Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa In Vivo Câmara Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste procedimento é criar um espaço onde o tecido possa crescer e se expandir concomitantemente com o desenvolvimento de um suprimento sanguíneo robusto, levando à geração de um grande bloco de tecido tridimensional vascularizado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na engenharia de tecidos vascularizados para fins reconstrutivos, bem como para substituição e reparo de órgãos. A principal vantagem dessa técnica é que o tecido recém-gerado é intrinsecamente suprido por sua própria rede vascular sem ter que depender da difusão do ambiente para sobreviver.

Demonstrando o procedimento estarão Sue McKay e Liliana Pepe. Anestesie um rato pesando pelo menos 250 gramas e avalie a profundidade da anestesia usando uma pinça no dedo do pé. Se o rato não responder, mantenha sua sedação usando isoflurano a 2% durante todo o procedimento.

Em seguida, aplique pomada epsômica nos olhos. Em seguida, com o rato em decúbito dorsal, use barbeadores elétricos para raspar a virilha e remova os pelos com gaze umedecida. Em seguida, limpe os locais cirúrgicos com uma solução de clorexidina contendo etanol a 70%.

Por fim, cubra o animal com toalhas estéreis e prossiga com a cirurgia. Usando uma lâmina número 15, faça uma incisão na pele de quatro centímetros de comprimento na virilha esquerda paralela ao ligamento inguinal. Em seguida, corte a almofada de gordura inguinal exposta circunferencialmente com uma tesoura, deixando-a presa ao seu pedículo vascular, com base nos vasos epigástricos.

Agora, com uma microtesoura, libere as aderências do tecido conjuntivo transparente entre a parede abdominal e os vasos femorais subjacentes. Em seguida, coloque um afastador na parede abdominal e puxe-o medialmente para expor o ligamento inguinal e todo o comprimento dos vasos femorais. Em seguida, usando micropinças e tesouras curvas, disseque a veia epigástrica e isole-a da gordura circundante.

Esta veia funcionará como uma corda. Prossiga abrindo a bainha perivascular contendo os vasos femorais e o nervo. Abra-o desde o ligamento inguinal até sua bifurcação distal ao ramo epigástrico.

Neste ponto, e durante todo o procedimento, o manuseio suave dos vasos femorais é fundamental. Seu dano pode resultar em trombose e falha de todo o experimento. Em seguida, usando microfórceps, pegue a veia femoral por sua adventícia e separe-a suavemente dos tecidos circundantes e da artéria que a acompanha.

Durante esta etapa, não agarre toda a espessura da parede da veia, o que pode causar trauma na íntima, tornando a veia propensa a trombose. Também durante esta etapa, ligue os ramos laterais com sutura de náilon 10-0 ou coagule-os com um coagulador bipolar. Com a veia femoral completamente livre, ligue-a proximal e distalmente com pontos de seda 4-0 para obter um enxerto de veia com pelo menos 10 milímetros de comprimento, que inclui cerca de meio centímetro de comprimento do ramo epigástrico.

O galho funciona como uma corda de sustentação para manter o laço aberto na câmara. Em seguida, apare a adventícia das pontas do enxerto. Se necessário, esta etapa pode ser adiada para antes das anastomoses microcirúrgicas.

Termine de preparar o enxerto de veia lavando-o com solução salina heparinizada e deixando-o descansar carregado com solução salina heparinizada. Em seguida, feche a ferida usando sutura de seda 4-0 contínua e dois ou três pontos simples interrompidos adicionais. Para começar, exponha o ligamento inguinal e toda a extensão do vaso femoral do membro contralateral, conforme demonstrado anteriormente.

Em seguida, usando microfórceps, disseque e isole a artéria epigástrica e a veia da almofada de gordura circundante. Seja gentil ao puxar o tecido para longe dos vasos. Continue pegando a artéria femoral por sua adventícia e libertando-a dos tecidos circundantes.

Nesse processo, ligue ou coagule os ramos laterais da artéria. Em seguida, coloque uma pinça proximalmente na artéria e na veia femoral. Agora, usando sutura de seda 4-0, ligue a artéria femoral e a veia distal à emergência dos vasos epigástricos.

Agora coloque um fundo de contraste de plástico estéril sob os vasos e use uma microtesoura reta e afiada para cortar cada vaso transversalmente. Depois de cortado, lave os vasos vigorosamente com quantidades generosas de solução salina heparinizada até que todo o sangue tenha sido removido do lúmen. Agora traga o enxerto de veia para o campo operatório.

Posicione o enxerto de veia de forma que a extremidade proximal do enxerto de veia esteja pronta para ser anastomosada à veia femoral receptora e a extremidade distal à artéria femoral receptora. Isso permitirá que o sangue flua do lado arterial para o venoso sem resistência das válvulas dentro do enxerto venoso. Certifique-se de que os vasos femorais e o enxerto de veia estejam em sua posição natural, sem torções.

Usando sutura de náilon 10-0, faça anastomose cirúrgica em ambos os lados. Uma anastomose microcirúrgica boa e atraumática é fundamental. Danos à íntima do vaso, dessecação dos vasos ou pontos colocados incorretamente tornam o local da anastomose propenso à formação de trombos.

Em seguida, verifique se há vazamentos em ambos os locais da anastomose. Resolva pequenos vazamentos, que parecem sangue não pulsante saindo do local da anastomose, colocando um pequeno pedaço de gordura ou uma esponja por cima e comprimindo suavemente por cinco a 10 minutos. Vazamentos pulsantes maiores que inundam rapidamente todo o campo precisarão de pontos adicionais.

Em seguida, verifique a permeabilidade da alça arteriovenosa. A oclusão suave da artéria femoral deve fazê-la encolher. Por outro lado, a oclusão da veia femoral deve ingurgitar a alça.

Agora coloque a base da câmara de engenharia de tecidos sob a alça arteriovenosa. Certifique-se de que o laço esteja em sua posição natural, sem torções ou dobras. Em seguida, com suturas de náilon 6-0, prenda a base da câmara ao ligamento inguinal e à fáscia muscular subjacente.

Em seguida, coloque a tampa sobre a base da câmara. Aperte os ramos epigástricos sob a tampa para manter a alça na posição. Em seguida, feche a ferida usando sutura de seda 4-0 contínua, mais dois ou três pontos simples interrompidos adicionais.

Finalmente, permita que o animal se recupere da anestesia em uma gaiola individual e administre uma dose única de carprofeno por via subcutânea como analgésico. Prepare o animal para a cirurgia como antes. Duas câmaras podem ser implantadas em um único rato, uma em cada virilha.

Em seguida, isole o vaso femoral conforme descrito anteriormente. Com a artéria e a veia completamente livres dos tecidos circundantes e seus ramos ligados, traga a câmara para o campo operatório. Em seguida, coloque cada um dos vasos femorais intactos nas fendas correspondentes da base da câmara.

Certifique-se de que nenhum deles esteja torcido ou dobrado. Em seguida, feche a câmara prendendo a tampa na base. Em seguida, feche a ferida e permita que o animal se recupere conforme descrito anteriormente.

A criação microcirúrgica das câmaras de engenharia de tecidos foi realizada conforme descrito. Vários tipos de tecido foram projetados com sucesso usando a câmara vascularizada in vivo, que inclui tecido cardíaco com cardiomiócitos neonatais de ratos, tecido muscular com mioblastos esqueléticos de ratos e tecido adiposo com hidrogel derivado da matriz extracelular de tecido adiposo. O sistema de estereologia permite a quantificação imparcial do volume específico do tecido.

Por exemplo, células endoteliais coradas com lectina em seções transversais foram usadas para estimar os volumes vasculares. Após a implantação in vivo de células marcadas com corantes fluorescentes, seu destino pode ser rastreado. Por exemplo, cardiomiócitos de ratos neonatais marcados com corante i foram detectados nas construções de tecido três dias após o implante.

Alternativamente, anticorpos específicos da espécie podem ser usados para identificar células implantadas em estudos de xenotransplanação. Por exemplo, células-tronco pluripotentes induzidas por humanos implantadas em ratos imunocomprometidos podem ser identificadas no tecido colhido da câmara. Uma vez dominadas, a câmara de fluxo e a alça arteriovenosa podem ser implantadas em aproximadamente 20 e 90 minutos, respectivamente.

Ao tentar este procedimento, é importante manter a esterilidade em todos os momentos e tomar as medidas necessárias caso ocorra contaminação. Não se esqueça de que o manuseio cuidadoso dos vasos sanguíneos e a anastomose microcirúrgica atraumática são fundamentais para garantir o sucesso. Nesse sentido, recomendamos treinamento microcirúrgico básico antes de tentar esse procedimento, principalmente para a construção da alça arteriovenosa.