Name: Isolamento de gigante lampbrush Cromossomos de Living oócitos de rãs e salamandras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a isolar cromossomos lampbrush gigantes de oócitos de rãs e salamandras para estudos de biologia celular e expressão gênica. Esta técnica permite visualizar a transcrição em tempo real usando microscopia de contraste de fase.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão R01 GM33397. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. J.G.G. é professor de genética do desenvolvimento da American Cancer Society.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As primeiras observações de lbcs &quot;vivos&quot; de GVs isolado mão de rãs e salamandras foram feitas quase 80 anos pelo biólogo norte-americano William Duryee, 19 antes da introdução de contraste de fase e microscopia DIC, antes de imuno fluorescente, e antes de FISH. As vantagens de lbcs para investigar detalhes da estrutura dos cromossomas e transcrição ao nível do gene indivíduo necessário desenvolvimento de técnicas para prender os lbcs para lâminas de vidro, para corrigi-los de uma forma realista, e a...

A maioria dos vertebrados, com a notável exceção de marsupiais e mamíferos placentários, produzem ovos grandes vitelinados. Apesar de seu tamanho, por vezes enorme, esses ovos são células isoladas que atingem a sua dimensão final, enquanto ainda no ovário da fêmea. Ovos do ovário são chamados de ovócitos e cada normalmente contém um único núcleo gigante, conhecido desde o início do século 19 como a vesícula germinal ou simplesmente GV. 1 oócitos de rãs de laboratório comuns, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, atingir um diâmetro máximo de 1,2 milímetros e 0,8 mm, respectivamente (Figura 1). Os GVs de oócitos maduros destes dois sapos são 0,3 - 0,4 mm de diâmetro (Figuras 2, 3). Salamandras normalmente têm oócitos e GVs ainda maiores. Oócitos totalmente maduros do axolotl mexicano, Ambystoma mexicanum, são mais de 2 mm de diâmetro eo GV é de cerca de 0,5 mm. Assim, estes núcleos são facilmente visíveis a olho nu e podeser manipulados de várias maneiras que são impossíveis com os núcleos das células somáticas típicas. Igualmente notável é o tamanho gigantesco dos cromossomos dentro do GV, fato já reconhecido no final do século 19. Cromossomas individuais de Ambystoma e outros salamandras pode ser de até 1 mm de comprimento (Figuras 4, 5). Aqueles de Xenopus são consideravelmente menor, embora com comprimentos até 100 m ou mais, minimizam os cromossomas somáticas típicas da maioria dos organismos. Uma característica importante dos cromossomas oócito é a sua extraordinária actividade de transcrição, o que leva a um dos seus aspectos mais característicos morfológicas - centenas de malhas laterais emparelhados (Figura 5). Cada ciclo é constituído por uma ou algumas unidades de transcrição que sintetizam activamente o ARN. Os loops dar oócito cromossomos uma aparência difusa, o que levou ao nome do cromossomo &quot;lampbrush&quot; após a sua superficialsemelhança com as escovas usadas em épocas anteriores para limpar querosene chaminés da lâmpada. 2 O foco deste artigo é sobre o uso da GVS isoladas para estudar lbcs e organelas nucleares (nucléolo, órgãos histona de locos, e manchas). Duas técnicas bastante diferentes serão descritas. Na primeira técnica, mais comum, GVs são isolados numa solução salina utilizando uma pinça de joalheiro, brevemente enxaguados para remover gema aderente, e o envelope nuclear é removido, de novo com uma pinça de joalheiro. O conteúdo gelatinosos, contendo os lbcs e organelas nucleares, estão autorizados a resolver sobre uma lâmina de microscópio de vidro ou lamela. Tais preparações podem ser analisados ​​directamente por microscopia de contraste de fase ou DIC. Alternativamente, as preparações podem ser centrifugadas para anexar os lbcs e organelas para o slide ou lamela. Tais preparações podem ser processadas para análise molecular detalhada de ácidos nucleicos e proteínas, principalmente por imunofluorescência e fluorescent hibridação in situ (FISH). 3-7 Uma segunda técnica envolve o isolamento de GV em óleo mineral. 8 GVs isolada-do petróleo continuam transcricionalmente ativa por muitas horas e são potencialmente úteis para estudos onde se quer o conteúdo nucleares para ser o mais realista possível. 9,10 Uma vez que o índice de refracção de o &quot;SAP&quot; nuclear é próxima daquela das lbcs e outros organelos nucleares (Figura 3), as técnicas de microscopia pode ser um desafio com isolado GVs-óleo. Finalmente, por causa de seu tamanho e facilidade de manipulação, a GVS são material ideal para estudos sobre o envelope nuclear. O complexo do poro nuclear foi descrita pela primeira vez a partir de estudos de microscopia eletrônica em envelopes GV anfíbios 11 e observações SuperResolution mais recentes têm usado o mesmo material. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído (grau reagente, cristalino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Apesar das advertências em muitos protocolos, uma solução concentrada pode ser armazenada indefinidamente em RT</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato de metanossulfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>Às vezes referido como MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 ponto de conicidade circular 3-0 suturas</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (cera de parafina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>em>p-Fenilenodiamina</td><td>Gelatina Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td> de <td>Mercearia</td><td></td><td>Comercial Knox funciona bem</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de vidro Gold Seal&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm de espessura)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>Estas lamínulas têm a espessura recomendada para microscopia de superresolução</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Óleo de parafina (leve)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>Para isolar GVs em óleo</td></tr><tr><td>Adesivo in situ PCR e câmaras de hibridização (25 &micro; L)</td> <td>Câmaras</td><td>deslizantes BioRad Frame-Seal #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Isoladores de silicone</td><td>Grace-Biolabs</td><td>select from catalog link</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Frascos Coplin e pratos de coloração</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>select from catalog link</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolamento de gigante lampbrush cromossomos de living oócitos de rãs e salamandras

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Nós descrevemos métodos para estudar os cromossomos gigantes transcricionalmente ativos lampbrush (lbcs) encontrados no oócito ou ovo unlaid, de rãs e salamandras. Lbcs individuais pode ser de até 1 mm de comprimento e que residam num núcleo gigantesca, em si até 0,5 mm de diâmetro. O grande tamanho dos cromossomas permite observações inigualáveis ​​de genes activos por microscopia óptica de luz, mas, ao mesmo tempo técnicas especiais são necessárias para o isolamento do núcleo, retirando o envelope nuclear, e espalhando os cromossomas numa lâmina de microscópio. O núcleo do oócito, também chamado de vesícula germinal (GV), é isolado num meio que permite que a gelificação parcial da actina nuclear e preserva a estrutura delicada das lbcs. Esta etapa é efectuada manualmente, sob um microscópio de dissecação com uma pinça de joalheiro. Em seguida, o envelope nuclear é removido, mais uma vez manualmente com uma pinça de joalheiro. O conteúdo nucleares são rapidamente transferidos para um meio que disperses o gel actina e permite que os lbcs não danificados para liquidar sobre uma lâmina de microscópio. Neste ponto, os lbcs e outras organelas nucleares pode ser visto por contraste de fase ou microscopia de contraste de interferência diferencial, embora mais pequenos detalhes são obscurecidos por movimento browniano. Por observação microscópica alta resolução ou a análise molecular, toda a preparação é centrifugada para prender os delicados lbcs firmemente à corrediça. Uma breve fixação em paraformaldeído é seguida por coloração de imunofluorescência ou hibridação in situ. Lbcs estão em um estado transcricionalmente ativo e seu enorme tamanho permite a análise molecular ao nível do gene individual usando microscopia de super-resolução confocal ou.

Para examinar os cromossomos lampbrush gigantes começa isolando oócitos de uma rã ou salamandra. A Figura 1 mostra um grupo de oócitos maduros em uma solução salina tamponada, após remoção a partir do ovário da rã, Xenopus. Tais oócitos permanecem em boas condições para dias à temperatura ambiente. O núcleo (ou vesícula germinal) é então removido a partir de um ovócito com um fórceps de joalheiro, quer numa solução salina (Figura 2) ou em óleo <...

Nós apresentamos técnicas simples para isolar gigantes cromossomos lampbrush transcricionalmente ativos a partir de oócitos de rãs e salamandras vivo. Nós descrevemos como observar esses cromossomos &quot;vivo&quot; por contraste de fase ou contraste de interferência diferencial, e como corrigi-los para hibridação in situ fluorescente ou coloração de imunofluorescência.

Isolamento de gigante lampbrush Cromossomos de Living oócitos de rãs e salamandras

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o núcleo gigante, ou vesícula germinativa, de um oócito de anfíbio e espalhar os cromossomos em escova de lampião e outras organelas nucleares sobre uma lâmina de microscópio para imunomarcagem, hibridização in situ e outras técnicas moleculares. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a estrutura básica de cromossomos, nucléolos e outras organelas nucleares, bem como detalhes moleculares de transcrição, splicing e exportação de RNA. A principal vantagem desta técnica é a facilidade com que a estrutura cromossômica e a transcrição podem ser examinadas por microscopia de luz convencional, utilizando imunofluorescência, hibridização in situ e outras técnicas moleculares.A demonstrar o procedimento será a Dra. Zehra Nizami, pós-doutoranda do meu laboratório. Após preparar todas as soluções necessárias, monte lâminas com poços, compostas por lâminas de vidro tratadas, às quais poços de plástico foram fixados com parafina, conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, reúna tecido ovariano previamente coletado de uma rã fêmea adulta ou de uma salamandra, e preencha um pequeno recipiente de Petri com meio de cultu

isolation-giant-lampbrush-chromosomes-from-living-oocytes-frogs

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