Name: Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a entregar siRNA ao SNC usando lipossomas catiônicos e aniônicos com peptídeos neurodirecionadores. Este método permite transporte intravenoso através da barreira hematoencefálica para tratamento de doenças neurodegenerativas.

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Gostaríamos de agradecer as seguintes fontes de financiamento: o Programa de Treinamento em Pesquisa Translacional de Doenças Infecciosas da CSU (ID:TRTP) e o programa de bolsas de pesquisa do NIH (R01 NS075214-01A1). Gostaríamos de agradecer ao laboratório Telling pelo uso de seu anticorpo monoclonal PRC5. Também gostaríamos de agradecer ao laboratório da Dow pelos lipossomas DOTAP e por compartilhar sua experiência na geração de lipossomas.

Todos os ratos foram criados e mantidos no laboratório de Recursos Animais, credenciados pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual do Colorado. 1. Preparação de LSPCs <ol><li> Utilize uma mistura 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano): proporção de colesterol para LSPCs. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2 nmoles de DOTAP e 2 nmol de colesterol em 10 ml de uma solução 1: metanol num balão: clorofórmio 1. </li><li> Evapora-se 9 ml de clorofórmio: metanol solução usando N2 gasoso numa hotte. Evaporaram-se os últimos 1 ml de solvente em um exaustor durante a noite sem gás. Observar uma película fina de lípidos no fundo do frasco. </li><li> Calor 10 ml de uma solução de sacarose a 10% a 55 ° C. </li><li> Verter a solução de sacarose a 10% aquecida sobre a película fina de lípidos lentamente, isto é, 1 ml / min, enquanto a GEntly agitando o frasco. Manter a sacarose a 10% e com o balão de lípidos a 55 ° C, de modo que as moléculas de lípidos permanecem na fase de gel-líquido. De re-hidratação resulta em formação de vesículas multilamelares (MLV). </li><li> Permitir lípidos para re-hidratar a 55 ° C durante pelo menos uma hora antes de dimensionar os lipossomas. </li><li> Montar uma extrusora de acordo com as instruções do fabricante com 1,0 uM filtros ou usar filtros de seringa de 1,0 um para o dimensionamento. </li><li> Adicionar 1 ml da suspensão de lipossomas aquecida para uma das seringas sobre o extrusor, e passar a suspensão entre as duas seringas 11 vezes. Certifique-se de que a suspensão se encontra na seringa oposto do que a seringa começando depois dos 11 passes. </li><li> Tamanho dos lipossomas de novo através de 0,45 um 0,2 um, em seguida, filtros para gerar grandes vesículas unilamelares (LUV). Manter a suspensão de lipossomas aquecida para o dimensionamento mais fácil. </li><li> Incubar 20 ul da suspensão de lipossomas de 4 nmol (200 uM) com 200 ul de uma solução 20 uM (4total de nmole) solução stock de ARNsi durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar 80 ul de uma 500 uM (40 Total nmole) solução estoque RVG-9R com a solução / lipossoma ARNsi durante 10 min à TA. LSPCs deve ser utilizado o mais cedo possível, mas pode ser utilizado até várias horas após a preparação. LSPCs armazenar a 4 ° C, durante várias horas após a preparação. </li></ol> 2. Preparação de PALETS <ol><li> Usar um 55: 5 proporção molar de ambos os DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG ou DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2,2 nmoles de qualquer DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de colesterol e 0,2 nmoles de DSPE-PEG em 10 ml de uma solução 2: metanol num balão: clorofórmio 1. </li><li> Prepare a suspensão de lipossomas exactamente como descrito no passo 1.1 e 1.2 acima. Rehidratar lipossomas DSPE em 10 ml de PBS 1x aquecida a 75 ° C, adição de 1 ml / min. Permitir lípidos para re-hidratar a 75 ° C durante pelomenos de 1 hora antes da calibragem. </li><li> Tamanho da suspensão de lipossomas exactamente como descrito no Passo 1,6-1,8. </li><li> Pipetar 20 ul de cada uma das suspensões de liposomas 4 nmol (200 ^ M) em alíquotas de uso único após DOTAP e DSPE lipossomas foram dimensionados, e liofilizar durante 30 min usando um secador de congelação de bancada (Figura 2). </li><li> Incubar 200 ul de uma solução 20 uM de siRNA estoque (4 TOTAL nmole) com 1,4 mL de uma solução 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min à TA durante siARN que é para ser encapsulada em lipossomas DSPE paletes. </li><li> Re-hidratar os lipossomas DOTAP PALETS com 200 ul de uma solução stock de 4 nmol de lipossomas re-hidratados ou siRNA DSPE PALETS com 201,4 ul da solução de / protamina siARN. Incubar solução de lipossoma / ARNsi durante 10 min à TA. </li><li> Adicionam-se 10 ul de uma (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), solução de ácido 3- 1-etil-60 mM à solução de lipossoma / siRNA para tanto DOTAP e DSPE PALETS. </li><li> Adicionam-se 10 ul de uma solução 150 mM de N-hidroxissulf (sulfo-NHS) para a solução de lipossomas / siRNA para tanto DOTAP e DSPE PALETS. </li><li> Incubar o EDC e sulfo-NHS com a suspensão / lipossoma ARNsi durante 2 h à TA. </li><li> Incubar 80 ul de uma 500 uM (40 Total nmole) solução estoque RVG-9R com o siRNA / lipossoma solução durante 10 min a RT de reticulação. NOTA: A EDC / sulfo-NHS permite que o RVG-9R a ligação covalente aos lipídeos PEG. Use PALETS dentro de várias horas após a preparação. PALETS armazenar a 4 ° C, durante várias horas após a preparação. </li><li> Para determinar a eficiência de encapsulação de siRNA PALETS: <ol><li> Medir a concentração de ARNsi antes e após a adição de protamina e lipossomas utilizando um espectrofotómetro ajustado a 260 nm. </li><li> Filtra-se o siARN não encapsulado a partir da suspensão de lipossomas siRNA / encapsulado utilizando filtros centrífugos de 50 kDa. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min. </li><li> Medir a concentração desiRNA não encapsulado no filtrado, e a concentração de ARNsi encapsulado no retentado usando um espectrofotómetro a 260 nm. </li></ol></li></ol> 3. injectando ratinhos com LSPCs ou PALETS <ol><li> Expor os ratos para 5-10 min a uma lâmpada de calor para dilatar vasos. </li><li> Anestesiar rato com um 2-3% isoflurano / oxigênio fluir 5-10 min antes da injeção, e durante a injeção. Confirmar anesthetization em que os animais não é mais ambulante e respirações ter abrandado, fazendo uma pitada dedo do pé. Posicione o mouse sobre as suas costas ou de lado para acessar a veia da cauda. Use pomada veterinário nos olhos de rato para evitar a secagem sob anestesia. </li><li> Limpe / pulverização, a cauda, ​​com 70% de EtOH e injectar 300 ul de LSPCs ou PALETS na veia da cauda do rato utilizando uma seringa de 26 L de insulina. Começam a injectar de modo distal para dentro da veia da cauda e mova proximalmente se a veia colapsos ou rupturas. </li><li> Coloque rato em uma gaiola limpa até que ele mantém decúbito esternal. Não coloque mousar com outros companheiros de gaiola até que ele se recuperou totalmente. Ratos deve se recuperar em 5 a 15 min. Eles podem ser colocados sobre uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal, se a recuperação é mais demorada. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados para proteger contra sobre-aquecimento. </li><li> Monitorar os animais de várias horas após a injeção para garantir a anestesia desgasta fora, e não há efeitos nocivos do tratamento. Permitir que as LSPCs ou PALETS a circular por pelo menos 24 horas. </li></ol> 4. Análise da expressão proteica através de Citometria de Fluxo <ol><li> Eutanásia ratos com uma taxa de fluxo de 20% de CO 2 durante 15 min. </li><li> Dissecar metade de um hemisfério do cérebro, cortando a pele e crânio do rato com uma tesoura. Descascar metade de um hemisfério cerebral longe do crânio usando uma pinça ou o fim de um par de tesouras. </li><li> Pressione metade de um hemisfério do cérebro de cada ratinho através de um filtro de células de malha de 40 um, usando 2,5 ml de tampão FACS (1x; PBS, 1% de soro bovino fetal, 10 mM de EDTA) num prato de Petri com o êmbolo de uma seringa. </li><li> Lavar o filtro de células e uma placa de Petri com um adicional de 2,5 mL de tampão de FACS. Coloque a única suspensão celular num tubo cónico de 15 ml em gelo. </li><li> Pipete 100 pi da suspensão de células únicas de 5 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar durante 5 minutos a 350 x g. Desprezar o pelete de células sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de FACS. Girar a 350 g durante 5 min. Repetir com mais 1 ml de tampão de FACS. Manter a suspensão de células em gelo. </li><li> Incubar as células em 100 ul de 1: 100 de diluição de uma solução a 0,5 mg / ml de rato bloco anti-rato Fc em tampão FACS durante 30-60 min em gelo. Sedimentar as células e lava-se como na etapa 4.5. Manter a suspensão de células em gelo. </li><li> Incubar as células em 100 ul de uma / 20 ug de anticorpo fluorescente contra ml rato PrP C em soro de ratinho a 7% em tampão de SCAF em gelo durante 30-60 min. Sedimentar as células e lava-se como na etapa 4.5. Manter a suspensão de célulasno gelo. </li><li> Pellet e re-suspender as células em 1 ml de tampão de lise de RBC (1x PBS, 155 mM de NH4Cl, 12 mM de NaHCO3, 0,1 mM de EDTA) durante 1 min. Pellet como no passo 4.5 e ressuspender as células em 1 ml de tampão de FACS. Manter a suspensão de células em gelo. </li><li> Analisar a expressão da PrP C utilizando um citómetro de fluxo, conforme descrito anteriormente 10. Portão de células a partir da população total de células viver. Portão PrP C + células a partir da população de células vivas para determinar IMF (intensidade de fluorescência mediana). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este relatório descreve um protocolo para criar dois sistemas de administração específicas que transporta de forma eficiente siRNA para o SNC. Os métodos anteriores de entrega de siRNA para o SNC incluíram injecção de vectores de ARNsi / shRNA directamente para o cérebro, a injecção intravenosa de siRNA alvo, ou injecção intravenosa de complexos lipossoma-siRNA não-alvo. A injecção de vectores de ARNsi / shRNA no SNC não causar uma diminuição nos níveis de expressão da proteína alvo. No entanto, o siRNA / shRNA não se d...

Os priões são graves doenças neurodegenerativas que afectam o SNC. Doenças de priões, resultar a partir do enrolamento incorrecto da proteína prião celular normal, a PrP C, por um chamado isómero infecciosa PrP Res. Estas doenças afectam uma grande variedade de espécies, incluindo a encefalopatia espongiforme bovina em vacas, scrapie em ovinos, a doença emaciante crónica dos cervídeos, ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos 1-3. Prions causar neurodegeneração que começa com a perda sináptica, e progride para vacuolização, gliose, perda neuronal, e depósitos de placas. Eventualmente, resultando na morte do animal / indivíduo 4. Durante décadas, os pesquisadores investigaram compostos destinados a retardar ou parar a progressão da doença de príon. No entanto, os investigadores não encontraram qualquer uma terapia bem sucedida ou um veículo eficaz de entrega sistémica. Endógena expressão da PrP C é necessária para o desenvolvimento de doenças provocadas por priões 5 </s-se&gt;. Por isso, diminuindo ou eliminando a expressão da PrP C pode resultar num atraso ou melhoria da doença. Vários grupos de ratinhos transgénicos criados com níveis reduzidos de PrP C ou lentivectores injectados expressam shRNA directamente no tecido cerebral de murino para investigar o papel dos níveis de expressão da PrP C em doenças de prião. Estes investigadores encontraram reduzindo a quantidade de PrP C neuronal resultaram em travar a neuropatologia progressiva de doenças provocadas por priões e estendeu a vida dos animais 6-9. Nós relataram que os resultados do tratamento PrP C siRNA na depuração da PrP Res em células de rato neuroblastoma 10. Estes estudos sugerem que o uso de terapias para diminuir os níveis de expressão da PrP C, como pequeno ARN interferente (siRNA), que cliva o ARNm, podem suficientemente retardar a progressão de doenças provocadas por priões. No entanto, a maioria das terapias investigados para doenças de prião foram entregues de formas que não seria práticoem um ambiente clínico. Portanto, uma terapia de ARNsi necessita de um sistema de entrega sistémica, que é entregue por via intravenosa e orientada para o SNC. Os investigadores estudaram a utilização de lipossomas como veículos de entrega de produtos de terapia génica. Os lípidos catiónicos e aniónicos são ambos usados ​​na formação dos lipossomas. Os lípidos catiónicos são mais amplamente utilizados de lípidos aniónicos, porque a diferença de carga entre o lípido catiónico e do ADN / ARN permite o empacotamento eficiente. Outra vantagem de lípidos catiónicos é que eles atravessam a membrana celular mais facilmente do que outros lípidos 11-14. No entanto, os lípidos catiónicos são mais imunogénicos do que os lípidos aniónicos 13,14. Portanto, os pesquisadores começaram a mudar de usar catiônico para aniï¿½icos lípidos em lipossomas. Produtos de terapia génica pode ser eficazmente embalado em lipossomas aniónicos, utilizando o sulfato de protamina péptido carregado positivamente, que se condensa moléculas de ADN / ARN 15-19. Desde Lipi aniônicaDS são menos imunogénicos do que os lípidos catiónicos podem ter tempos de circulação aumentados, e podem ser mais tolerados em modelos animais 13,14. Os lipossomas são direcionados para os tecidos específicos usando segmentação peptídeos que estão ligados aos lipossomas. O neuropeptídeo RVG-9R, que se liga a receptores nicotínicos da acetilcolina, tem sido utilizado para segmentar siRNA e lipossomas para o SNC 17-20. Este relatório descreve um protocolo para produzir três veículos de entrega de siRNA, e para empacotar e entregar o siRNA para as células neuronais (Figura 1). complexos de siRNA-lipossoma-péptido (LSPCs) são compostos de lipossomas com o siRNA e RVG-9R peptídeo alvo electrostaticamente ligado à superfície exterior do lipossoma. Péptido dirigida lipossoma encapsulado terapêuticos siRNA (PALETS) são compostos de siRNA e protamina encapsulado no interior do lipossoma, com RVG-9R covalentemente ligado a grupos de PEG lípido. Usando os métodos abaixo para gerar LSPCs e PALETS, PrP C siARN diminui a expressão da PrP C até 90% em células neuronais, o que possui tremendo potencial para curar ou retardar o aparecimento da patologia da doença do prião substancialmente.

<table><tbody><tr><td>Lipídio DOTAP</td><td>Avanti Lipids</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipids</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipids</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gás</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora</td><td>Avanti Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4, e 0.2 &#956; m filtros</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Aliquotado para uso único</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Aliquotado para uso único</td></tr><tr><td>40 &#956; m Filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD16 / CD32 Fc bloco</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-PrP (PRC5)</td> <td>Proprietário - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de terapêutica sirna para o snc usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

As doenças priônicas resultam do dobramento incorreto da proteína príon celular normal (PrPC) em um isômero resistente à protease anormal chamadoPrP Res. O surgimento de doenças priônicas em populações de animais selvagens e sua crescente ameaça à saúde humana levaram a maiores esforços para encontrar um tratamento para essas doenças. Estudos recentes encontraram vários compostos anti-príons que podem inibir o isômeroPrP Res infeccioso ou regular negativamente a proteína príon celular normal. No entanto, a maioria desses compostos não atravessa a barreira hematoencefálica para inibir efetivamente a formação dePrP Res no tecido cerebral, não visam especificamente o PrPC neuronal e geralmente são tóxicos demais para serem usados em animais ou humanos. 
Investigamos se o siRNA entregue por via intravascular e direcionado ao PrPC neuronal é um composto anti-príon mais seguro e eficaz. Este relatório descreve um protocolo para produzir dois veículos de entrega lipossomal de siRNA e para empacotar e entregar siRNA PrP às células neuronais. Os dois veículos de entrega lipossomal são 1) formulação de lipossomas siRNA complexados usando lipossomas catiônicos (LSPCs) e 2) formulação de lipossomas siRNA encapsulados usando lipossomas catiônicos ou aniônicos (PALETS). Para os LSPCs, o siRNA carregado negativamente está eletrostaticamente ligado ao lipossomo catiônico. Um peptídeo carregado positivamente (RVG-9r [glicoproteína do vírus da raiva]) é adicionado ao complexo, que visa especificamente os complexos lipossomasmos-siRNA-peptídeo (LSPCs) através da barreira hematoencefálica (BBB) para neurônios que expressam acetilcolina no sistema nervoso central (SNC). Para o PALETS (siRNA terapêutico encapsulado em lipossomas endereçados a peptídeos), os lipídios catiônicos e aniônicos foram reidratados pelo siRNA PrP. Este procedimento resulta no encapsulamento do siRNA dentro dos lipossomas catiônicos ou aniônicos. Novamente, o neuropeptídeo RVG-9r foi ligado aos lipossomas para direcionar os complexos siRNA / lipossomas para o SNC. Usando essas formulações, entregamos com sucesso o siRNA PrP aos neurônios que expressam AchR e diminuímos a expressão de PrPC dos neurônios no SNC.

Para aumentar a eficiência de encapsulação dentro de siRNA PALETS aniónicos, o siARN foi misturado com protamina. Para determinar a melhor concentração de protamina para o ARNip, o siARN foi misturado com diferentes concentrações de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Houve um 60-65% siARN eficiência de encapsulação em lipos somas aniónicos, sem a utilização de protamina. As amostras com protamina: razões molares de ARNsi de 1: 1 a 1,5: 1 (133-266 nM) apresen...

O objetivo deste protocolo é usar lipossomas catiônicos/aniônicos com um peptídeo neurodirecionado como um sistema de entrega do SNC para permitir que o siRNA atravesse o BBB. A otimização de um sistema de entrega para tratamentos, como o siRNA, permitiria mais opções de tratamento para príons e outras doenças neurodegenerativas.

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

O objetivo geral deste procedimento é projetar um sistema de entrega capaz de transportar fármacos de molécula pequena, como o siRNA, até o cérebro. Este método pode responder perguntas fundamentais na área de neurodegeneração, tais como: O siRNA é uma opção terapêutica viável para doenças por mau dobramento de proteínas? E será possível projetar um sistema confiável de entrega de fármacos ao cérebro?A principal vantagem de criar um sistema de liberação de fármacos lipossomal é que podemos administrar nosso siRNA por via intravenosa ou pela corrente sanguínea, em vez de diretamente no tecido neuronal, o que resultaria em danos neuronais. As implicações dessa técnica estendem-se às áreas de terapêutica e diagnóstico de doenças neurodegenerativas, pois esse método permite a liberação específica através da barreira hematoencefálica, particularmente nas células neuronais que expressam acetilcolina. A demonstração visual dessa técnica é essencial, já que as injeções na veia da cauda de camundongos são difíceis de aprender devido ao pequeno tamanho da veia da cauda do camundongo.Inicie preparando uma proporção um para um de DOTAP para colesterol. Para um preparo de lipossoma com animais exóticos, misture dois nanomols de DOTAP e dois nanomols de colesterol em dez mililitros de uma solução de clorofórmio para metanol na proporção um para um. Em seguida, evapore nove mililitros da solução de clorofórmio e metanol usando gás nitrogênio.Evapore o último mililitro do solvente em uma capela durante a noite sem aquecimento. No dia seguinte, uma película fina de lipídio deve ser visível no fundo do frasco. Aqueça tanto este frasco com a película de lipídio quanto dez mililitros de uma solução de sacarose a dez por cento até 55 graus Celsius.Em seguida, pipete lentamente a solução de sacarose aquecida sobre o filme lipídico fino, girando suavemente o frasco. Depois, monte um extrusor com filtros de um mícron conforme as instruções do fabricante. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão de lipossomos aquecida a uma das seringas do extrusor.Em seguida, passe a suspensão entre as duas seringas 11 vezes. Enquanto mantém a suspensão de lipossomos aquecida para facilitar o dimensionamento, passe os lipossomos por um filtro de 45 mícrons e depois por um filtro de 2 mícrons. Para gerar vesículas unilamelares grandes, adicione 20 microlitros da suspensão de lipossomos de quatro nanomoles a 200 microlitros de uma solução estoque de siRNA a 20 micromolares e incube por dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 80 microlitros de um estoque de 500 micromolares do peptídeo direcionador RVG-9R à solução de lipossomos com siRNA e incube por dez minutos à temperatura ambiente.Prepare uma suspensão de lipossomos estrangeiros misturando 2,2 nanomols de DSPE ou DOTAP em dez mililitros de uma solução de clorofórmio para metanol na proporção de dois para um, contendo 1,6 nanomols de colesterol e 2 nanomols de DSPE-peg. Em seguida, aplique gás nitrogênio e, quando a maior parte do solvente tiver evaporado, deixe o frasco na capela durante a noite. Então, adicione lentamente dez mililitros de PBS 1X aquecido a 75 graus Celsius ao filme lipídico fino.Deixe os lipídios se reidratarem a 75 graus Celsius por pelo menos uma hora antes da determinação do tamanho. Após o dimensionamento da suspensão de lipossomos utilizando um extrusor como anteriormente, pipete 20 microlitros de cada uma das quatro suspensões de lipossomos de nanomol em alíquotas de uso único e liofilize por 30 minutos usando um liofilizador de bancada. Em seguida, adicione 1,4 microlitro de uma solução de sulfato de protamina 26,6 micromolar a 200 microlitros de solução estoque de siRNA 20 micromolar e incube por dez minutos à temperatura ambiente para condensar o siRNA.Após a incubação, reidrate os paletes de DSPE com 201,4 microlitros de solução de siRNA com protamina. Rehidrate os paletes de DOTAP com 200 microlitros de uma solução estoque de siRNA de origem animal estranha. Incube cada solução de siRNA lipossomal durante dez minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione dez microlitros de uma solução de EDC 60 milimolar a cada tubo de lipossomos reidratados. Depois, adicione dez microlitros de uma solução de sulfo-NHS 150 milimolar à solução de lipossomos com siRNA para ambas as paletas DOTAP e DSPE. Incube por duas horas à temperatura ambiente.Por fim, adicione 80 microlitros da solução estoque de 500 micromolar do peptídeo RVG-9R à solução de cruzamento de lipossomos com siRNA e incube por dez minutos à temperatura ambiente. Após anestesiar um camundongo usando dois a três por cento de isoflurano em oxigênio, cubra os olhos do camundongo com pomada oftálmica e confirme a anestesia realizando um aperto no dedo do pé. Prossiga somente se não houver reação.Enquanto mantém a anestesia, posicione o camundongo em decúbito dorsal ou lateral para acessar a veia da cauda. Limpe a cauda com etanol a 70 por cento e, em seguida, utilize uma seringa de insulina de 26 gauge para injetar 300 microlitros de LSPCs ou palets na veia da cauda. Inicie a injeção distalmente e mova-se proximalmente se a veia colapsar ou romper.Coloque o camundongo em uma gaiola limpa até que mantenha decúbito esternal. Monitore o animal por várias horas após a injeção para garantir que a anestesia desapareça e que não haja efeitos adversos do tratamento. Após permitir que as LSPCs ou palets circulem por pelo menos 24 horas e então eutanasiar o camundongo, dissecar metade de um hemisfério do cérebro.Em seguida, coloque a meia-hemisfério e 2,5 mililitros de tampão fax sobre um filtro celular de malha de 40 mícrons e use o êmbolo de uma seringa para pressionar o tecido através do filtro para dentro de uma placa de Petri. Enxágue o filtro celular e a placa de Petri com mais 2,5 mililitros de tampão fax. Em seguida, transfira a suspensão de células isoladas para um tubo cônico de 15 mililitros e coloque no gelo.Em seguida, pipete 100 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e centrifugue por cinco minutos a 350 vezes G. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão fax e centrifugue novamente. Então, adicione outro mililitro de tampão fax e coloque a suspensão celular no gelo. Agora, incube as células em 100 microlitros de bloqueador Fc anti-rato anti-mouse em tampão fax por 30 a 60 minutos no gelo.Após a centrifugação e lavagem como anteriormente, adicione 100 microlitros de solução fluorescente do anticorpo primário e coloque no gelo por 30 a 60 minutos. Após uma lavagem final, re-suspenda as células em um mililitro de tampão de lise RVC por um minuto. Em seguida, centrifugue as células.Após descartar o tampão, re-suspenda em um mililitro de tampão fax e coloque no gelo. As células estão agora prontas para análise por fax. Camundongos tratados com siRNA administrado por meio de LSPCs mostraram uma diminuição significativa nos níveis de proteína priônica celular em comparação com um controle de PBS, o qual mostra os níveis normais de proteína priônica celular.Os camundongos tratados com LSPCs apresentaram níveis de proteína priônica celular próximos aos de um camundongo com proteína priônica "knock out". Em três experimentos, os camundongos tratados com LSPCs mostraram diminuições significativas nos níveis de proteína priônica celular em comparação com o controle de tipo enquanto tratados com PBS. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os lipossomos podem ser armazenados na geladeira por vários meses, mas os LSPCs completos devem ser utilizados dentro de 24 horas após a montagem.Após seu desenvolvimento, a geração de LSPCs ou palets abrirá caminho para que pesquisadores explorem mais opções terapêuticas no campo das doenças neurodegenerativas.

delivery-therapeutic-sirna-to-cns-using-cationic-anionic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O encapsulamento do medicamento aumenta a especificidade das células tumorais e reduz a neurotoxicidade.

Entrega aprimorada por convecção de lipossomas carregados revestidos de polietilenoglicol em um tumor cerebral de rato

Fonte: Ullah, I., et.al. Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega intranasal de siRNA ao sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra uma técnica de administração intranasal precisa para fornecer complexos peptídeo-siRNA direcionados a neurônios ao cérebro de camundongos usando um dispositivo de posicionamento especializado. Os camundongos anestesiados são fixados em uma posição de cabeça para baixo e para frente para otimizar a...

Entrega intranasal de siRNA ao cérebro de camundongo usando um dispositivo de posicionamento

Fonte: Bender, H. R., et.al. Entrega de siRNA terapêutico ao SNC usando lipossomas catiônicos e aniônicos. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a entrega direcionada de siRNA de proteína príon (PrP) aos neurônios usando complexos lipossomais de siRNA-peptídeo (LSPCs). Os lipossomas catiônicos ligam-se eletrostaticamente ao siRNA direcionado ao PrP, que é ainda estabilizado pelo peptídeo RVG-9r para transporte mediado por receptor através da barreira hematoencefálica. Uma vez dentro do...

Entrega de siRNA direcionada a neurônios para silenciamento de proteínas príon usando complexos lipossomais

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Entrega continua a ser o principal desafio para a aplicação terapêutica de RNA de interferência pequeno (siRNA). Este protocolo envolve a utilização de uma plataforma de entrega de siRNA multifuncional e biocompativel, que consiste de arginina e polietilenoimina enxertado micropartículas de silício poroso.

Porous Silicon micropartículas para entrega de siRNA Therapeutics

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.

Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central

São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.

Preparação de nanopartículas poliméricos neutralmente carregadas e responsivas ao pH para entrega de siRNA citosólica

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Aprenda a entregar siRNA ao SNC usando lipossomas catiônicos e aniônicos com peptídeos neurodirecionadores. Este método permite transporte intravenoso através da barreira hematoencefálica para tratamento de doenças neurodegenerativas.

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

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