Name: Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de Xenopus laevis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a registrar mudanças de cálcio em neurônios do bulbo olfatório de Xenopus laevis em resposta a quedas de temperatura. Este método utiliza marcação diferencial e imagem de cálcio para estudar processamento sensorial.

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Este projeto foi financiado pelo DFG Excellence Cluster 171, pelo Centro de Microscopia em Nanoescala e Fisiologia Molecular do Cérebro, pelo Centro Bernstein de Neurociência Computacional e pela ENC-Network, um Programa de Doutorado Conjunto Erasmus Mundus. Os autores agradecem a Stephan Junek, Mihai Alevra e Guobin Bao por fornecerem códigos MATLAB e programas personalizados para avaliação de imagens e análise de dados.

<ol><li>Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+neurons+respond+to+cool+ambient+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures.</a> Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).</li>
<li>Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Grueneberg+ganglion+neurons+share+molecular+and+functional+features+with+C.+elegans+amphid+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons.</a> Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).</li>
<li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li>
<li>Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+correlation+imaging%3A+visualizing+function+and+structure+of+neuronal+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations.</a> Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis%22">Normal Table of Xenopus laevis</a>. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).</li>
<li>Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-controlled+device+for+the+application+of+odors+to+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrophysiol+Tec%22%5BJournal%5D)">A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals.</a> J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).</li>
<li>Bao, G., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Accurate+Fitting+and+Filtering+of+Noisy+Exponentials+in+Legendre+Space%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSONE%22%5BJournal%5D)">Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space.</a> PLoSONE. 9 (3), (2014).</li>
<li>Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+cytoskeletal+elements+in+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical Calcium Indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Salome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+using+acousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+imaging+for+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet imaging for systems neuroscience.</a> Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).</li>
<li>Hjorth, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+silent+cells%2C+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os métodos aqui apresentados visam processamento de registro da temperatura no bulbo olfativo de Xenopus laevis girinos. As manchas de protocolo primeiras e segundas neurônios ordem no bulbo olfativo e proporciona uma preparação de amostras em que o sistema olfativo permanece essencialmente intacto. Assim, a activação do glomérulo-γ sensível à temperatura pode ser monitorizada e comparada com os seus vizinhos glomérulos sensível à quimioterapia. A inervação bilateral única deste glomérulo é visualizado por eletroporação celular com espectralmente diferentes corantes. Além disso, permite o carregamento de bolus para a coloração das células mitrais que abrangem uma grande volume no interior do bolbo olfactivo. Os sinais induzida pela temperatura de processamento de rede neuronal é revelado, tomando as medidas de cálcio com aplicações de estímulo repetidas e, posteriormente, analisar os dados com imagens de correlação atividade. O protocolo destaca dois sofisticada proce coloração<html> mentos, ambos os quais requerem a manipulação e a prática cautelosa, de modo a conseguir resultados satisfatórios e reprodutíveis. Durante a eletroporação qualquer ferimento dos animais tem de ser evitada, especialmente quando o posicionamento dos eletrodos nas narinas. Idealmente, nenhum contato com o epitélio olfativo deve ocorrer. Note-se que os animais ainda estão vivos após o procedimento de electroporação e o seu tempo de recuperação deve ser tida em conta. Se a coloração permanece muito fraco após um ciclo de electroporação, o que pode acontecer, dependendo dos tipos de corantes utilizados, a sua intensidade pode ser aumentada através do aumento da concentração do corante nas narinas. Uma vez que as moléculas acoplado-dextrano são transportadas através de vários mecanismos incluindo transporte axonal lenta (a uma velocidade de 1-2 mm / dia 10) e difusão passiva, uma outra alternativa é de esperar 48 horas após a electroporação antes de sacrificar os animais. Alternativamente, a electroporação pode ser repetido ao fim de um dia de recuperação. jove_content &quot;&gt; Bolus de carregamento é um passo crítico desde que a quantidade de corante entrar nas células mitral é difícil de regular e depende de vários parâmetros como o tamanho da ponteira e a localização da aplicação. Acompanhamento do processo sob um microscópio de fluorescência confocal prova ser útil para ajustar a duração de aplicação de corante e, assim, a geração de resultados de coloração semelhantes em preparações. para além disso, os girinos anteriormente electroporadas deve ser utilizado para determinar a melhor posição para a aplicação do corante através da identificação da posição do pequeno aglomerado (que compreende o γ-glomérulo). o mais passo crítico durante as medições consiste em evitar tanto deslocamento e de branqueamento da amostra. o deslocamento pode ser evitada posicionando cuidadosamente o fluxo de Ringer sob o microscópio. Tal como para limitar o branqueamento da área de interesse, o tempo de medição deve ser reduzida ao essencial . Bolus de carga coloração com corantes sensíveis ao cálcio fornece apenas muitocontraste limitado, já que as células saudáveis ​​geralmente têm baixos níveis de cálcio e, assim, mostrar fraca fluorescência basal. Aplicando imagem correlação atividade contorna essa limitação através da geração de contraste com base em estruturas de actividade e realces com sinais de cálcio semelhantes. Este método de análise pós-aquisição calcula o factor de correlação entre o sinal de cálcio de uma região de interesse seleccionada (traço de referência) e de que de cada pixel individual do volume 3D. Portanto, os resultados obtidos dependem fortemente o padrão de actividade seleccionada como traço de referência. Se o foco principal é a visualizar os padrões de inervação células mitrais, um sinal de referência derivado de uma actividade neuronal espontânea é o preferido, e a escolha das células mitrais mais activos produzirá os melhores resultados. Para revelar as redes quimio ou termossensíveis de células mitral, os traços de referência contendo apenas respostas a qualquer histidina ou Ringer frio deve ser selecionada. A selecção da totalidade de um glomérulo ór soma célula mitral como a região de interesse nem sempre pode fornecer um traço de referência clara, especialmente se as estruturas que respondem aos dois estímulos diferentes são deitado em cima uns dos outros. Em tal caso, é muitas vezes útil para seleccionar uma área menor do glomérulo ou corpo celular como a região de interesse. Nas últimas décadas, electroporação tem sido descrito como um método eficiente para corar células únicas ou múltiplas 11,12. Aqui ele é usado para rotular especificamente neurônios receptores olfativos. Moléculas de dextrano conjugado dar a maior eficiência, e para corantes não sensíveis ao cálcio, o intervalo de selecção é amplo e cobre o espectro completo tipicamente usado em microscopia de fluorescência 13. No entanto, corantes sensíveis ao cálcio que são electroporadas com sucesso em neurônios receptores olfativos estão no momento limitado a dextrano de cálcio-verde, e Fluo-4 dextrano se ainda disponível no mercado. Além disso, as gravações alvo principalmente superficial camadas na superfície ventral de apenas o bulbo olfativo, uma vez que a profundidade de penetração de técnicas de medição rápida é limitado. imagens de dois fótons podem, em parte, superar essa limitação, mas muitas vezes não tem velocidade e restringe a quantidade de corantes sensíveis ao cálcio selecionáveis ​​ainda mais. Descrevemos aqui um protocolo para medir a actividade induzida pela temperatura no bolbo olfactivo. O neurópilo cérebro é explorado como um volume tridimensional para visualizar as redes celulares complexas envolvidas no processamento olfativo da temperatura. Medindo a actividade induzida pela temperatura no bolbo olfactivo foi muito recentemente relatado 5 e requer um processo especialmente personalizado combinação de técnicas diferentes. Um trunfo importante das técnicas apresentadas acima é que centenas de células são fotografadas em três dimensões em uma preparação em que a maior parte do sistema olfactivo permanece intacta. Estas vantagens colocar elevadas exigências sobre as técnicas de coloração, bem como o cérebro preparação e de imagem. Por exemplo, a electroporação de células e de ataque em bolus atingido grandes quantidades de células no epitélio olfactivo e do bulbo, e, assim, permitir a visualização de redes celulares completos. Além disso, a entrega de indicadores químicos por meio de ataque em bolus em vez de fluoróforos geneticamente codificados permite medições em um conjunto de espécies potencialmente maior. Outras alternativas, como a incubação de banho com corantes AM trabalhar principalmente em fatias que danificam o bulbo olfativo severamente, deixando apenas algumas centenas de micrômetros de tecido intacto. Em comparação, toda a preparação montagem utilizado em nosso protocolo garante, por exemplo, que a inervação bilateral da γ-glomérulo permanece intacto e as gravações são, assim, tomado em um sistema ainda operatório. Finalmente, a própria imagem é feito por microscopia de linha-de iluminação que permite a aquisição de volumes 3D. Microscopia Line-iluminação é uma das técnicas confocal proporcionando as mais altas taxas de aquisição possíveis 6 &lt;/ Sup&gt;, que são necessários para cobrir uma grande fração do bulbo olfativo. sistemas de aquisição mais lentos podem ser utilizados, mas tem a desvantagem de que o tamanho do volume gravado deve ser reduzida. Nos últimos anos, outros métodos para a aquisição de imagem rápida têm sido desenvolvidos e podem ser utilizados como alternativas 14,15. No entanto, microscopia line-iluminação continua sendo um dos métodos mais fáceis para ganhar velocidade e resolução suficiente. Aqui seguem algumas informações como diretrizes para selecionar configurações de imagem adequados. Desde imagem de cálcio é feito dentro das preparações cerebrais grossas, a instalação deve fornecer confocalidade decente e os objetivos devem ter aberturas numéricas de 1,0 ou superior. Para um ponto de referência, as gravações feitas com o microscópio linha de iluminação correspondem a imagens tiradas com um microscópio de varredura a laser padrão com um tamanho de pinhole de 0,5-1 unidades arejados. A velocidade rápida aquisição é desejável. Um volume com uma espessura de 20 um coberto por, pelo menos, 5 lAyers, um campo lateral de visão de 100 mm x 100 mm e um tamanho de pixel de 0,5 mm ou menores devem ser verificados a uma velocidade mínima de 1 Hz por pilha. A redução do confocalidade pode aumentar a quantidade de fotões contados e, assim, permite a aquisição mais rápidos se for necessário, mas tem o inconveniente de gravação de mais luz para fora de foco. No entanto, uma vez que uma tal abordagem aumenta a espessura das fatias ópticos, que podem, na verdade, facilitar o rastreio dos dendritos através de diferentes z-planos após a aplicação de ACI 6. As ferramentas necessárias para estudar extensivamente processamento de temperatura em redes bulbo olfativo são aqui apresentados. atividade induzida pela temperatura devem ser registados nos primeiros e segundo neurônios de ordem via corantes e ambos os sinais que chegam e partem do γ-glomérulo sensível ao cálcio. Além disso, na medida em que as células individuais mitral processar tanto informações químicas e de temperatura podem ser avaliadas. Desde o lea preparaçãova-se o bolbo olfactivo intacta, o papel da inervação bilateral no processamento olfactivo podem ser mais bem estudadas. O processo também é útil para revelar se e como termo-chemoinformation e é codificado em sobreposição redes olfactivos 5. Finalmente, as técnicas acima mencionadas não estão limitados ao estudo das respostas de temperatura no bolbo olfactivo, mas pode ser aplicado para uma avaliação mais geral do sistema olfactivo, em especial as redes celulares de processamento de grandes volumes de três dimensões. Ataque em bolus e imagem correlação atividade são ferramentas poderosas para observar e comparar a atividade de dezenas de neurônios, tornando-as aplicáveis ​​a diferentes redes cerebrais 16.

Nos últimos anos, a sensibilidade à temperatura não tem mais sido descrita apenas como um sentido somestésico, mas também como uma função fisiológica relevante para o sistema olfativo. Em roedores, o bulbo olfatório principal recebe informações do gânglio de Grueneberg (GG), um órgão da cavidade nasal, composto por neurônios termossensíveis. Os neurônios GG respondem a temperaturas frias1 bem como a estímulos químicos, e sua quimiossensibilidade é modulada por flutuações de temperatura2. Essas observações sugerem que o bulbo olfatório pode integrar informações químicas e de temperatura coletadas no nariz. A fim de explorar essa hipótese, apresentamos aqui um conjunto de experimentos que permitem a detecção de respostas de temperatura no bulbo olfatório de animais não transgênicos, usando a larva de Xenopus laevis como modelo. A organização do sistema olfativo nesses animais se assemelha muito à dos mamíferos. Os neurônios receptores olfativos do X. laevis pré-metamórfico terminam em tufos e fazem contatos sinápticos com os dendritos dos neurônios de segunda ordem, as células mitrais. As fibras pré e pós-sinápticas se misturam e formam estruturas de neurópilo semelhantes a novelos chamadas glomérulos3. As abundantes sinapses da camada glomerular representam o primeiro centro de processamento da informação olfativa. As células mitrais integram ainda mais a entrada sensorial e a transmitem para áreas olfativas superiores.
Desenvolvemos um protocolo que combina eletroporação de neurônios receptores olfatórios (ORNs) com corantes sensíveis e não sensíveis ao cálcio, seguido de carregamento em bolus da rede pós-sináptica de glomérulos e células mitrais. A coloração por eletroporação de dois corantes espectralmente distintos carregados nas cavidades nasais serve para destacar o γ-glomérulo3 por meio de sua inervação bilateral por ORNs de ambos os epitélios olfatórios. Assim, a localização do γ-glomérulo é identificada antes de novas medições. Posteriormente, o carregamento em bolus4 com Fluo-8 acetoximetil (Fluo-8 AM) é realizado em um volume que compreende o γ-glomérulo. A imagem das alterações de cálcio com microscopia confocal rápida permite a visualização das respostas de temperatura no neurópilo 3D ao redor do γ-glomérulo, um glomérulo sensível à temperatura único neste sistema5. As células mitrais que inervam essa estrutura específica também podem ser identificadas por seus sinais de Ca2+ responsivos a quedas de temperatura induzidas. Em seguida, a imagem de correlação de atividade6 usa os traços específicos de Ca2+ dessas células para revelar a morfologia dendrítica das células mitrais termossensíveis. Aplicações repetidas alternadas de solução de Ringer fria e odores químicos em uma medição podem ser usadas para visualizar as redes de células mitrais para processamento de odor e temperatura ao redor do γ-glomérulo e identificar possíveis sobreposições. Para atribuir inequivocamente as respostas ao estímulo químico ou de temperatura, monitoramos constantemente a temperatura no epitélio olfatório.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte>Cloreto de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sódio</td><td>Merck Millipore</td><td>1064040500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck Millipore</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>1023820250</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>1058330250</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>Merck Millipore</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Millipore</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>Cálcio Verde 10 kDa Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22914</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>TEFlabs</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>MK571</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>340-021-M005</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Ácido plurônico F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>pó</td></tr><tr><td>L-Histidina monocloridrato monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck Millipore</td><td>1029522500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electronic pipeta</td><td>BrandTech</td><td>HandyStep Pipeta</td><td></td>de repetição eletrônica</tr><tr><td>NiCr-Ni termopar</td><td>Greisinger Elektronik</td><td>GTF 300</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>Modelo PC-10</td><td>Extrator de duas etapas</td></tr><tr><td>Aplicador de funil</td><td>(Feito sob medida)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de iluminação de linha</td><td>(Feito sob medida)</td><td></td><td>caso contrário, um microscópio de disco giratório disponível comercialmente</td></tr><tr><td>Objetiva W Plan-Apocromata 63X/1.0&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441470-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva W Plano-Apocromático 40X/1.0 DIC</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>de R2010b para cima</td></tr></tbody></table>

gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; xenopus laevis</em

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

O sistema olfativo, especializado na detecção, integração e processamento de moléculas químicas, é provavelmente o sistema sensorial mais estudado. No entanto, há evidências crescentes de que o olfato não se limita apenas à sensibilidade química, mas também inclui a sensibilidade à temperatura. Xenopus laevis pré-metamórficos são animais translúcidos, com cavidades nasais salientes privadas da placa cribriforme que separa o nariz e o bulbo olfatório. Essas características os tornam adequados para estudar o olfato e, particularmente, a termossensibilidade. O presente artigo descreve o procedimento completo para medir as respostas de temperatura no bulbo olfatório de larvas de X. laevis. Em primeiro lugar, a eletroporação de neurônios receptores olfatórios (ORNs) é realizada com corantes espectralmente distintos carregados nas cavidades nasais, a fim de corar seus terminais axônicos no neurópilo bulbar. A coloração diferencial entre os neurônios receptores esquerdo e direito serve para identificar o γ-glomérulo como a única estrutura inervada por aferentes pré-sinápticos contralaterais. Em segundo lugar, a eletroporação é combinada com a carga focal do bolo no bulbo olfatório para corar as células mitrais e seus dendritos. O volume cerebral 3D é então escaneado sob microscopia de iluminação de linha para a aquisição de dados rápidos de imagem de cálcio, enquanto pequenas quedas de temperatura são induzidas no epitélio olfatório. Por fim, a análise pós-aquisição permite a reconstrução morfológica da rede termossensível que compreende o γ-glomérulo e suas células mitrais inervantes, com base em traços específicos de Ca2+ induzidos pela temperatura. O uso de odores químicos como estímulos, além de saltos de temperatura, permite a comparação entre redes termossensíveis e quimiossensíveis no bulbo olfatório.

A eletroporação de neurônios receptores olfativos (ORNs) foi alcançada com corantes Alexa Fluor ou indicadores de cálcio conjugadas com moléculas de dextrano para a rotulagem anterógrada via transporte axonal ativa. Enquanto a primeira corantes fornecer coloração brilhante dos neurónios sensoriais e os seus terminais de axónios de ramificação na camada glomerular do bolbo, este último permite a medição da actividade neuronal nestas células (Figuras 1 e 2). Em primeiro lugar, a posição do glomérulo-γ termossensível e o seu padrão de inervação foi visualizado por electroporating Alexa Fluor 647 Dextrano e Alexa Fluor 546 Dextrano no epitélio olfactivo esquerda e direita, respectivamente (Figura 1A). Vinte e quatro horas após o procedimento, os ORNs nas narinas, os dois nervos olfativos e glomérulos em ambos os hemisférios eram visíveis sob microscopia fluorescente. Os aglomerados foram glomerulares diferentes identifiavel por suas respectivas posições, nomeadamente, o pequeno aglomerado compreendendo o γ-glomérulo (Figura 1B). Um pequeno número de fibras olfactivas contralateral correu através do bulbo olfatório contralateral, atravessou a comissura anterior e encerrou na ipsilateral γ-glomérulo (Figura 2A). A fim de registar as respostas de cálcio das fibras pré-sinápticas da γ-glomérulo, Calcium Green Dextran foi electroporado em ORNs, de acordo com o mesmo procedimento. saltos de temperatura negativo foram induzidas na narina através da libertação controlada de solução de Ringer com gelo (0-1 ° C). Um volume 3D compreendendo o γ-glomérulo foi visualizada sob uma linha-iluminação microscópio confocal rápido. ΔTs de -1 ° C foram suficientes para desencadear respostas frias no γ-glomérulo e seus aferentes, reconhecível como picos reversíveis nas Af / F Ca 2+ traços (Figura 2B &lt;/ strong&gt;, C). Outros passos experimentais foram realizadas para medir a actividade induzida pelo frio nas células mitrais ligados à glomérulo-γ através das suas terminações dendríticas ramificados. Estas fibras e pós-sinápticos do neuropil circundante foram efectivamente corada por carregamento de bolus do corante sensível ao cálcio Fluo-08:00, realizado em alguns dias após a Alexa 647 Dextrano foi electroporado em ORNs (Figura 3A, B). células mitral foram preenchidos com Fluo-08:00, eo epitélio olfativo foi estimulada por duas vezes de acordo com o seguinte paradigma: Ringer frio, histidina (10 mM) e à temperatura ambiente Ringer, aplicado posteriormente. Dois rastreios de referência foram tomadas a partir de regiões de interesse no volume registado, um de responder exclusivamente a temperatura cai, o outro, apenas para histidina. Imaging correlação Atividade (ACI) 6 foi calculado com base na referência selecionadatraça de visualizar com alto contraste a morfologia dendrítica das redes pós-sinápticos que correspondem quer a uma temperatura ou o sinal de histidina-responsivo de Ca2 + (Figura 3C e D). Finalmente, mapas termossensíveis e quimiossensíveis eram codificados por cores e sobreposto em cima uns dos outros, que mostra como a temperatura e a informação química é transportado a partir glomérulos individuais para os neurónios de segunda ordem olfativos (Figura 3E). Para uma descrição da integração e processamento de ambos os tipos de informações em redes olfativas compartilhadas, consulte Kludt et al. 5 <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral da eletroporação ORN e bolus de carga (A) neurônios receptores olfativos em ambas as cavidades nasais de X.. laevis larvas foram electroporadas com corantes Alexa ou Calciucorantes sensíveis ao m acoplados a moléculas de dextrano. Os indicadores fluorescentes foram transportados até a anterogradamente arborização axonal terminal. 24 horas após a electroporação, a camada glomerular em ambos os hemisférios apresentaram coloração fluorescente. (B) Esquema da organização celular do bulbo olfativo em um hemisfério. A camada glomerular abrange a lâmpada em clusters: clusters medial, pequenas, médias e laterais. informação olfativa é transferido dos neurônios receptores para mitral células através de sinapses excitatórias em glomérulos. periglomerular células e as células granulares são neurónios inibidores que modulam o processamento olfactivo e codificação. A γ-glomérulo (ciano) foi facilmente identificada como a pequena neurópilo onde ipsilateral (vermelho) e contralateral fibras olfactivas (laranja) se fundiram. (C) de carga em bolus foi conseguida na vizinhança do glomérulo-γ para corar o neurópilo pós-sináptica que consiste principalmente de células mitrais e os seus dendriárvores tic ramificação consideravelmente na camada glomerular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> Figura 2: Eletroporação de ORNs revela a conectividade estrutural e funcional (A) inervação bilateral do γ-glomérulo por ipsilateral (verde) e neurônios receptores contralateral (vermelho) olfativos (ORNs).. Barra de escala = 50 mm. (B) O bolbo olfactivo após a electroporação com o corante sensível ao cálcio Calcium Green Dextran. O intermedial (IMC), medial (MC) e do pequeno aglomerado (SC) são visíveis. A imagem é uma projeção máxima de 100 volume de medição mm de espessura. Barra de escala = 50 mm. (C) Opinião do Close-up do pequeno cluster. O volume registado (12 uM) estárepresentado de uma projecção máxima. A imagem descreve o nível de fluorescência basal em cinza eo Af codificados por cores mapa / F como uma sobreposição. A máxima resposta à estimulação com solução de Ringer fria é representada graficamente. A γ-glomérulo reagiu fortemente, enquanto os dois glomérulos vizinhos permanecer em silêncio. A inserção mostra o traçado Af / F para o γ-glomérulo correspondente à região indicada de interesse. A barra azul representa a aplicação de estímulo. Barra de escala = 20 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> Figura 3:. Bolus carga e ACI dissociar termossensível e redes quimiossensíveis (A) Os axônios dos ORNs terminam no pequeno aglomerado foram coradas por eletroporação com o não-calcihum corante sensível Alexa 647 dextrano. A linha pontilhada descreve o γ-glomérulo. (B) Imagem da mesma região como em (A) no segundo canal de medição após o carregamento de bolus com o corante sensível ao cálcio Fluo-08:00. Alguns somata célula mitral eram visíveis, mas o contraste era limitado. Seguindo as setas, dois traços de resposta foram representados, os quais foram utilizados para imagiologia de correlação actividade (ACI). Azul, barras vermelhas e pretas abaixo os traços representam o início da aplicação de Ringer frio, histidina (10 mM) e à temperatura ambiente Ringer como controlo negativo, respectivamente. Os dois Ca 2+ vestígios foram tomadas a partir de diferentes regiões de interesse do volume medido. (C) O resultado ACI do traço em (B) destacando as áreas que respondem predominantemente a campainha frio. (D) O resultado ACI do traço em (B) destacando as áreas que respondem predominantemente a histidina. (E) Sobreposição dos dois mapas ACI. células mitral respondendo ao histidine e glomérulo inervado (vermelho) eram facilmente distinguíveis das células mitrais termossensíveis e o γ-glomérulo (ciano). Todas as imagens desta figura são projeções de intensidade máxima de um volume de 28 mm de espessura. Barra de escala = 20 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui descrevemos um protocolo para medir e analisar as respostas de temperatura no bulbo olfatório de Xenopus laevis. Os neurônios receptores olfatórios e as células mitrais são corados diferencialmente, após o que as alterações de cálcio são registradas, refletindo uma sensibilidade de algumas redes neurais no bulbo às quedas de temperatura induzidas no nariz.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

O objetivo geral deste procedimento é registrar as alterações de cálcio em neurônios do bulbo olfatório em resposta a quedas de temperatura induzidas no epitélio nasal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de afecções, como a forma pela qual o bulbo olfatório integra e processa as informações de temperatura obtidas no nariz. Os neurônios de primeira e segunda ordem do bulbo olfatório são diferencialmente corados e os efeitos das flutuações de temperatura no epitélio nasal são medidos por meio de imagem de cálcio.A demonstração visual da eletroporação celular, carregamento em bolo e imagem de correlação de atividade facilitará a implementação dessas técnicas em redes cerebrais além do bulbo olfatório. Para iniciar este procedimento, coloque uma girina sobre uma almofada de gel. Fixe-a posicionando agulhas ao redor, tomando cuidado para não furar a pele com as agulhas.Em seguida, posicione o animal sob o microscópio estereoscópico e foque nas narinas. Depois, coloque um cristal de corante em uma das cavidades nasais e aguarde até que se dissolva completamente, o que deve levar menos de um minuto. Se os cristais forem menores, adicione dois ou três em cada cavidade até que produzam uma solução altamente concentrada e não translúcida.Em seguida, posicione o cátodo sobre a pele da rã-touro e o ânodo em uma das narinas. Aplique seis pulsos de 20 volts e 20 milissegundos com intervalo de estímulo de aproximadamente 0,5 segundos. Para corantes com polaridade diferente, os resultados da coloração podem ser melhorados colocando o cátodo nas narinas.Se houver dúvidas quanto à polaridade do corante, ambos os eletrodos podem ser colocados simultaneamente nas narinas e a polaridade pode ser alternada entre pulsos de tensão únicos. Após sacrificar o animal, use um bisturi para dissecar um bloco de tecido contendo as cavidades nasais, os nervos olfativos e os bulbos olfativos. Faça o primeiro corte próximo à narina esquerda e mova a lâmina para frente, cortando ao longo do nervo e do bulbo olfativo esquerdos até a fronteira telencefálica-diencefálica.Repita da mesma forma no lado direito. Em seguida, isole o preparado do restante do sistema nervoso fazendo um corte final posterior ao telencéfalo. Fixe novamente o bloco de tecido inserindo duas agulhas entre os nervos olfatórios.Em seguida, coloque uma gota de solução de Ringer para rã sobre o tecido. Banhar a preparação na solução de Ringer evitará o colapso dos tecidos cerebrais durante a dissecação. Depois disso, remova as meninges que recobrem a zona de ordenação dos axônios e os bulbos olfatórios realizando três incisões.Partindo da borda posterior do bloco de tecido, corte de forma caudal a rostral, aproximando-se estreitamente do bulbo olfatório esquerdo até o ponto de entrada dos nervos olfatórios nos bulbos. Repita este procedimento para o hemisfério direito. Posteriormente, levante as meninges com pinça e faça o terceiro corte perpendicular aos anteriores na zona de organização dos axônios.Em seguida, transfira a amostra para uma câmara de gravação preenchida com Ringer de rã para processamento e imageamento adicionais. Certifique-se de que o lado ventral esteja voltado para cima e fixe a amostra com uma rede de fibras de náilon estendida sobre uma pequena armação de platina. Para facilitar a aplicação de estímulos, posicione as cavidades nasais sobre uma das fibras de náilon.Neste procedimento, preencha a micropipeta com 10 microlitros da solução e remova as bolhas de ar batendo levemente na micropipeta. Em seguida, fixe a micropipeta em um suporte para pipeta. Certifique-se de que a pressão possa ser aplicada manualmente com uma seringa ou com um dispositivo pneumático de ejeção de fármacos e monitore a pressão aplicada com um manômetro.Em seguida, posicione a pipeta sobre a superfície do bulbo olfatório com a ponta voltada para a direção rostral da preparação. Aplique uma pressão positiva pequena e constante à micropipeta para evitar entupimento da ponta. Insira suavemente a micropipeta no tecido e aplique uma pressão positiva.Confirme a saída do pipeta observando pequenos movimentos nos tecidos visíveis sob iluminação intensa quando a pressão é aplicada. Após 10 minutos de carga, reduza a pressão aplicada a zero e verifique a coloração. O tamanho da área corada varia significativamente e depende de diversos parâmetros, como a quantidade de corante injetado e a localização do local de ejeção.Uma boa coloração cobre uma área de aproximadamente 100 micrômetros por 100 micrômetros. Monitore ao longo do tempo o carregamento progressivo do corante nos somas das células mitrais durante o carregamento em bolus. Se a intensidade da coloração ou o número de células mitrais coradas não aumentar, verifique a pipeta quanto a entupimento e substitua-a, se necessário.Nesta etapa, monitore a temperatura do Ringer resfriado inserindo a sonda limpa do termômetro no tubo. Aguarde até que a temperatura caia abaixo de um grau Celsius antes de iniciar o experimento. Em seguida, utilize um aplicador de funil que permita a administração do estímulo concomitantemente ao Ringer em perfusão, de modo que o fluxo de água na câmara permaneça constante e ininterrupto durante a liberação da solução de estímulo.Em seguida, posicione o funil de forma que a saída distal esteja a menos de um milímetro do epitélio olfativo. Depois, coloque um sensor de temperatura de níquel-cromo conectado a um termômetro digital próximo ao epitélio e à saída do aplicador de funil. Conecte a porta de saída do termômetro a um computador para registrar e exibir visualmente as variações de voltagem que refletem pequenas flutuações de temperatura.Após isso, inicie a aquisição de imagens e aplique sequencialmente de 200 a 400 microlitros de Ringer frio, L-histidina e Ringer em temperatura ambiente por meio de uma pipeta eletrônica com um intervalo interestímulo de 20 a 30 segundos. Para melhor controle da aplicação do estímulo, libere o estímulo com um sinal de gatilho enviado pela configuração de imagem escolhida para a pipeta, se possível. Neste procedimento, carregue os dados brutos adquiridos como uma variável no espaço de trabalho do usuário do MATLAB, organizados como uma matriz x, y, z, t, em que x e y referem-se às dimensões laterais, z à direção axial e t ao curso temporal.Em seguida, chame o ACI a partir da linha de comando do MATLAB. Na interface, selecione Preparar Dados, depois selecione a variável que contém os dados e um diretório no qual os resultados serão salvos. Percorra as camadas z medidas movendo o controle deslizante correspondente na interface para obter uma visão geral do mapa de variância exibido.Em seguida, insira o tamanho da ROI na interface do usuário. Para o soma de uma célula mitral, ajuste a ROI para abranger aproximadamente 10 micrômetros na direção lateral e cinco micrômetros na direção axial. Para um glomérulo, são apropriados valores ligeiramente superiores de 20 micrômetros na direção lateral e 10 micrômetros na direção axial. Depois, selecione uma ROI contendo o glomérulo gama e regiões adicionais para cada soma visível das células mitrais circundantes, clicando com o botão do meio do mouse no centro da célula ou do glomérulo.Em seguida, feche a interface principal, o que aciona o cálculo dos mapas de correlação para todos os traços de referência. O resultado é automaticamente salvo e exibido. Esta imagem mostra que os axônios das ORNs que terminam no pequeno agrupamento foram corados por eletroporação com um corante não sensível ao cálcio, Alexa 647 Dextran.A linha tracejada delimita o glomérulo gama. É mostrada aqui uma imagem da mesma região no segundo canal de medição após carga com um corante sensível ao cálcio, Fluo-8 AM. Alguns somas de células mitrais eram visíveis, mas o contraste era limitado. Duas curvas de resposta foram traçadas para a imagem de correlação de atividade; barras azul, vermelha e preta abaixo das curvas representam o início da aplicação de Ringer frio, histidina a 10 micromolar e Ringer em temperatura ambiente como controle negativo, respectivamente.O resultado do ICA do traçado nas áreas destacadas que respondem predominantemente ao Ringer frio é mostrado aqui. E aqui está o resultado do ICA do traçado nas áreas destacadas que respondem predominantemente à histidina. Esta imagem mostra a sobreposição dos dois mapas de ICA.As células mitrais que respondem à histidina e ao glomérulo inervado foram facilmente distinguíveis das células mitrais termossensíveis no glomérulo gama. Este procedimento pode ser realizado para investigar se a termossensibilidade e a quimiossensibilidade estão presentes em redes neuronais sobrepostas e ocultas do bulbo olfatório. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar o processamento de temperatura no bulbo olfatório utilizando eletroporação celular em animais vivos, carregamento em bolus e imagem de correlação de atividade, também chamada de ACI.A administração em bólus e a ACI são ferramentas poderosas para observar e comparar a atividade e conectividade de dezenas de neurônios em 3D, o que as torna facilmente aplicáveis a diferentes regiões cerebrais e redes neuronais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61481/quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-and-their-downstream-effects-in-primary-mouse-midbrain-neurons'&gt;Bancroft, E. A., et al. Quantificando o estilo Ca = '-webkit-text-decoration-skip: none; font-family: Arial, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration-skip-ink: none; vertical-align: baseline; espaço em branco: pré-encapsulamento; '&gt; 2 + &lt; span...

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Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso em vivo. Descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas em condições normais de criação ou após lesão.

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Aprenda a registrar mudanças de cálcio em neurônios do bulbo olfatório de Xenopus laevis em resposta a quedas de temperatura. Este método utiliza marcação diferencial e imagem de cálcio para estudar processamento sensorial.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de Xenopus laevis (Vídeo) | JoVE Journal

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de

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