Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo
19 de junho de 2016
As moléculas de orientação do axônio regulam a migração neuronal e a navegação direcionada do cone de crescimento. Apresentamos um método poderoso, o ensaio de listras, para avaliar a capacidade das moléculas de orientação de atrair ou repelir neurônios. Neste protocolo, demonstramos o ensaio de listra mostrando a capacidade do FLRT2 de repelir neurônios do hipocampo cultivados.
O objetivo geral do ensaio de faixas é avaliar a capacidade de proteínas específicas, como moléculas orientadoras, de atrair ou repelir neurônios. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do direcionamento axonal, tais como: como os neurônios podem migrar ou estender seus axônios em resposta ao ambiente celular externo. A principal vantagem desta técnica é que um grande número de neurônios pode ser visualizado em um único experimento e muitos cones de crescimento podem ser analisados simultaneamente.
Como preparação, ferva quatro a oito matrizes de silicone em água por cinco minutos. Deixe-as secar completamente ao ar sob uma capela de fluxo laminar com seus lados listrados voltados para cima. Isso leva cerca de uma hora.
Continue trabalhando sob a capela. Use ar comprimido ou fita adesiva para remover qualquer poeira do lado listrado das matrizes. Em seguida, coloque cuidadosamente cada matriz em um prato plástico separado de seis centímetros, com o lado listrado voltado para baixo.
Com um dedo, pressione firmemente cada matriz. Evite aprisionar bolhas de ar entre a matriz e a placa. Se a matriz não aderir, repita o processo.
Uma vez fixadas, marque a localização das listras na face inferior da placa de cultura. Prepare as proteínas recombinantes marcadas com fluorescência em PBS. Faça 25 microlitros para cada placa com listras.
Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, para cada placa, carregue uma seringa de 22 gauge com 25 microlitros de proteína diluída e injete-a através do pequeno orifício na lateral da matriz. Evite a injeção de bolhas de ar nas matrizes, pois elas irão interferir na ligação das suas proteínas às placas.
Agora, incubar as placas por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura celular. Após a incubação, depositar 300 microlitros de PBS na fenda superior de cada matriz. Em seguida, aspirar o PBS por um pequeno orifício localizado na lateral de cada matriz para remover todas as proteínas recombinantes não ligadas.
Não aspire completamente o PBS, pois as proteínas secarão. Realize esta lavagem com PBS um total de três vezes. Em seguida, remova cuidadosamente a matriz de cada placa.
Em seguida, adicione imediatamente cerca de 100 microlitros de proteína controlada sobre toda a área listrada, criando um revestimento alternado em cada placa. A seguir, incube as placas por 30 minutos a 37 graus Celsius. Enquanto isso, sobre gelo, descongele laminina e PBS a 20 microgramas por mililitro.
Após 30 minutos, lave as placas três vezes com PBS. Em seguida, recubra cada placa com cerca de 100 microlitros de laminina fria e retorne as placas ao incubador por mais uma hora. Uma hora depois, use PBS para lavar as placas três vezes novamente.
Após a terceira lavagem, adicione cerca de 150 microlitros de meio de cultura a cada placa. Em seguida, incube as placas em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até o próximo uso. Após a eutanásia de um camundongo doador E15,5, corte a pele e o crânio na linha média da cabeça com tesoura cirúrgica e retire o cérebro usando uma microespátula.
Transfira cuidadosamente o cérebro para uma placa de Petri de 60 mililitros contendo três mililitros de HBSS. Na placa, use um bisturi para remover os hemisférios, incluindo o córtex, hipocampo e estriado. Em seguida, dissecione as regiões hipocampais removendo cuidadosamente as meninges.
Transfira os tecidos do hipocampo dissecados para um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de solução HBSS em gelo. Seis hipocampos de três embriões são suficientes para o cultivo de neurônios em oito placas. Após coletar todos os tecidos do hipocampo, aspire a solução HBSS e substitua por dois mililitros de tripsina-EDTA.
Em seguida, incube o tubo por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. A seguir, neutralize a atividade da tripsina adicionando 500 microlitros de soro bovino fetal. Em seguida, centrifugue a mistura a 100 Gs por cinco minutos.
Remova o sobrenatante e lave o pellet com dois mililitros de meio de cultura. Em seguida, centrifugue a mistura novamente e substitua o meio por mais meio. Agora, dissocie o tecido com trituração suave usando uma ponteira de um mililitro com a ponta cortada.
Passe os tecidos para cima e para baixo através da ponta do cabeçote cerca de 10 vezes. Em seguida, utilize uma ponta de um mililitro não cortada e repita a trituração para obter uma suspensão de células únicas. Agora, isole as células individuais, pressionando a suspensão através de uma peneira celular com malha de 80 a 100 mícrons.
Em seguida, centrifugue a suspensão filtrada a 150 Gs durante cinco minutos, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet em dois mililitros de meio de cultura. Conte as células utilizando um hemocitômetro e plaque 10.000 neurônios em 150 microlitros de meio de cultura em cada placa com listras preparada. Deposite cuidadosamente a suspensão para cobrir toda a região listrada.
Neurônios do hipocampo dissociados de camundongos E15,5 foram semeados e cultivados por 24 horas em faixas de proteína controle marcada com fluorescência FC, ou os neurônios foram semeados em faixas alternadas de FLRT2 FC e proteína controle FC não marcada. Em ambos os casos, os neurônios se agregaram e estenderam seus axônios em feixes. Nas faixas de controle FC, os neurônios se distribuíram uniformemente e estenderam seus axônios em direções aleatórias. Em contraste, quando cultivados com faixas de FLRT2 FC, os axônios evitaram crescer nas regiões de FLRT2 FC.
Assim, os axônios em crescimento expandiram-se principalmente sobre as faixas de FC. A ampliação maior mostra que os axônios cresceram ao longo da borda com as faixas de FC FLRT2, mas não se estenderam para dentro do território de FLRT2. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um tapete listrado das proteínas recomendadas e avaliar a atividade atrativa ou repulsiva utilizando neurônios do hipocampo dissociados.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco horas se for executada corretamente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
O ensaio de listras é um método poderoso utilizado para avaliar a capacidade de moléculas de orientação axonal de atrair ou repelir neurônios. Esta técnica permite a visualização de um grande número de neurônios e cones de crescimento em um único experimento, fornecendo informações sobre a migração neuronal e a extensão do axônio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Desenvolvimento Neuronal
Contexto
- As moléculas de orientação axonal desempenham um papel crucial na migração neuronal.
- Compreender como os neurônios respondem ao seu ambiente é fundamental para a neurociência.
- O ensaio de listras permite a análise simultânea de múltiplos cones de crescimento.
- Este método pode ajudar a elucidar os mecanismos do comportamento neuronal.
Objetivo do Estudo
- Avaliar os efeitos de moléculas orientadoras específicas no comportamento neuronal.
- Demonstrar a utilidade do ensaio de listras na pesquisa em neurociência.
- Fornecer um protocolo para avaliar as respostas neuronais a sinais orientadores.
Métodos Utilizados
- Preparação de matrizes de silicone para o ensaio de faixas.
- Fervura das matrizes para garantir propriedades superficiais adequadas.
- Permitir que as matrizes sequem ao ar em condições controladas.
- Visualização das respostas neuronais a moléculas de orientação.
Resultados Principais
- Mostrou-se que a FLRT2 repele neurônios hipocampais cultivados.
- O ensaio de listras demonstrou efetivamente os efeitos repulsivos de moléculas de orientação.
- Um grande número de neurônios foi analisado simultaneamente.
- O método forneceu insights claros sobre a navegação neuronal.
Conclusões
- O ensaio de faixa é uma ferramenta valiosa para o estudo da orientação axonal.
- Moléculas orientadoras como FLRT2 podem influenciar significativamente o comportamento neuronal.
- Este método aprimora nossa compreensão da migração neuronal e da navegação do cone de crescimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de listras permite a avaliação de alto rendimento da atividade de moléculas orientadoras de axônios, auxiliando na validação de alvos na descoberta de fármacos para distúrbios do neurodesenvolvimento. Ao quantificar respostas neuronais atrativas ou repulsivas, fornece desvio de risco mecanicista para candidatos terapêuticos que visam migração neuronal ou trajetamento axonal. Este método aumenta a confiança preditiva na fase inicial da descoberta ao associar atividade molecular ao comportamento funcional dos neurônios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas testando se moléculas de orientação como a FLRT2 provocam efeitos repulsivos sobre axônios neuronais.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da análise quantitativa da distribuição de neurônios em listras revestidas com proteína.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar moléculas de orientação com fortes efeitos direcionais sobre o crescimento neuronal.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Prepara substratos listrados validados para triagem consistente de compostos ou proteínas em sistemas neuronais.
- Reprodutibilidade: Padroniza a apresentação de sinais extracelulares para garantir resultados confiáveis de atração ou repulsão entre experimentos.
- Escalabilidade: Permite a análise simultânea de numerosos cones de crescimento, apoiando formatos de triagem de média escala.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela respostas neuronais do hipocampo aplicáveis a transtornos neurodesenvolvimentais envolvendo defeitos na orientação axonal.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica ao confirmar os efeitos de moléculas orientadoras em sistemas de neurônios primários.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço ao estabelecer limiares repulsivos dependentes de dose ou concentração.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de faixa insere-se no continuum de descoberta, desde o engajamento do alvo até a validação funcional, especialmente em fluxos de trabalho voltados para neurociência que avaliam moduladores de axônios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao determinar se proteínas candidatas alteram a trajetória neuronal ou a dinâmica do cone de crescimento.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos, como porcentagens de distribuição em faixas neuronais, permitindo a comparação da potência de moléculas de orientação.
- Análise: Oferece leituras mensuráveis, como evitamento de axônios ou alinhamento às bordas, facilitando a comparação estatística entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com estudos pré-clínicos ao utilizar neurônios primários do hipocampo, aumentando a relevância fisiológica dos achados.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para triagem de diversas moléculas de orientação ou anticorpos terapêuticos que visam a navegação neuronal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao vincular diretamente o revestimento do substrato proteico à resposta neuronal direcional.
- Valor Operacional: Garante padronização por meio de protocolos de preparação da matriz e revestimento proteico, melhorando a consistência entre experimentos.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer leituras fenotípicas claras sobre atração ou repulsão axonal.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos em vias de orientação com base em dados funcionais de evitamento neuronal.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissociação primária de neurônios e preparação estéril de matriz sob fluxo laminar.
- Depende do acesso a proteínas recombinantes marcadas com fluoróforos e ferramentas para fabricação de matrizes de silicone.
- Necessita padronização das etapas de incubação, lavagem e revestimento das proteínas para evitar a formação irregular das listras.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a tipos celulares não neuronais ou a proteínas alternativas da matriz extracelular.
- É limitado pela necessidade de controle preciso do microambiente para prevenir a secagem das proteínas ou a desanexão da matriz durante o ensaio.
