérebro utilizando uma colher pequena. Transferir o cérebro cuidadosamente para um prato de 60 mm de Petri contendo 3 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> Utilizando um bisturi, cortar os hemisférios incluindo córtex, hipocampo e corpo estriado (Figura 2A). Em seguida, dissecar a região do hipocampo pela remoção cuidadosa das meninges, e transferir os tecidos do hipocampo dissecados para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2 ml de solução HBSS, em gelo (Figura 2B-C). Recolhe 6 hipocampos de embriões 3 no tubo, que são suficientes para a cultura de neurónios em 8 pratos. </li><li> Substitua o HBSS solução com uma solução de tripsina / EDTA (2 ml) e incuba-se o tubo a 37 ° C durante 15 min num banho de água. Nota: Aspirar HBSS sem centrifugação e não decantar a solução de HBSS por inclinação do tubo. </li><li> Neutraliza-se a actividade da tripsina por adição de 500 uL de soro fetal de bovino (FBS). </li><li> Centrifugar a mistura a 100 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 2 mL de meio de cultura. Repita este passo mais uma vez. </li><li> Pipet os hipocampos cima e para baixo 10 vezes em meio de cultura, utilizando uma ponta de 1.000 l com um grande furo (cut-ponta) para dissociar o tecido. </li><li> Mudar para um regular (sem cortes) ponta de 1.000 mL e pipete o tecido dissociado cima e para baixo para obter uma suspensão de uma única célula. </li><li> Separar as células individuais, passando-os através de um filtro de células de malha 80-100 mícrons. </li><li> Centrifugar a suspensão de célula única filtrado a 150 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante por aspiração, e ressuspender o Pellet (neurónios) em 2 ml de meio de cultura. </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro, com coloração com azul de tripano para determinar a densidade e viabilidade. Então, placa 10.000 neurônios em 150 mL de meio de cultura para cada conjunto de suspensão stripes.The deve ser cuidadosamente colocada para cobrir a região faixa inteira. </li></ol> 4. Visualização dos corpos celulares e axônios por imunofluorescência Coloração uso de um anti-Tau1 Antibody <ol><li> Após 24 h de cultura, aspirar o meio, sem perturbar as células aderentes, e fixar os neurónios pré-aquecido com 4% de paraformaldeído (PFA) / 4% de sacarose / PBS a TA durante 15 min. </li><li> Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Se desejado, utilizar uma caneta repelente de água para desenhar um círculo em torno da região listrado para diminuir a quantidade de anticorpo necessária. </li><li> Permeabilizar os neurónios com 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 5 min. </li><li> Incubar os neurónios com solução de bloqueio que continha 3% de soro de burro e 0,1% de Triton X-100 durante30 min, seguido por incubação com um anticorpo anti-Tau1 (1: 200) em soro de burro a 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Incubar os neurónios com um anticorpo IgG anti-ratinho conjugado com fluoróforo em 1% de albumina de soro bovino (BSA) /0.1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min. </li><li> Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Cobrir a região listrado com um x 18 mm tampa de vidro 18 mm, utilizando 50 ul de antifade solução. evitar bolhas de ar, os quais interferem com a imagem latente. </li><li> Obtenção de imagens fluorescentes com um microscópio de fluorescência utilizando o sistema apropriado, por exemplo, x10 lente objectiva, conjuntos de filtros para GFP e RFP, e tempo de exposição de 1000 mseg (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
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<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
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<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve um ensaio de faixa que usa proteína recombinante e os neurónios dissociados a partir de hipocampo de rato E15.5. Este ensaio permite a observação de respostas repulsivas eficiente, atraentes, ou neutras de neurónios para uma proteína recombinante de interesse colocado num padrão às riscas. Uma grande vantagem deste protocolo é o método simples para gerar as tiras, em que a proteína está directamente impressos sobre a superfície de um prato de plástico, em comparação com o método tradicional, o qu...

Orientação Axon é o processo pelo qual os neurónios recentemente formadas enviar axónios para o alvo durante o desenvolvimento do sistema nervoso 1,2. axônios em desenvolvimento realizar uma estrutura altamente móveis em sua ponta chamado cone de crescimento. O cone de crescimento detecta sinais extracelulares para navegar o caminho do axônio. Moléculas de orientação, tais como fenda, semaforina, e Efrinas, pode atrair ou repelir axônios dependendo de sua interação com receptores adequados e co-receptores na axônio 1,3,4. Os receptores activados transferir sinais para o cone de crescimento que afetam sua organização do citoesqueleto para axônio e crescimento de cone movimentos. Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a acção de moléculas atractivas e repelentes. Quimio-atractores e repelentes pode ser administrado para o meio de crescimento / cultura com uma concentração de gradiente (por ex., Câmara de Dunn ou u-lâminas) 5,6, em um local altamente concentrada por micro-Pipette (por exemplo., ensaio de torneamento) 7 ou a uma concentração homogénea por aplicação de banho (por exemplo., ensaio de colapso do cone de crescimento) 8,9. Outros métodos incluem um ensaio de listra ou impressão microcontact (μCP), em que um quimio-atractor ou repelente é revestido sobre a superfície de uma placa como um substrato 10-12. Thestripe ensaio foi originalmente desenvolvido por Bonhoeffer e seus colegas em 1987 para analisar o mapeamento topográfico do pintainho sistema retino-tectal 13. O método original necessário um sistema de vácuo para proteínas de revestimento para membranas de policarbonato Nucleopore usando listrado e matrizes em malha. Nas versões mais recentes, as proteínas recombinantes foram directamente impressa sobre a superfície de uma placa de cultura num padrão listrado utilizando matrizes de silício estreita fenda 14,15. Recentemente, vários grupos de pesquisa têm aplicado com sucesso neste ensaio tarja para a análise das actividades de moléculas de orientação axônio 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aqui, apresentamos o protocolo detalhado para um ensaio de tarja que mede a atração ou repulsão de moléculas de orientação axônio para os neurônios do hipocampo dissociados. Notavelmente, este método pode ser aplicado em ambientes laboratoriais minimamente equipados. Para este ensaio, as listras alternadas de um substrato marcado por fluorescência e uma proteína de controlo são gerados em um prato de plástico utilizando uma matriz de silício com fendas 90 mícrons e revestidas com laminina. Em nossa demonstração, dissociada neurônios do hipocampo de camundongos E15.5 foram cultivadas em faixas alternadas de ectodomï¿½io recombinante de fibronectina e proteína-2 transmembrana (FLRT2) rica em leucina e controlar proteína Fc 21. Após 24 h de cultura, ambos os axónios e corpos celulares dos neurónios foram fortemente repelido das listras FLRT2. A coloração com um anticorpo anti-Tau1 ~ revelou que 90% dos neurónios foram distribuídos nas regiões revestidas com Fc, em comparação com ~ 10% na FLRT2-Fc, indicando que tem uma forte FLRT2 repulsivofunção para os neurônios do hipocampo 21.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorpo anti-IgG humano de cabra</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anticorpo IgG anti-rato de burro</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Tau1 Diluição</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Meios de montagem alternativos podem ser usados</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Diluição 1/50</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de centrifugação</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 18mmx18mm</td><td>Caneta Matsunami</td><td>18x18 mm No. 1</td><td></td></tr><tr><td>DAKO</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Caneta repelente de água alternativa pode ser usada</td></tr><tr><td>Bisturi descartável</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorecente</td><td>Pinça Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>No. 5</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Diluição 1/100</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>22 gauge, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>IgG Humano, Fragmento Fc</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Neurobasal</td><td> Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Diluição 1/100</td></tr><tr><td>Placa de cultura de plástico, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Matrizes</td><td></td><td></td> <td>de siliconeDisponível e comprável do Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Ponta Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva transparente</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Fita adesiva alternativa pode ser usada</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripano, 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> de cultura <td>Neurobasal suplementado com B27, GlutaMAX e Penicilina-Estreptomicina.</td></tr></tbody></table>

stripe ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Os axônios em crescimento desenvolvem uma estrutura altamente móvel em sua ponta, denominada cone de crescimento. O cone de crescimento entra em contato com pistas ambientais extracelulares para navegar no crescimento axonal. Netrina, fenda, semaforina e efrinas são moléculas de orientação conhecidas que podem atrair ou repelir axônios ao se ligarem a receptores e co-receptores no axônio. Os receptores ativados iniciam várias moléculas de sinalização no cone de crescimento que alteram a estrutura e o movimento do neurônio. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para um ensaio de listra para avaliar a capacidade de uma molécula guia de atrair ou repelir neurônios. Neste método, neurônios dissociados do hipocampo de camundongos E15.5 são cultivados em placas revestidas com laminina processadas com listras alternadas de ectodomínio de fibronectina e proteína transmembrana rica em leucina-2 (FLRT2) e proteína de controle da região cristalizável (Fc) do fragmento de imunoglobulina G (IgG). Tanto os axônios quanto os corpos celulares foram fortemente repelidos das regiões de listras revestidas com FLRT2 após 24 h de cultivo. A imunocoloração com tau1 mostrou que ~ 90% dos neurônios estavam distribuídos nas listras revestidas com Fc em comparação com as listras revestidas com FLRT2-Fc (~ 10%). Este resultado indica que o FLRT2 tem um forte efeito repulsivo sobre esses neurônios. Este poderoso método é aplicável não apenas para neurônios cultivados primários, mas também para uma variedade de outras células, como neuroblastos.

Neurônios do hipocampo dissociada de camundongos E15.5 foram semeados e cultivados por 24 h em listras de fluorescente etiquetado controle Fc (Figura 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando com Fc não marcado controle. Em ambos os casos, os neurônios foram agregadas e estendeu seus axônios como pacotes. No controle listras Fc / Fc, os neurônios foram distribuídos uniformemente sobre as listras fluorescente etiquetado e não marcadas, e eles estenderam ...

As moléculas de orientação do axônio regulam a migração neuronal e a navegação direcionada do cone de crescimento. Apresentamos um método poderoso, o ensaio de listras, para avaliar a capacidade das moléculas de orientação de atrair ou repelir neurônios. Neste protocolo, demonstramos o ensaio de listra mostrando a capacidade do FLRT2 de repelir neurônios do hipocampo cultivados.

Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

O objetivo geral do ensaio de faixas é avaliar a capacidade de proteínas específicas, como moléculas orientadoras, de atrair ou repelir neurônios. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do direcionamento axonal, tais como: como os neurônios podem migrar ou estender seus axônios em resposta ao ambiente celular externo. A principal vantagem desta técnica é que um grande número de neurônios pode ser visualizado em um único experimento e muitos cones de crescimento podem ser analisados simultaneamente.Como preparação, ferva quatro a oito matrizes de silicone em água por cinco minutos. Deixe-as secar completamente ao ar sob uma capela de fluxo laminar com seus lados listrados voltados para cima. Isso leva cerca de uma hora.Continue trabalhando sob a capela. Use ar comprimido ou fita adesiva para remover qualquer poeira do lado listrado das matrizes. Em seguida, coloque cuidadosamente cada matriz em um prato plástico separado de seis centímetros, com o lado listrado voltado para baixo.Com um dedo, pressione firmemente cada matriz. Evite aprisionar bolhas de ar entre a matriz e a placa. Se a matriz não aderir, repita o processo.Uma vez fixadas, marque a localiz

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Este vídeo demonstra uma abordagem de alimentação com anticorpos para estudar o tráfego de receptores de glutamato em culturas neuronais primárias do hipocampo. Essa abordagem permite a observação de populações de receptores nas membranas plasmática e interna. A discriminação entre esses subconjuntos é obtida marcando os receptores antes e depois da permeabilização da membrana, usando o mesmo anticorpo primário, mas anticorpos secundários conjugados a diferentes fluoróforos.

Uma técnica in vitro para estudar o tráfego de receptores de glutamato em neurônios do hipocampo

Este vídeo demonstra um método para avaliar a atividade proteica usando neurônios do hipocampo sobre zonas de proteína padronizadas. Os neurônios exibem repulsão nas zonas de proteína de teste e ligação nas zonas de proteína de controle, destacando os efeitos da atividade de proteína atrativa ou repulsiva.

Avaliação da atividade atrativa ou repulsiva de proteínas usando neurônios do hipocampo

A adição de palmitato reversível às proteínas é um importante regulador do tráfico intracelular de proteínas. Isto é de particular interesse, onde os neurónios em muitas proteínas sinápticas são palmitoilada. Nós utilizamos um método simples bioquímica para detectar proteínas palmitoilados em neurónios em cultura, que podem ser adaptadas para vários tipos de células e tecidos.

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

Nós fornecer um protocolo detalhado para a indução de potenciação de longo prazo na região CA1 do hipocampo e o subsequente isolamento de fracções enriquecidas nucleares da área tetanized da fatia. Esta abordagem pode ser utilizada para determinar a actividade da importação nuclear de proteína dependente em modelos celulares de aprendizagem e memória.

Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

Neste protocolo, nós introduzimos um método para purificante a fração filopodia-rica dendríticas do fagocitária copo-como a estrutura do protrusão em neurônios hippocampal cultivados aproveitando-se da afinidade específica e forte entre um filopodial dendríticas molécula de adesão, TLCN, e uma molécula de matriz extracelular, vitronectina.

Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

Este artigo apresenta um método para estudar o tráfico de receptores de glutamato (GluR) em culturas hipocampais primárias dissociadas. Usando uma abordagem de alimentação de anticorpos para rotular receptores endógenos ou superexpressos em combinação com abordagens farmacológicas, este método permite a identificação de mecanismos moleculares que regulam a expressão da superfície GluR modulando processos de internalização ou reciclagem.

Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Aprenda o ensaio de faixas para estudar atração ou repulsão de neurônios hipocampais usando matrizes de silicone. Este método permite visualizar múltiplos cones de crescimento simultaneamente em neurociência.

Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo (Vídeo) | JoVE Journal

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