Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

O objetivo geral deste procedimento é detectar e rastrear a reversão do processo de morte celular após a ativação da caspase em animais vivos usando Drosophila melanogaster como modelo. Em resposta ao estímulo da morte, as células sofrem morte celular programada, como a apoptose, que tradicionalmente tem sido considerada uma cascata irreversível que leva à morte celular. Curiosamente, no entanto, após a remoção do estímulo da morte, algumas células moribundas podem reverter o processo de morte celular mesmo no estágio tardio.

Através de um fenômeno de recuperação celular recém-descoberto chamado anastasis. A microscopia de células vivas mostra que as células apoptóticas moribundas exibem características morfológicas únicas, como bolhas na membrana do plasmídeo, condensação nuclear e encolhimento celular. Em geral, espera-se que essas células morram.

No entanto, após lavar e incubar as células moribundas com meio fresco, elas passam por anástase, se recuperam e podem se dividir posteriormente. É difícil detectar e rastrear a anastase em animais vivos porque as células recuperadas podem ser morfologicamente indistinguíveis das células saudáveis circundantes. Para resolver esse problema, o sistema de biossensores CaspaseTracker de mamíferos foi desenvolvido para identificar e rastrear as células que revertem o processo de morte celular após a execução ou ativação da caspase, a marca registrada da apoptose.

Este sistema de biossensor consiste em dois componentes: o transativador ativável de caspase, rtTA, e o repórter de atividade rtTA baseado em Cre LoxP. Em células saudáveis, sem atividade de caspase, o rtTA é amarrado a uma âncora de membrana plasmática por meio do ligante DEVD clivável por caspase. Como o rtTA amarrado não pode se translocar do citosol para o núcleo, o repórter rtTA permanece inativo.

No entanto, após a ativação em resposta à indução da morte celular, as caspases clivam o ligante DEVD, liberando o rtTA para se translocar para o núcleo para ativar o repórter rtTA. Uma vez no núcleo, o rtTA se liga ao elemento de resposta tet, ou TRE, e desencadeia a expressão transitória de Cre recombinase, levando a um evento de recombinação irreversível que remove o do códon de parada entre o promotor CAG e as sequências codificantes da proteína fluorescente vermelha DsRed. Isso resulta na expressão permanente de DsRed, que serve como marcador fluorescente permanente para células que podem permanecer vivas após terem experimentado a atividade da caspase, bem como sua progênie.

A microscopia confocal de células vivas mostra que após a indução da morte celular transitória, as células biossensoras CaspaseTracker expressam DsRed durante e após sua recuperação e, portanto, as distinguem das células não recuperadas, indicadas por setas brancas, bem como das células biossensoriais controle que não foram expostas ao estímulo de morte celular. A morte celular programada, como a apoptose, é geralmente considerada irreversível porque é executada por uma destruição celular desenfreada e maciça. No entanto, descobrimos que essa célula moribunda pode realmente se recuperar mesmo no estágio tardio que tem sido considerado o ponto sem retorno, como após a liberação do citocromo c, ativação da caspase-3, danos ao DNA, bolhas na membrana plasmática, encolhimento celular e formação de corpos apoptóticos.

Chamamos isso de anastase do processo de reversão da morte celular, que significa ressuscitar para a vida em grego. Usando microscopia de células vivas, podemos observar a anastase em células cultivadas. No entanto, é tecnicamente desafiador observar a anastase em animais vivos porque a célula de morte recuperada pode se parecer com células saudáveis normais que não tentaram a morte celular.

Portanto, desenvolvemos um sistema de biossensor CaspaseTracker para detectar e rastrear a anastase em animais vivos. A versão Drosophila do sistema CaspaseTracker é um biossensor duplo que consiste em dois componentes: o fator de transcrição de uso ativável por caspase, GAL4, e o relator de atividade GAL4, conhecido como G-TRACE. Nas células sem atividade de caspase, o fator de transcrição de levedura, GAL4, é ligado a um domínio âncora da membrana plasmática por meio de um ligante DQVD clivável por caspase.

Após a ativação da caspase, as caspases ativadas clivam o ligante DQVD para liberar GAL4, que então se transloca para o núcleo para ativar o repórter G-TRACE. O GAL4 nuclear se liga às sequências de ativação a montante específicas, abreviadas UAS, para desencadear a expressão transitória de RFP, que serve como repórter da atividade recente ou atual da caspase até que a caspase e a atividade GAL4 parem e a proteína RFP seja degradada. O GAL4 também desencadeia a expressão da FLP recombinase, o que leva a um evento de recombinação que remove o de parada entre a ubiquitina, abreviada Ubi, promotor e as sequências de revestimento para a GFP direcionada ao nuclear.

Isso resulta na expressão permanente de GFP nuclear, que serve como um marcador permanente para células que sofreram atividade de caspase, mas permanecem vivas, bem como sua progênie. Portanto, este sistema pode identificar células com atividade de caspase em andamento ou recente pelo sinal de RFP transitório e atividade de caspase passada com o sinal GFP permanente. Um biossensor de controle tem a mutação DQVA no local de clivagem da caspase, que é insensível à atividade da caspase.

Moscas fêmeas virgens GAL4 sensíveis à caspase foram cruzadas com moscas machos jovens G-TRACE, ou vice-versa, para gerar as moscas CaspaseTracker. Para testar a reversibilidade do processo de morte celular após a ativação da caspase, as moscas são primeiro expostas a estresse ambiental transitório e indutor de morte celular, como choque frio ou falta de proteínas. Em seguida, as moscas estressadas são transferidas de volta às condições normais de cultura para recuperação.

Os tecidos foram obtidos das câmaras de ovos nos ovários das moscas controle, estressadas ou recuperadas. As amostras foram submetidas à microscopia confocal para detectar os sinais fluorescentes do biossensor CaspaseTracker. Para começar, moscas DQVD GAL4 anestesiadas e recentemente fechadas sensíveis à caspase usando dióxido de carbono e, com um pincel, transferem de 7 a 10 fêmeas virgens para um frasco de comida fresca com uma pequena porção de pasta de fermento.

Acasalar as fêmeas com 7 a 10 machos repórteres G-TRACE GAL4 jovens. As moscas virgens recém-fechadas mostram o mecônio verde escuro, indicado por setas, que são os restos de comida larval. As moscas recém-fechadas tendem a ser maiores do que as moscas maduras.

Os machos têm um abdômen mais escuro, indicado por círculos, e tendem a ser menores que as fêmeas. Configure a cruz a 18 graus Celsius para reduzir os sinais não específicos do biossensor CaspaseTracker na progênie porque a atividade do GAL4 aumenta com a temperatura. A cada três a sete dias, coloque os adultos em um novo frasco com pasta de fermento até que sua produtividade diminua.

Quando a progênie for fechada, conecte as moscas com ambos os transgenes de GAL4 sensível à caspase e G-TRACE, que funcionarão como as moscas da progênie CaspaseTracker. Ambas as inserções são balanceadas por Curly-O. Portanto, as moscas aladas não encaracoladas terão ambos os transgenes.

Para um controle negativo, colete progênie de transgene duplo de um cruzamento entre fêmeas DQVA GAL4 insensíveis à caspase e machos repórteres G-TRACE GAL4 ou vice-versa. A partir dos cruzamentos experimentais, transfira coortes de 10 a 20 moscas fêmeas recém-fechadas para novos frascos com pasta de fermento. Adicionar alguns machos ajudará as fêmeas na produção de ovos.

Transfira as moscas bem alimentadas para 18 graus Celsius por um dia para que seus ovários produzam câmaras de ovos por meio da OO-gênese. Em seguida, para induzir suas câmaras de ovos a sofrer apoptose, use um choque frio. Transfira as moscas para um novo frasco sem comida e congele-as a 7 graus Celsius por uma hora.

Um método alternativo para induzir a apoptose da câmara de ovos é usar a falta de proteína, abrigando as moscas com 8% de sacarose, 1% de ágar a 18 graus Celsius por três dias. Troque os frascos de alimentos sem proteína diariamente ao usar este método. Depois de estressar as moscas por qualquer um dos métodos, devolva-as à condição normal de alojamento e alimente-as com pasta de fermento por três dias para permitir que se recuperem.

Mais tarde, disseque essas moscas para isolar suas câmaras de ovos e ovários. Depois de anestesiar Em seguida, puxe as moscas na base do abdômen para remover seus ovários.

Prepare-se para coletar os ovários revestindo as pontas da pipeta de plástico com 1% de BSA dissolvido em água ou PBS para que as câmaras de ovos não grudem nas pontas da pipeta. Depois de dissecar as câmaras de ovos, colete-as em pontas preparadas com cerca de meio mililitro de PBS. Em seguida, transfira-os para um tubo de centrífuga de um mililitro e deixe os ovos assentarem.

Continue o procedimento sob condições de pouca luz ou completamente escuras para evitar o branqueamento fotográfico das etiquetas fluorescentes. Aspire o PBS e carregue 500 microlitros de paraformaldeído a quatro por cento em PBS no tubo da centrífuga. Deixe os ovos fixarem por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente com rotação suave.

Evite a fixação prolongada, pois ela esgotará o sinal das proteínas fluorescentes nas câmaras dos ovos. Depois de fixado, remova o PFA e lave as câmaras de ovos com 500 microlitros de PBS-T três vezes. Em seguida, incube as câmaras de ovos com PBS-T durante a noite a 4 graus Celsius com rotação suave para permeabilizar as câmaras de ovos.

Na manhã seguinte, adicione 500 microlitros de PBS-T com 5 microgramas de corante nuclear azul, como Hoechst, às câmaras de ovos. Deixe-os incubar com rotação suave à temperatura ambiente por uma a duas horas, mas não mais, ou os sinais se tornarão inespecíficos. Em seguida, lave a câmara de ovos com PBS-T três vezes por 10 minutos por lavagem.

Em seguida, usando uma pipeta fina, aspire todo o PBS-T e aplique 200 microlitros de agente de montagem anti-branqueamento. Os tecidos flutuam na parte superior antes de absorverem totalmente o agente de montagem. Incube a câmara de ovos no agente a 4 graus Celsius por três horas a durante a noite.

Depois de absorver totalmente o agente de montagem, os tecidos afundam no fundo dos tubos e estão prontos para serem montados. Para começar, aplique vaselina na lâmina de vidro ou na lamínula para evitar a destruição das câmaras de ovos por compressão excessiva. Para montar as câmaras de ovos manchadas, transfira-as com 200 microlitros de agente de montagem para uma lâmina de vidro e cubra-as com uma lamínula de vidro de 20 milímetros quadrados.

Sele a lamínula com esmalte e prossiga com o uso de microscopia confocal. Nas câmaras de ovos do ovário nas moscas saudáveis CaspaseTracker não houve atividade do biossensor CaspaseTracker, indicada pela falta de fluorescência verde e vermelha. No entanto, depois de submeter as moscas a estresse ambiental indutor de morte celular, como fome de proteínas por três dias, as câmaras de ovos passaram pelo processo de morte celular com ativação de caspase, que induziu sinais de biossensores RFP e GFP.

Em contraste, a mutação do local de clivagem da caspase nas moscas DQVA insensíveis à caspase de controle aboliu a sensibilidade do biossensor, indicando que os sinais do biossensor dependem da atividade da caspase. Em seguida, as moscas biossensoras famintas e sensíveis à caspase receberam alimentos proteicos por três dias. As câmaras de ovos das moscas recuperadas não expressaram o relator de caspase transitória RFP, indicando nenhuma atividade de caspase recente ou em andamento.

É importante ressaltar que as câmaras de ovos recuperadas expressaram apenas GFP, indicando que reverteram o processo de morte celular após a ativação da caspase. A anastase também é observada in vivo após estresse térmico transitório indutor de morte celular. Em resposta ao choque frio, as câmaras de ovos moribundos expressam os marcadores de biossensores RFP e GFP, indicando atividade de caspase recente ou em andamento, representada pelo sinal RFP, e atividade de caspase passada, representada pelo sinal GFP.

No entanto, após aliviar o estresse retornando à condição normal de cultura por três dias, as câmaras de ovos nas moscas recuperadas exibiram apenas o repórter de caspase GFP, indicando que as células nessas câmaras de ovos foram submetidas a análise em um ponto após a ativação da caspase. Notavelmente, o sinal GFP CaspaseTracker revela que vários tipos de células dentro das câmaras de ovos são capazes de reverter o processo de morte celular e reparar os danos das caspases, incluindo células da linha germinativa, como oócitos e células enfermeiras, e células foliculares somáticas. Curiosamente, a GFP também rotulou células no germário, que contêm células-tronco, juntamente com suas câmaras de ovos associadas na mesma cadeia ovarial.

Portanto, essas câmaras de ovos positivas para GFP podem ter sido derivadas de células-tronco que foram submetidas a anástase. Aqui estão as imagens que mostram os tecidos que exibem a atividade do biossensor CaspaseTracker sem exposição ao estresse ambiental. Estas são as partes da boca, intestino anterior, colheita, intestino médio, intestino posterior, túbulos de Malpighi, ânus, oviduto e ovários de uma mosca fêmea do Dia 0 dissecada e recém-fechada

A microscopia confocal revela atividade recente de caspases, conforme indicado por RFP, e a atividade de caspases passadas, indicada por GFP. Imagens ampliadas mostram a atividade recente ou contínua e passada da caspase no lobo óptico, cárdia, túbulos de Malpighi, intestino grosso e nas paredes musculares nas câmaras de ovos que co-localizaram com a coloração de F-actina. Alguns tecidos, como o oviduto, demonstram apenas atividade de caspase passada.

Essas atividades do biossensor sugerem atividade anestésica potencial durante o desenvolvimento embrionário ou homeostase normal. Também pode indicar atividade de caspase não apoptótica atual ou passada. Por favor, veja o manuscrito para mais detalhes.

O biossensor CaspaseTracker in vivo relata especificamente a atividade da caspase, pois o CaspaseTracker insensível com a sequência não caspase-cleavável DQVA não tem atividade do biossensor. O único sinal aqui é o sinal não específico de autofluorescência de pigmentos, cutículas e corpos adiposos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão geral de como podemos usar o sistema de biossensores CaspaseTracker para detectar e rastrear a análise em animais vivos.

Esses biossensores podem facilitar os estudos da moeda e da função conhecida da anastase. Sua identificação de alcance tem uma ampla gama de aplicações fisiológicas, patológicas e terapêuticas. Embora esses biossensores possam detectar a reversão da apoptose após a ativação da caspase, eles também podem detectar a recuperação das células após tentarem outras formas de morte celular que envolvem direta ou indiretamente atividades de caspase.

Ao projetar um experimento, é muito importante incluir controles recíprocos para distinguir o sinal do biossensor fluorescente que rastreia as células anestésicas das células moribundas com atividades de caspase em andamento. As células saudáveis com as atividades de caspase apoptótica conhecidas atuais ou passadas e o sinal de autofluorescência não específico do pigmento, gordura e crítico. Por favor, encontre a discussão detalhada na versão em PDF deste manuscrito.