Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

O objetivo geral deste procedimento é projetar um sistema de entrega que possa fornecer medicamentos de moléculas pequenas, como siRNA, ao cérebro. Este método pode responder a questões-chave no campo da neurodegeneração, como O siRNA é uma opção terapêutica viável para doenças de desdobramento de proteínas? e Podemos projetar um sistema confiável de entrega de medicamentos ao cérebro?

A principal vantagem de criar um sistema de administração de medicamentos lipossomal é que podemos entregar nosso siRNA por via intravenosa ou através da corrente sanguínea, em vez de diretamente através do tecido neuronal, o que resulta em danos neuronais. As implicações dessa técnica se estendem à terapêutica e ao diagnóstico de doenças neurodegenerativas, pois essa técnica permite a entrega específica através da barreira hematoencefálica, especificamente para neurônios que expressam acetilcolina. A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois as injeções na veia da cauda do camundongo são difíceis de aprender devido ao pequeno tamanho da veia da cauda do camundongo.

Comece preparando uma proporção de DOTAP para colesterol de um para um. Para uma preparação de lipossomas de animais estranhos, misture dois nanomoles de DOTAP e dois nanomoles de colesterol em dez mililitros de uma solução de clorofórmio para metanol. Em seguida, evaporar nove mililitros da solução de clorofórmio e metanol com gás nitrogênio.

Evaporar o último mililitro de solvente em uma capela de exaustão durante a noite sem gás. No dia seguinte, uma fina película lipídica deve ser visível no fundo do frasco. Aqueça este frasco com o filme lipídico e dez mililitros de uma solução de sacarose a dez por cento a 55 graus Celsius.

Em seguida, pipete lentamente a solução de sacarose aquecida sobre a fina película lipídica enquanto gira suavemente o frasco. Em seguida, monte uma extrusora com filtros de um mícron de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão de lipossomas aquecida a uma das seringas da extrusora.

Em seguida, passe a suspensão entre as duas seringas 11 vezes. Enquanto mantém a suspensão de lipossomas aquecida para facilitar o dimensionamento, dimensione os lipossomas através de 45 mícrons e um filtro de 2 mícrons Para gerar vesículas unilamelares grandes, adicione 20 microlitros da suspensão de lipossomas de quatro nanomoles a 200 microlitros de uma solução de siRNA de estoque de 20 micromolares e incube por dez minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 80 microlitros de um estoque de 500 micromolares de peptídeo direcionador RVG-9R à solução de lipossomas de siRNA e incube por dez minutos em temperatura ambiente.

Prepare uma suspensão de lipsomoe animal estranho misturando 2,2 nanomoles de DSPE ou DOTAP em dez mililitros de uma solução de clorofórmio para metanol de dois para um com 1,6 nanomoles de colesterol e 2 nanomoles de DSPE peg. Em seguida, aplicar nitrogênio gasoso e, quando a maior parte do solvente tiver evaporado, deixar o frasco na capela durante a noite. Em seguida, adicione lentamente dez mililitros de 1X PBS aquecido a 75 graus Celsius ao fino filme lipídico.

Deixe os lipídios reidratarem a 75 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de dimensionar. Depois de dimensionar a suspensão de lipossomas usando uma extrusora como antes, pipete 20 microlitros de cada uma das quatro suspensões de lipossomas de nanomoles em alíquotas de uso único e liofilize por 30 minutos usando um liofilizador de bancada. Em seguida, adicione 1,4 microlitros de uma solução micromolar de 26,6 de sulfato de protamina a 200 microlitros de solução de siRNA estoque de 20 micromolares e incube por dez minutos em temperatura ambiente para condensar o siRNA.

Após a incubação, reidratar os paletes DSPE com 201,4 microlitros de solução de siRNA protamina. Reidrate as pastilhas DOTAP com 200 microlitros de uma solução de estoque animal estranho de siRNA. Incubar cada solução de siRNA lipossomal durante dez minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione dez microlitros de uma solução EDC 60 milimolar a cada tubo de lipossomas reidratados. Em seguida, adicione dez microlitros de solução sulfo-NHS 150 milimolar à solução de siRNA lipossomal para paletas DOTAP e DSPE. Incube por duas horas em temperatura ambiente.

Por fim, adicione 80 microlitros de estoque de 500 micromolares do peptídeo RVG-9R à solução de reticulação do lipossomo siRNA e incube por dez minutos em temperatura ambiente. Depois de anestesiar um camundongo usando dois a três por cento de isoflurano em oxigênio, cubra os olhos do camundongo com pomada aptálmica e confirme uma anestesia realizando uma pinça no dedo do pé. Prossiga apenas se uma reação estiver ausente.

Enquanto mantém a anestesia, coloque o mouse de costas ou de lado para acessar a veia da cauda. Limpe a cauda com etanol a 70% e, em seguida, use uma seringa de insulina de calibre 26 para injetar 300 microlitros de LSPCs ou palets na veia da cauda. Comece a injetar distalmente e mova-se proximalmente se a veia entrar em colapso ou se romper.

Coloque o mouse em uma gaiola limpa até que ele mantenha a decúbito esternal. Monitore o animal por várias horas após a injeção para garantir que a anestesia passe e que não haja efeitos nocivos do tratamento. Depois de permitir que os LSPCs ou palets circulem por pelo menos 24 horas e, em seguida, sacrificar o camundongo, disseque meio hemisfério do cérebro.

Em seguida, coloque o meio hemisfério e 2,5 mililitros de tampão de fax em um filtro de células de malha de 40 mícrons e use o êmbolo de uma seringa para pressionar o tecido através do filtro em uma placa de Petri. Enxágue o filtro de células e a placa de Petri com mais 2.5 mililitros de tampão de fax. Em seguida, transfira a suspensão de célula única para um tubo cônico de 15 mililitros e coloque no gelo.

Em seguida, pipete 100 microlitros da suspensão celular no tubo de microcentrífuga e centrifugue por cinco minutos a 350 vezes G. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de fax e centrifugue novamente. Em seguida, adicione outro mililitro de buffer de fax e coloque a suspensão da célula no gelo. Agora, incube as células em 100 microlitros de bloco Fc anti-rato de rato em tampão de fax por 30 a 60 minutos no gelo.

Após a peletização e lavagem como antes, adicione 100 microlitros de solução de anticorpo primário fluorescente e coloque no gelo por 30 a 60 minutos. Após uma lavagem final, ressuspenda as células em um mililitro de tampão de lise RVC por um minuto. Em seguida, pelete as células.

Depois de descartar o buffer, ressuspenda em um mililitro de buffer de fax e coloque no gelo. As células agora estão prontas para análise de fax. Camundongos tratados com siRNA entregue via LSPCs mostraram uma diminuição significativa dos níveis de proteína príon celular em comparação com um controle PBS que mostra os níveis de proteína príon celular do tipo.

Os camundongos tratados com LSPCs mostraram níveis de proteína príon celular próximos aos de um camundongo nocaute para proteína príon. Em três experimentos, os camundongos tratados com LSPCs mostraram reduções significativas nos níveis de proteína príon celular em comparação com o PBS enquanto tipo controles. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os lipossomas podem ser armazenados na geladeira por vários meses, mas os LSPCs completos devem ser usados dentro de 24 horas após a montagem.

Após seu desenvolvimento, a geração de LSPCs ou palets abrirá caminho para que os pesquisadores explorem mais opções terapêuticas no campo das doenças neurodegenerativas.