Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando

O objetivo geral dessa nova estratégia de isolamento é ampliar o número de novos isolados virais, a fim de estudar o pan-genoma dessa nova família viral e compreender melhor seus ecossistemas e potencial patogenicidade para os seres humanos. Esse método pode responder perguntas-chave na área da virologia, auxiliando virologistas de todo o mundo interessados na prospecção de vírus gigantes, em particular os Faustovírus. A principal vantagem dessa técnica é que ela apresenta novos aperfeiçoamentos em diversos estágios, como a mistura de antibióticos e antifúngicos, o novo meio de inanição adaptado para a ameba e o uso de citometria de fluxo para detecção mais rápida e sensível da lise. Após coletar amostras de água contaminada de acordo com o protocolo descrito no texto, prepare a célula hospedeira, V. vermiformis, adicionando as amebas a um frasco de cultura celular de 75 centímetros quadrados com 30 mililitros de meio de protease peptona extrato de levedura glicose, ou meio PYG, e incube a 28 graus Celsius por 48 horas. Utilize lâminas de contagem para quantificar as amebas e, quando atingirem uma concentração de cinco vezes 10 à 5ª até 10 à 6ª células por mililitro, recolha as células por centrifugação a 720 vezes g durante 10 minutos.

Aspire o sobrenadante e utilize 30 mililitros de solução salina amebiana estéril de Page ou PAS para ressuspender o pellet de amebas. Após lavar o pellet uma segunda vez, utilize 30 mililitros de meio de inanição, contendo um antibiótico e um antifúngico, para ressuspender as células até aproximadamente 10 elevado à 6ª amebas por mililitro. O meio de inanição permite que as amebas permaneçam vivas sem sofrerem encistamento ou multiplicação.

Em seguida, semeie 200 microlitros de amebas nas cavidades de uma placa de fundo plano de 96 poços e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos. Depois, após vórtex das amostras de água por um minuto à temperatura ambiente, inocule 25 microlitros de cada amostra sobre as células de amebas, deixando dois poços sem amostra como controles negativos. Para evitar evaporação, coloque a placa contendo a primo-cultura em um saco com uma compressa úmida e coloque a câmara umidificada com a placa em um incubador a 30 graus Celsius.

Três dias após a primeira inoculação, subcultive a placa de primocultura em uma nova placa de 96 poços contendo amebas, conforme acabou de ser demonstrado, sem qualquer observação microscópica. Incube a 30 graus Celsius por três dias. Em seguida, utilizando a subcultura, inocule uma terceira placa conforme descrito anteriormente e incube por dois dias.

Para detectar a lise na placa final de co-cultivo, ligue o citômetro e realize uma limpeza e enxágue de acordo com o protocolo do fabricante para reduzir o ruído de fundo. Para realizar uma aquisição totalmente automatizada de 40 minutos, inicie o amostrador de alto rendimento ou HTS para carregar automaticamente as amostras da placa de 96 poços de acordo com o protocolo do fabricante. Configure as configurações do HTS conforme listado aqui, incluindo um volume de amostra de 150 microlitros, um volume de mistura de 50 microlitros, uma velocidade de mistura de 180, o número de misturas como 5, um volume de lavagem entre amostras de 400 microlitros, uma taxa de fluxo de 2,5 microlitros por segundo e o número de eventos registrados como 10.000. Clique em home para permitir que o HTS localize a placa. Em seguida, avalie primeiro os poços do controle negativo contendo as células de ameba hospedeira, a fim de delimitar a população de amebas e determinar a porcentagem celular de acordo com suas características físicas. Certifique-se de ter uma população homogênea de amebas e uma segunda população com menor número de eventos correspondente a detritos e ruído. A seguir, inicie o delimitamento clicando em adquirir amostra.

Em seguida, utilizando a seta, que define as portas, localize a população de amebas de interesse. Após delimitar pelo menos 10.000 eventos, clique em executar para permitir que o HTS execute automaticamente toda a placa. Realize a aquisição e análise dos dados de acordo com o parâmetro de tamanho dispersão para frente e o parâmetro de estrutura dispersão lateral. Consulte o texto para obter detalhes adicionais.

Após a detecção de lise por citometria de fluxo, pipete os co-cultivos lisados para suspender as amebas remanescentes. Após pipetar 50 microlitros de cada amostra em lâminas, realize imediatamente a citocentrifugação da suspensão a 800 vezes g durante 10 minutos.

Em seguida, utilize metanol puro para fixar as lâminas e, depois, deixe-as secar à temperatura ambiente. Após a fixação, mergulhe as lâminas na solução de ESN três vezes, durante quatro segundos cada, antes de colocar as lâminas em azul de azur por seis segundos. Por fim, mergulhe as lâminas em PBS por 45 segundos.

Deixe os lâminas secarem em temperatura ambiente antes de prosseguir para a observação. Para corar novos lâminas fixados com DAPI, pipete 15 microlitros de DAPI nos lâminas secos. Observe os lâminas ao microscópio óptico com aumento de 1000x para verificar a presença de fábricas virais.

Para realizar a microscopia eletrônica, deposite cinco microlitros da amostra positiva sobre uma grade previamente submetida à descarga elétrica, e incube à temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos. Seque cuidadosamente a grade, então adicione uma pequena quantidade de molibdato de amônio a 1% e incube por 10 segundos. Após remover cuidadosamente a gota, deixe a grade secar por cinco minutos. Em seguida, configure o microscópio eletrônico em 200 quiloeletrons-volts. Coloque então a grade no suporte e introduza o suporte no microscópio. Clique no ícone de visão geral do vácuo e verifique o vácuo. Feche então as válvulas e defina um tamanho de ponto cinco e uma ampliação de 25.000 antes de iniciar a observação. Após localizar um vírus gigante na tela de aquisição, utilize a ferramenta de medição para medir o vírus.

Realize a biologia molecular e o sequenciamento do genoma viral de acordo com o protocolo descrito no texto.

Esta figura mostra os resultados da detecção de dois Faustovírus em comparação com os controles negativos confiáveis. O controle negativo para lise continha uma população de 86% de amebas. Em contraste, mais de 60% das amebas foram lisadas, com a maior porcentagem de detritos nas amostras positivas.

Como visto aqui, a ESN e a azul de azur coram os núcleos de células de amebas não infectadas e infectadas, bem como a presença de fábricas virais no interior das células infectadas. A coloração com DAPI também confirma a presença de fábricas virais nas amebas. Nessas imagens, a microscopia eletrônica revela a presença do Faustovírus com a aparência típica de um megavírus composto por um capsídeo icosaédrico que não possui fibrilas e possui um tamanho de 200 nanômetros.

Uma vez dominada e após a co-cultura, essa técnica de detecção de lise e caracterização viral pode ser realizada em uma hora, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de controlar a viabilidade amebiana e verificar possíveis contaminações. Após este procedimento, outras metodologias, como biologia molecular direcionadas a vírus gigantes, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como a família viral e/ou o genótipo.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de virologia explorarem essa família viral, seu hospedeiro específico e sua potencial patogenicidade. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar facilmente vírus gigantes ampliando o número e os tipos de amostras e escolhendo a melhor célula hospedeira e as melhores condições de cultivo. Não se esqueça de que trabalhar com vírus potencialmente patogênicos para humanos pode ser extremamente perigoso, especialmente com amostras de esgoto.

Portanto, precauções como trabalhar em laboratórios SB2 com condições seguras devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.