Name: Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando vermiformis Vermamoeba (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda uma estratégia rápida para isolar novos Faustovirus de amostras ambientais usando Vermamoeba vermiformis. Este método melhora a detecção de lise viral por citometria de fluxo e auxilia virologistas no estudo de vírus gigantes.

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Os autores não têm agradecimentos a fazer.

Coleção 1. Amostra <ol><li> Colete 70 amostras de diferentes ambientes e regiões. Neste caso, use os seguintes: 5 amostras de água sujas da aldeia de Saint Pierre de Meyzoargues (França), 15 amostras do lago em Parc Borély em Marselha (França); 15 amostras de água do mar com sedimentos das enseadas rochosas em Samena em Marselha (França), 25 amostras de água do rio dos Alpes (França), e, finalmente, 10 amostras de esgoto em La Ciotat (França). </li><li> amostras vortex por homogeneização antes de inocular, durante um minuto à temperatura ambiente, sem qualquer tratamento. </li></ol> 2. Processo de isolamento <ol><li> Hospedar Preparação para procedimentos de cultura cego e Inoculação Amostra <ol><li> Use V. vermiformis (estirpe CDC19) na forma de um suporte celular para a co-cultura. </li><li> Manter as amebas a 28 ° C, num balão de cultura de 75 centímetros de células 2 com 30 ml de protease peptona-extracto de levedura-glicose médio (PYL). Por favor, verifique a composição PYG na Tabela 1. Nota: Após 48 horas, as amebas são quantificados por uma contagem usando lâminas de contagem normais (por exemplo, Kovaslides). </li><li> Células colheita a uma concentração de 5 x maio 10-junho 10 células / ml, e sedimento amebas por centrifugação a 720 xg durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante por aspiração, e re-suspender o sedimento amebas em 30 ml de solução salina estéril amébica da página (PAS) Tabela 1. Repetir este procedimento de lavagem. </li><li> Re-suspender amebas em 30 ml de meio de privação com uma mistura antibiótica e antifúngica numa concentração de cerca de 10 6 / ml amiba. O meio de inanição é um meio de sobrevivência para a ameba, permitindo-lhe manter vivo sem encistamento ou multiplicação. Verificar composição na Tabela 1. Nota: A mistura de agente antimicrobiano continha 10 ug / ml de vancomicina, 10 ug / ml de imipenem, 20 ug / ml de ciprofloxacina, 20 μg / ml de doxiciclina, e 20 ug / ml de voriconazol. Esta mistura serviu para reduzir a contaminação bacteriana e fúngica, que pode diminuir ou alterar a multiplicação virai. </li><li> Directamente inocular 25 uL de cada amostra sobre a ameba monocamada de 200 ul num fundo plano de 96 poços da placa favorecendo a adesão ameba e incubar a 30 ° C num ambiente húmido (num ambiente húmido consiste na colocação de uma compressa molhada no interior do saco que contém o placa, a fim de evitar a evaporação). Este é o primo-cultura. Deixar dois poços de amebas sem qualquer inoculação da amostra; este actua como o controlo negativo. Incubar esta cultura primo por três dias. </li><li> Três dias após a primeira inoculação, sub-cultura da placa primo-cultura em amebas fresco como descrito acima, sem qualquer observação microscópica. Incubar a placa de novo por três dias, sob as mesmas condições que o primo-cultura. </li><li> Realizar a cultura final após três dias de incubação da mesma forma que para the primo- e sub-cultura. Incubar a cultura final para dois dias. Em seguida, proceder à detecção. </li></ol></li><li> Detecção de lise por Citometria de Fluxo automatizado Nota: cultura cego acoplado com a citometria de fluxo difere do sistema padrão anterior de isolamento. É mais sensível, preciso e automatizado. Para fins de detecção, aplicou-se uma nova técnica desenvolvida para detectar lise na maior velocidade e sem observação microscópica. Esta técnica é vantajosa para amostras de triagem e tem melhor sensibilidade do que técnicas mais antigas 7-9. <ol><li> Utilizar a placa de 96 poços de co-cultura final para detectar lise. </li><li> Ligue o citômetro e executar um ciclo de limpeza e lavagem, a fim de obter menor ruído de fundo de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Inicie o High Throughput Sampler (HTS) combinados com citômetro de fluxo para carregar automaticamente amostras da placa de 96 poços e realizar uma aquisição totalmente automatizado dentro de 40 min according com o protocolo do fabricante. </li><li> Configure os HTS da seguinte forma: o volume de amostra de 150 mL, misturando volume de 50 ul, de mistura de velocidade 180, número de misturas 5, o volume de lavagem entre cada mL da amostra 400, taxa de fluxo de 2,5 l / s, número de eventos registrados 10.000. </li><li> Avaliar os poços de controlo negativos da co-cultura de micro-placa final, em primeiro lugar, a fim de portão da população ameba e para determinar a percentagem destas células hospedeiras de acordo com as suas características físicas. Certifique-se de ter uma população homogênea ameba e uma segunda população de um eventos inferiores correspondentes a resíduos e ruído. Nota: Este procedimento gating distingue detritos subcelular e aglomerados de células individuais por tamanho, estimados pela dispersão para a frente. Portanto, é importante para determinar com precisão a percentagem de cada população usando o melhor procedimento gating possível. Estas percentagens podem variar, especialmente se são utilizados diversos tipos de protozoários, por isso, é importante sempre ter um negative controlo, que podem ser utilizados como a população referência para o resto das amostras. </li><li> Comece o gating clicando amostra de aquisição. </li><li> Grave o número de eventos não menos de 10.000 eventos. </li><li> Localizar a população ameba de interesse usando a seta. Esta é a forma de definir as portas. </li><li> Depois de gating, deixe o local HTS ou localizar a placa clicando em &#39;Home&#39;, em seguida, executar toda a placa automaticamente. Execute aquisição e análise de dados de acordo com o tamanho ea estrutura parâmetros (respectivamente, FSC (dispersão para a frente) e SSC (dispersão lateral)). Nota: A detecção da perda da população gated-amiba sinaliza a presença de um agente patogénico responsável pela lise amiba. lise protozoários associada com a infecção pelo vírus é detectado com um limiar arbitrariamente concebido de 50% de lise da população ameba fechado pelo analisador e comparada com a mesma população não-infectado utilizado como um controlo negativo fiável. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Caracterização dos novos isolados após a detecção de Lise <ol><li> Coloração preliminar para revelar a presença de vírus gigantes <ol><li> Após a detecção de lise por citometria de fluxo, Pipeta as co-culturas lisadas para suspender as amebas restantes. Em seguida, directamente Cytocentrifuge 50 ul da suspensão a 800 xg durante 10 min. </li><li> Após a centrifugação, corrigir as lâminas com uma solução de metanol puro. Manchar os slides usando uma coloração comercial rápida de Eosina / azul Azur e DAPI coloração e observar ao microscópio óptico de 1000X ampliação, a fim de verificar a presença de vírus fábricas. <ol><li> Para a coloração rápida, mergulhar as lâminas para a primeira solução de eosina (4 s repetidos três vezes), em seguida, passar directamente para mergulhar as lâminas para a segunda solução de fixação contendo azul Azul durante 6 seg, e, finalmente, enxaguar as lâminas durante 45 s com uma solução tampão de fosfato pH 7,2. Deixe os slides para secar em temperatura ambiente, em seguida, proceder à observatiem. </li><li> Para a coloração DAPI, depósito de 15 ul da solução-mãe comercial DAPI sobre a lâmina fixa seco. Proteger da luz, em seguida, proceder à observação. </li></ol></li></ol></li><li> Microscópio eletrônico <ol><li> Após a primeira identificação nos slides, avaliar a presença do vírus gigante através da observação microscopia eletrônica de culturas sobrenadante. </li><li> Depósito de 5 ul da amostra positiva para a grade descarregada-brilho. Esperar durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Seca-se a grelha com cuidado e depósito em que uma pequena gota de 1% de molibdato de amónio durante 10 seg. Deixar a grelha secar durante 5 min. </li><li> Proceder à microscopia eletrônica em 200 keV. </li><li> Coloque a grelha no suporte; introduzir o suporte no microscópio. Verificar a visão geral de vácuo, clicando no ícone correspondente. Feche as válvulas e começar a observação em um tamanho de ponto 5, e ampliação de x 25.000. </li><li> Meça o vírus gigante usando ImageJ ou diretaLY no microscópio usando a ferramenta de medida do microscópio localizado na tela de aquisição. Nota: classificar a amostra para o grupo Faustovirus com um tamanho da cápside de aproximadamente 200 nm. </li></ol></li><li> Biologia molecular Nota: Após essa identificação, testes de biologia molecular foram cruciais para a confirmação para distinguir Faustovirus de marseillevirus, que tem o mesmo tamanho do capsídeo e aparência em microscopia eletrônica, embora eles não têm a mesma especificidade de acolhimento. O marseillevirus não pode crescer em Vermamoeba, o Faustovirus é específico para Vermamoeba e todas as tentativas para ele crescer em outros ameba como Acanthamoeba falharam até agora. A concepção e aplicação dos sistemas específicos iniciador / sonda listadas nas obras de Reteno et al. permitiu uma classificação preliminar mais precisa dos vírus recentemente isolados através de amplificação e sequenciamento dos genes virais. <ol><li> ExADN trato a partir das amostras de cultura positiva usando um sistema de extracção automática de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Realizar-PCR em tempo real utilizando um termociclador, tal como descrito em Reteno et al. 19 </li><li> Sequência usando os mesmos iniciadores que foram usados ​​para a amplificação. Use os iniciadores de segmentação subunidade da polimerase de ARN dirigida por ADN 1 gene: Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 &#39;(para a frente) e Fstv_S2R 5&#39;-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3&#39; (reverso) com a sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA. </li></ol></li></ol> 4. Virus produção, purificação e Genome Sequencing <ol><li> Subcultura da cultura ameba único vírus para clonagem de diluição de ponto final. </li><li> Para a produção de: preparar 20 frascos contendo 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba e 5 ml de vírus isolado a partir de poços já transferido para frascos pequenos. </li><li> Incubar a 30 ° C até estar completalise da amiba. Observar todos os dias por microscopia óptica invertida até que todos os ameba são lisadas. </li><li> Após a lise completa, reunir todos os frascos para um destinatário. Filtrar com um filtro de 0,45 um para eliminar os detritos. </li><li> Comece a purificação por ultracentrifugação a 89.800 xg durante 75 min. Certifique-se para calibrar o peso dos tubos antes de iniciar centrifugação. </li><li> Após centrifugação, remover o sobrenadante a partir de cada tubo por aspiração e re-suspender o sedimento em PAS com o mesmo volume utilizado para a calibração, antes da repetição da centrifugação. </li><li> Tal como referido acima, remover o sobrenadante e re-suspensão de todas as pastilhas em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS). </li><li> Purifica-se o vírus que é produzido, utilizando 25% de sacarose (27,5 g de sacarose em 100 ml de PBS, filtrado num filtro de 0,22 nm). <ol><li> Use 8 ml de sacarose e 2 ml de suspensão viral. Centrifugar a 89.800 xg durante 1 h 15 min. Re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS. Armazenar a -80 ° C. </li&gt; </ol></li></ol>

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<li>Van Etten, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+really%2C+really+big+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Another really, really big virus.</a> Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J.Virol%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> J.Virol. , (2015).</li>
<li>Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+free-living+amoebae+from+tap+water+in+Sivas%2C+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+res+Int%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey.</a> Biomed res Int. 2013, 675145(2013).</li>
<li>Bradbury, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-living+amoebae+recovered+from+human+stool+samples+in+Strongyloides+agar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+microbiol%22%5BJournal%5D)">Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture.</a> J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).</li>
<li>Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vermamoeba+vermiformis+and+associated+bacteria+in+hospital+water%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water.</a> Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).</li>
<li>Ogata, H., Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remarkable+sequence+similarity+between+the+dinoflagellate-infecting+marine+girus+and+the+terrestrial+pathogen+African+swine+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus.</a> Virol J. 6, 178-178 (2008).</li>
<li>Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+virus+infecting+the+novel+shellfish-killing+dinoflagellate+Heterocapsa+circularisquama%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama.</a> Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A possibilidade de que poderia ser Faustovirus o primeiro membro de uma nova família Megavirales perto de VPSA foi primeiro sugerida por Reteno et al., 19, mas algumas diferenças ainda pode ser distinguida. Parece claro se Faustovirus deve se juntar à família Asfarviridae ou se deve, em vez formar uma nova família viral putativo. Este problema vai exigir uma investigação mais aprofundada, em particular, uma caracterização mais abrangente de sua morfologia, gama de hospedeiros, o ciclo de replicação e...

A descoberta de vírus gigantes, especialmente aquelas que pertencem à ordem Megavirales, mudou completamente o mundo dos vírus em termos de tamanho de partícula e a complexidade do genoma. Os vírus foram previamente pensado para ser pequenas entidades, ea Mimivírus apareceu para quebrar todas as regras. 1 dados metagenômica sugere a ubiquidade dos vírus gigantes não só no ambiente, 2-5, mas também em seres humanos. 6 Portanto, ainda há uma necessidade de pesquisa para estes vírus em grande escala. A diversidade destes vírus gigantes foi avaliada por amostragem não só uma variedade de ambientes aquáticos e dos seus sedimentos associados em todo o mundo, 7-11, mas também por rastreio de uma variedade de amostras humanas 12,13 e amostras ambientais. Os 7,9 Mimivírus Polyphaga foi Acanthamoeba isolado por co-cultura utilizando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Uma coleção inteira de vírus gigantes eram, então, tambémisolado a partir deste host protista especificado, o que fez a comunidade científica restringir o seu procedimento de pesquisa e isolamento de Acanthamoeba spp. É evidente que esta dependência de uma única espécie de hospedeiro resultou em uma grande fração de vírus que está sendo negligenciado. O fato de que o vírus gigante, CroV, foi isolado com o altamente móveis marinho roenbergensis protozoários Cafeteria, 17,18 demonstra a necessidade de usar uma ampla gama de protozoários, a fim de descobrir novas linhagens ou famílias de vírus gigantes. Reteno et al. Conseguiram selecionar outros protozoários como hospedeiros celulares que nunca tinha sido utilizado anteriormente, e isolado da nova linhagem relacionados com Asfar de vírus gigantes (o recém-nomeado Faustovirus). 19 Em uma tentativa para isolar novos genótipos Faustovirus a fim de expandir os membros desta linhagem viral, modificamos nossos procedimentos de isolamento e os usou para selecionar amostras ambientais capazes de colher novas Faustoviruses. Nós entãodescrito todo o protocolo para caracterizar os novos isolados. Foram avaliados vermiformis Vermamoeba, o protista de vida livre mais comum encontrado em ambientes humanos, 20-22 que já é utilizado no isolamento do primeiro protótipo Faustovirus E12. 19 Esta protista está ainda hospedar-específico para Faustovirus. Sabíamos que nenhum dos vírus gigantes conhecidos foi patogênico para esta ameba, porque nenhuma tentativa para crescer outros vírus gigantes em nosso laboratório mostraram lise ameba ou o crescimento viral. Por esta razão, nós acreditamos que V. vermiformis é o melhor e mais original suporte de células conhecidas para isolar novos Faustoviruses.

<table><tbody><tr><td>Citômetro LSR FORTESSA&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>França&nbsp;</td><td>Nº 649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Alemanha&nbsp;</td><td>Rolamento 5027/11</td></tr><tr><td>Microscópio óptico invertido</td><td>leica&nbsp;</td><td>França</td><td>72643</td></tr><tr><td>Extração de DNA</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL Robô de Extração</td><td>França&nbsp;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>França</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>Meio PYG, PAS, Meio de fome</td><td>Produção interna em laboratório&nbsp;</td><td>Marselha URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amoeba cepa CDC-19</td><td>ATCC</td><td>França</td><td>50237</td></tr><tr><td>Placas</td><td>Cellstar</td><td>França</td><td>655180</td></tr><tr><td>Materiais de PCR, primers.&nbsp;</td><td>eurogentec</td><td>França</td><td>Primers citados no</td></tr><tr><td>slide de vidro manuscrito 10 com grades</td><td>Kova&nbsp;</td><td>EUA</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>Eosin/azul Azur-Hemacolor mancha</td><td>Merck milipore&nbsp;</td><td>França</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Filtros acionados a vácuo</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermo Fisher scientific&nbsp;</td><td>França&nbsp;</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Mancha DAPI</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>França&nbsp;</td><td>D1306</td></tr><tr><td>citocentrifugador cytospin 4</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>França</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Túnel de citologia única</td><td>Polímeros biomédicos inc.</td><td>França</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Grades de carbono&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>França&nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Molibdato de amônio</td><td>VWR internacional;</td><td>França&nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Frascos&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>Alemanha</td><td>833911</td></tr><tr><td>0,22 &mu; Filtros M&nbsp;</td><td>Milex millipor&nbsp;</td><td>França</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>França</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Filtros de fluxo rápido</td><td>Nalgene</td><td>França</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

uma estratégia rápida para o isolamento de novos faustoviruses de amostras ambientais usando<em&gt; vermiformis vermamoeba</em

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

O isolamento do vírus gigantes é de grande interesse nesta nova era de virologia, especialmente desde que estes vírus gigantes estão relacionados com protistas. vírus gigantes podem ser potencialmente patogênicos para muitas espécies de protistas. Eles pertencem à ordem descrita recentemente de Megavirales. A nova linhagem Faustovirus que foi isolado a partir de amostras de esgoto está distantemente relacionado com o agente patogénico de mamífero suíno Africano vírus da peste. Este vírus também é específico para o seu hospedeiro amébica, vermiformis Vermamoeba, um protista comuns em sistemas de água de cuidados de saúde. É crucial para continuar a isolar novos genótipos Faustovirus, a fim de ampliar sua coleção genótipo e estudar a sua pan-genoma. Nós desenvolvemos novas estratégias para o isolamento de estirpes adicionais, melhorando a utilização de combinações de antibióticos e antifúngicos, a fim de evitar as contaminações bacterianas e fúngicas da co-cultura ameba e favorecendo a multiplicação do vírus. Além disso, implementamos um novo starvation forma a manter V. vermiformis em condições óptimas para vírus co-cultura. Finalmente, utilizou-se citometria de fluxo em vez de observação microscópica, o que é moroso, para detectar o efeito citopatogénico. Obtivemos dois isolados de amostras de esgoto, comprovando a eficiência deste método e alargando, assim, a coleção de Faustoviruses, para entender melhor seu ambiente, especificidade do hospedeiro e conteúdo genético.

O sistema estudado neste manuscrito validado a sua prova de conceito, isolando dois novos Faustoviruses. Das 70 amostras testadas, dois episódios de lise foi detectada, em contraste com os controlos negativos fiáveis. O controlo negativo para a lise continha uma população ameba 86%. Em contraste, as amostras positivas (ST1 para Saint Pierre de Meyzoargues), e (LC9 para a amostra de La Ciotat 9) mostraram um declínio dramático no amebas fechado; mais de 60% de amebas foram lisadas com a m...

Descrevemos aqui os últimos avanços no isolamento viral para a caracterização de novos genótipos de Faustovirus, uma nova linhagem de vírus gigantes relacionada ao asfarvirus. Este protocolo pode ser aplicado ao isolamento de alto rendimento de vírus, especialmente vírus gigantes que infectam ameba.

Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

O objetivo geral dessa nova estratégia de isolamento é ampliar o número de novos isolados virais, a fim de estudar o pan-genoma dessa nova família viral e compreender melhor seus ecossistemas e potencial patogenicidade para os seres humanos. Esse método pode responder perguntas-chave na área da virologia, auxiliando virologistas de todo o mundo interessados na prospecção de vírus gigantes, em particular os Faustovírus. A principal vantagem dessa técnica é que ela apresenta novos aperfeiçoamentos em diversos estágios, como a mistura de antibióticos e antifúngicos, o novo meio de inanição adaptado para a ameba e o uso de citometria de fluxo para detecção mais rápida e sensível da lise. Após coletar amostras de água contaminada de acordo com o protocolo descrito no texto, prepare a célula hospedeira, V. vermiformis, adicionando as amebas a um frasco de cultura celular de 75 centímetros quadrados com 30 mililitros de meio de protease peptona extrato de levedura glicose, ou meio PYG, e incube a 28 graus Celsius por 48 horas. Utilize lâminas de contagem para quantificar as amebas e, quando atingirem uma concentração de cinco vezes 10 à 5ª até 10 à 6ª células por mililitro, recolha as células por centrifugação a 720 vezes g durante 10 minutos.Aspire o sobrenadante e utilize 30 mililitros de solução salina amebiana estéril de Page ou PAS para ressuspender o pellet de amebas. Após lavar o pellet uma segunda vez, utilize 30 mililitros de meio de inanição, contendo um antibiótico e um antifúngico, para ressuspender as células até aproximadamente 10 elevado à 6ª amebas por mililitro. O meio de inanição permite que as amebas permaneçam vivas sem sofrerem encistamento ou multiplicação.Em seguida, semeie 200 microlitros de amebas nas cavidades de uma placa de fundo plano de 96 poços e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos. Depois, após vórtex das amostras de água por um minuto à temperatura ambiente, inocule 25 microlitros de cada amostra sobre as células de amebas, deixando dois poços sem amostra como controles negativos. Para evitar evaporação, coloque a placa contendo a primo-cultura em um saco com uma compressa úmida e coloque a câmara umidificada com a placa em um incubador a 30 graus Celsius.Três dias após a primeira inoculação, subcultive a placa de primocultura em uma nova placa de 96 poços contendo amebas, conforme acabou de ser demonstrado, sem qualquer observação microscópica. Incube a 30 graus Celsius por três dias. Em seguida, utilizando a subcultura, inocule uma terceira placa conforme descrito anteriormente e incube por dois dias.Para detectar a lise na placa final de co-cultivo, ligue o citômetro e realize uma limpeza e enxágue de acordo com o protocolo do fabricante para reduzir o ruído de fundo. Para realizar uma aquisição totalmente automatizada de 40 minutos, inicie o amostrador de alto rendimento ou HTS para carregar automaticamente as amostras da placa de 96 poços de acordo com o protocolo do fabricante. Configure as configurações do HTS conforme listado aqui, incluindo um volume de amostra de 150 microlitros, um volume de mistura de 50 microlitros, uma velocidade de mistura de 180, o número de misturas como 5, um volume de lavagem entre amostras de 400 microlitros, uma taxa de fluxo de 2,5 microlitros por segundo e o número de eventos registrados como 10.000. Clique em home para permitir que o HTS localize a placa. Em seguida, avalie primeiro os poços do controle negativo contendo as células de ameba hospedeira, a fim de delimitar a população de amebas e determinar a porcentagem celular de acordo com suas características físicas. Certifique-se de ter uma população homogênea de amebas e uma segunda população com menor número de eventos correspondente a detritos e ruído. A seguir, inicie o delimitamento clicando em adquirir amostra.Em seguida, utilizando a seta, que define as portas, localize a população de amebas de interesse. Após delimitar pelo menos 10.000 eventos, clique em executar para permitir que o HTS execute automaticamente toda a placa. Realize a aquisição e análise dos dados de acordo com o parâmetro de tamanho dispersão para frente e o parâmetro de estrutura dispersão lateral. Consulte o texto para obter detalhes adicionais. Após a detecção de lise por citometria de fluxo, pipete os co-cultivos lisados para suspender as amebas remanescentes. Após pipetar 50 microlitros de cada amostra em lâminas, realize imediatamente a citocentrifugação da suspensão a 800 vezes g durante 10 minutos.Em seguida, utilize metanol puro para fixar as lâminas e, depois, deixe-as secar à temperatura ambiente. Após a fixação, mergulhe as lâminas na solução de ESN três vezes, durante quatro segundos cada, antes de colocar as lâminas em azul de azur por seis segundos. Por fim, mergulhe as lâminas em PBS por 45 segundos.Deixe os lâminas secarem em temperatura ambiente antes de prosseguir para a observação. Para corar novos lâminas fixados com DAPI, pipete 15 microlitros de DAPI nos lâminas secos. Observe os lâminas ao microscópio óptico com aumento de 1000x para verificar a presença de fábricas virais.Para realizar a microscopia eletrônica, deposite cinco microlitros da amostra positiva sobre uma grade previamente submetida à descarga elétrica, e incube à temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos. Seque cuidadosamente a grade, então adicione uma pequena quantidade de molibdato de amônio a 1% e incube por 10 segundos. Após remover cuidadosamente a gota, deixe a grade secar por cinco minutos. Em seguida, configure o microscópio eletrônico em 200 quiloeletrons-volts. Coloque então a grade no suporte e introduza o suporte no microscópio. Clique no ícone de visão geral do vácuo e verifique o vácuo. Feche então as válvulas e defina um tamanho de ponto cinco e uma ampliação de 25.000 antes de iniciar a observação. Após localizar um vírus gigante na tela de aquisição, utilize a ferramenta de medição para medir o vírus. Realize a biologia molecular e o sequenciamento do genoma viral de acordo com o protocolo descrito no texto.Esta figura mostra os resultados da detecção de dois Faustovírus em comparação com os controles negativos confiáveis. O controle negativo para lise continha uma população de 86% de amebas. Em contraste, mais de 60% das amebas foram lisadas, com a maior porcentagem de detritos nas amostras positivas.Como visto aqui, a ESN e a azul de azur coram os núcleos de células de amebas não infectadas e infectadas, bem como a presença de fábricas virais no interior das células infectadas. A coloração com DAPI também confirma a presença de fábricas virais nas amebas. Nessas imagens, a microscopia eletrônica revela a presença do Faustovírus com a aparência típica de um megavírus composto por um capsídeo icosaédrico que não possui fibrilas e possui um tamanho de 200 nanômetros.Uma vez dominada e após a co-cultura, essa técnica de detecção de lise e caracterização viral pode ser realizada em uma hora, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de controlar a viabilidade amebiana e verificar possíveis contaminações. Após este procedimento, outras metodologias, como biologia molecular direcionadas a vírus gigantes, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como a família viral e/ou o genótipo.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de virologia explorarem essa família viral, seu hospedeiro específico e sua potencial patogenicidade. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar facilmente vírus gigantes ampliando o número e os tipos de amostras e escolhendo a melhor célula hospedeira e as melhores condições de cultivo. Não se esqueça de que trabalhar com vírus potencialmente patogênicos para humanos pode ser extremamente perigoso, especialmente com amostras de esgoto.Portanto, precauções como trabalhar em laboratórios SB2 com condições seguras devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O estudo descreve um método de baixo custo para a identificação da fonte de contaminação fecal / urinária ou contaminação por nitratos na água usando qPCR para a quantificação específica de vírus de DNA humano / suínos / bovinos, adenovírus e polyomaviruses, propostos como ferramentas de MST.

Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal

Cocultura amebas é um sistema de cultura de células usando as amebas aderente para crescer selectivamente patogénios intracelulares capazes de resistir as células fagocíticas, tais como amebas e macrófagos. Representa, portanto, uma ferramenta-chave para descobrir novos agentes infecciosos. Enriquecimento amebas permite a descoberta de novas espécies de amebas e das suas bactérias intracelulares específicos.

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

Aqui apresentamos um procedimento para medir o total de vírus cultiváveis usando a linha de células renais Buffalo Green Monkey. O procedimento fornece uma ferramenta padronizada para medir a ocorrência de vírus infecciosos em águas ambientais e potáveis.

EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.

VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Numerosas novas sequências semelhantes a vírus foram encontradas em mosquitos devido ao uso extensivo de tecnologias de sequenciamento. Fornecemos um procedimento eficaz para isolar e amplificar vírus usando linhagens celulares de vertebrados e mosquitos, que pode servir de base para estudos futuros sobre vírus associados a mosquitos, incluindo vírus transmitidos por mosquitos e específicos por mosquitos.

Isolamento de vírus associados a mosquitos coletados em campo

A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.

Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado

Aqui, descrevemos métodos de amostragem das zonas eufóticas de ecossistemas marinhos e de água doce para isolar cianofagos (e seus hospedeiros) e processos pós-amostragem que enriquecem genótipos únicos e caracterizam a dinâmica de interação vírus-hospedeiro.

Amostragem ambiental de micróbios fotossintéticos e seus vírus: do campo ao laboratório

Aprenda uma estratégia rápida para isolar novos Faustovirus de amostras ambientais usando Vermamoeba vermiformis. Este método melhora a detecção de lise viral por citometria de fluxo e auxilia virologistas no estudo de vírus gigantes.

Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando

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