Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de Xenopus laevis

O objetivo geral deste procedimento é registrar as alterações de cálcio nos neurônios do bulbo olfatório em resposta a quedas de temperatura induzidas no epitélio nasal. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das afecções, como a forma como o bulbo olfatório integra e processa as informações de temperatura adquiridas no nariz. Os neurônios de primeira e segunda ordem do bulbo olfatório são corados diferencialmente e os efeitos das flutuações de temperatura no epitélio nasal são medidos por imagens de cálcio.

A demonstração visual de eletroporação celular, carregamento de bolus e imagem de correlação de atividade facilitará a implementação dessas técnicas em redes cerebrais diferentes do bulbo olfatório. Para iniciar este procedimento, coloque um girino em uma almofada de gel. Conserte-o colocando agulhas ao redor e tome cuidado para não enfiar as agulhas em sua pele.

Em seguida, coloque o animal sob o microscópio estéreo e concentre-se nas narinas. Em seguida, coloque um cristal de corante em uma das cavidades nasais e espere até que ele se dissolva completamente, o que deve levar menos de um minuto. Se os cristais forem menores, adicione dois ou três em cada cavidade até que produzam uma solução não translúcida e altamente concentrada.

Depois disso, coloque o cátodo na pele do girino e o ânodo em uma das narinas. Aplique seis pulsos de 20 volts e 20 milissegundos com aproximadamente 0,5 segundos de intervalo de estímulo. Para corantes com polaridade diferente, os resultados da coloração podem ser melhorados colocando o cátodo nas narinas.

Se não tiver certeza sobre a polaridade do corante, ambos os eletrodos podem ser colocados simultaneamente nas narinas e alternar a polaridade entre pulsos de tensão única. Depois de sacrificar o animal, use um bisturi para dissecar um bloco de tecido contendo as cavidades nasais, os nervos olfatórios e os bulbos olfatórios. Faça a primeira incisão perto da narina esquerda e mova a lâmina para frente, cortando ao longo do nervo olfatório esquerdo e do bulbo até a borda telencéleco-diencefálica.

Repita da mesma forma no lado direito. Em seguida, isole a preparação do resto do sistema nervoso fazendo um corte final posterior ao telencéfalo. Prenda o bloco de tecido novamente inserindo duas agulhas entre os nervos olfatórios.

Em seguida, coloque uma gota da solução Frog Ringer no lenço de papel. Banhar a preparação em solução de Ringer evitará que os tecidos cerebrais entrem em colapso após a dissecção. Depois disso, remova as meninges que cobrem a zona de classificação do axônio e os bulbos olfatórios fazendo três incisões.

Começando pela borda posterior do bloco de tecido, corte caudorosralmente ao longo do bulbo olfatório esquerdo até o ponto de entrada dos nervos olfatórios nos bulbos. Repita este procedimento para o hemisfério direito. Em seguida, eleve as meninges com uma pinça e faça o terceiro corte perpendicular aos anteriores na zona de classificação do axônio.

Depois disso, transfira a amostra para uma câmara de gravação cheia de Frog Ringer para processamento e imagem adicionais. Certifique-se de que o lado ventral esteja voltado para cima e prenda a amostra com uma rede de fibras de náilon estendida sobre uma pequena estrutura de platina. Para uma aplicação mais fácil dos estímulos, coloque as cavidades nasais em cima de uma das fibras de nylon.

Neste procedimento, encha a micropipeta com 10 microlitros da solução e remova as bolhas de ar sacudindo a micropipeta. Em seguida, monte a micropipeta em um porta-pipeta. Certifique-se de que a pressão pode ser aplicada manualmente com uma seringa ou um dispositivo pneumático de ejeção de drogas e monitore a pressão aplicada com um manômetro.

Em seguida, abaixe a pipeta sobre a superfície do bulbo olfatório com a ponta apontando para a direção rostral da preparação. Aplique uma pressão positiva pequena e constante na micropipeta para evitar o entupimento da pipeta. Insira suavemente a micropipeta no tecido e aplique uma pressão positiva.

Confirme o fluxo de saída da pipeta observando pequenos movimentos de tecido visíveis sob iluminação de luz forte quando a pressão é aplicada. Após 10 minutos de carregamento, reduza a pressão aplicada a zero e verifique a coloração. O tamanho da área corada varia significativamente e depende de vários parâmetros, como a quantidade de corante injetado e a localização do local de ejeção.

Uma boa coloração cobre uma área de cerca de 100 micrômetros por 100 micrômetros. Monitore a carga progressiva de corante da somata de células mitrais ao longo do tempo durante o carregamento do bolus. Se a intensidade da coloração ou o número de células mitrais coradas não aumentarem, verifique se a pipeta está entupida e substitua-a, se necessário.

Nesta etapa, monitore a temperatura da campainha resfriada inserindo a sonda do termômetro limpa no tubo. Espere até que a temperatura caia abaixo de um grau Celsius antes de iniciar o experimento. Em seguida, use um aplicador de funil permitindo a entrega do estímulo concomitantemente à campainha perfusora, para que o fluxo de água na câmara permaneça constante e ininterrupto durante a liberação da solução de estímulo.

Em seguida, posicione o funil de forma que a saída distal fique a menos de um milímetro do epitélio olfatório. Em seguida, coloque um sensor de temperatura de nicrômio conectado a um termômetro digital próximo ao epitélio e à saída do aplicador do funil. Conecte a porta de saída do termômetro a um computador para registrar e exibir visualmente voltage mudanças refletindo pequenas flutuações de temperatura.

Em seguida, inicie a aquisição da imagem e aplique sequencialmente 200 a 400 microlitros de Ringer frio, L-histidina e Ringer em temperatura ambiente por meio de uma pipeta eletrônica com intervalo interestímulo de 20 a 30 segundos. Para melhor controle da aplicação do estímulo, libere o estímulo com um sinal de disparo enviado pela configuração de imagem escolhida para a pipeta, se possível. Neste procedimento, carregue os dados brutos adquiridos como uma variável para a área de trabalho do usuário do MATLAB, organizados como uma matriz x, y, z, t, com x e y referentes às dimensões laterais, z, a direção axial, e t, o curso do tempo.

Em seguida, chame a ACI na linha de comando do MATLAB. Na interface do usuário, selecione Preparar dados e, em seguida, selecione a variável que contém os dados e um diretório no qual os resultados serão salvos. Percorra as camadas z medidas movendo o controle deslizante correspondente na interface do usuário para obter uma visão geral do mapa de variação exibido.

Depois disso, insira o tamanho do ROI na interface do usuário. Para um soma de células mitrais, ajuste a ROI para abranger aproximadamente 10 micrômetros na direção lateral e cinco micrômetros na direção axial. Para um glomérulo, os valores ligeiramente mais altos de 20 micrômetros lateralmente e 10 micrômetros axialmente são apropriados. Em seguida, selecione uma ROI contendo o glomérulo gama e regiões adicionais para cada soma visível das células mitrais circundantes clicando com o botão do meio do mouse no centro da célula ou glomérulo.

Depois, feche a interface do usuário principal, que aciona o cálculo de mapas de correlação para todos os rastreamentos de referência. O resultado é salvo e exibido automaticamente. Esta imagem mostra que os axônios das ORNs que terminam no pequeno aglomerado foram corados por eletroporação com um corante não sensível ao cálcio, Alexa 647 Dextran.

A linha pontilhada delineia o glomérulo gama. Aqui é mostrada uma imagem da mesma região no segundo canal de medição após o carregamento em bolus com um corante sensível ao cálcio, Fluo-8 AM. Algumas somatas de células mitrais eram visíveis, mas o contraste era limitado. Dois traços de resposta foram plotados para imagens de correlação de atividade, barras azuis, vermelhas e pretas abaixo dos traços representam o início da aplicação de Ringer frio, histidina a 10 micromolares e Ringer à temperatura ambiente como controle negativo, respectivamente.

O resultado do ACI do traço nas áreas destacadas que respondem predominantemente à Ringer fria é mostrado aqui. E aqui está o resultado do ACI do traço nas áreas destacadas que respondem predominantemente à histidina. Esta imagem mostra a sobreposição dos dois mapas da ACI.

As células mitrais que respondem à histidina e ao glomérulo inervado eram facilmente distinguíveis das células mitrais termossensíveis no glomérulo gama. Este procedimento pode ser realizado para investigar se a termossensibilidade e a quimiossensibilidade estão em redes neuronais ocultas e sobrepostas do bulbo olfatório. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar o processamento de temperatura no bulbo olfatório usando eletroporação celular em animais vivos, carregamento de bolus e imagem de correlação de atividade, também chamada de ACI.

O carregamento de bolus e o ACI são ferramentas poderosas para observar e comparar a atividade e a conectividade de dezenas de neurônios em 3D, o que os torna prontamente aplicáveis a diferentes regiões cerebrais e redes neuronais.