Name: Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a isolar linfócitos do intestino delgado murino para análise por citometria de fluxo. Este método rápido e reprodutível facilita estudos em imunologia mucosa e na relação entre microbiota e sistema imune intestinal.

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Todos os estudos foram conduzidos em análise rigorosa e orientações de acordo com a Comissão dos Assuntos Institucionais animal Cuidado e Uso (IACUC) da Harvard Medical School, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela Associação Americana de Ciência Animal Laboratory (AALAS). 1. Horizontal transmissão de bactérias via co-habitação (Opcional) <ol><li> Para minimizar a contaminação exógena (especialmente se estiver usando camundongos gnotobióticos), praticar uma técnica asséptica durante a montagem gaiolas descartáveis ​​estéreis, utilizando alimentos e água que ambos foram autoclavados. </li><li> Use socos de ouvido ou tags para marcar individualmente 6 semanas de idade C57BL / 6 ratos que abrigam diferentes microbiotas e abrigá-los na mesma gaiola. Dado que os ratos são coprofagia e comer a partir de peletes fecais do chão da gaiola, micróbios irá, naturalmente, ser transmitida horizontalmente entre os ratinhos. </li><li> camundongos co-casa para ≥1 semana para dar tempo para a transferência de microrganismos e mudança imunológica antes da análise. </li></ol&gt; 2. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da camada intra-epitelial do intestino delgado e Lâmina Própria <ol><li> Preparação de Soluções <ol><li> Prepare meios de extracção (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93% 5 ul de ditiotreitol (DTT) (v / W) + 60 ul de EDTA 0,5 M + 500 uL de soro fetal de bovino (FBS). Adicione o DTT imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare a mídia de digestão (por intestino delgado): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de colagenase II + 300 ml FBS. Adicione o dispase e colagenase imediatamente antes da utilização. </li><li> Para todas as incubações realizadas a 37 ° C, soluções Pré-aquecer a 37 ° C. </li></ol></li><li> Euthanize o mouse por asfixia com CO2, seguido por deslocamento cervical. </li><li> Coloque o lado o rato dorsal para baixo e pulverizar o abdômen com etanol 70%. Use a tesoura para realizar uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e fáscia então peritoneal ao longo da linha média ventral from da sínfise púbica até o processo xifóide, expondo a cavidade peritoneal. </li><li> Utilize uma tesoura para separar o intestino delgado a partir do estômago, ao seccionar o esfíncter pilórico. Remova cuidadosamente o intestino delgado do peritônio, provocando afastado a gordura mesentérica. <ol><li> Para remover completamente o intestino delgado, fazer um segundo corte na junção íleo-cecal. Colocar o intestino delgado isolado em frio (isto é., 4 ° C) RPMI contendo 10% de FBS para maximizar a viabilidade celular. </li></ol></li><li> Gentilmente remover grandes pedaços de gordura usando uma pinça curva. Tenha cuidado para evitar rasgar o próprio tecido intestinal durante a tentativa de remover a gordura. </li><li> Para remover conteúdo intestinal, intestino delicadamente lave com 15 - 20 ml de PBS frio utilizando uma agulha de alimentação 18 G aposta em uma seringa. </li><li> Use a tesoura para extirpar PPs, e colocá-los em RPMI frio contendo 5% de FBS. PPs estão localizados no lado antimesentérica do intestino delgado e aparecem como um branco multi-lobuladamassa. Dependendo da estirpe específica, um rato tem tipicamente 8 - 12 PPs. </li><li> Cortar o intestino delgado em 3 - 4 segmentos polegadas. </li><li> Remover a gordura residual rolando cada segmento do intestino delgado em uma toalha de papel umedecido com RPMI, utilizando um bisturi maçante para provocar a gordura para fora do tecido. </li><li> Rodar o tecido de dentro para fora através da canulação os segmentos intestinais com pinças curvas e agarrar a extremidade distai do tecido. Em seguida, usar um par de pinças consecutivas para remover suavemente o segmento de tecido a partir das pinças curvas (com início na extremidade proximal), resultando no tecido a ser invertido. </li><li> Coloque segmentos de tecido em um copo contendo 30 ml de meio de extracção e uma barra de agitação. Fixar a tampa no copo, e agitar a 500 rpm durante 15 min a 37 ° C; agitação deve ser vigorosa, mas não turbulento. </li><li> Após a incubação, usar um filtro de aço para separar pedaços de tecido a partir do sobrenadante contendo o epitélio, que deve aparecer turva. Este sobrenadante contém intraepithelial linfócitos que pode ser ainda mais analisados, se desejado, ao proceder à filtração da amostra nos passos 2.18 - 2.23. </li><li> agitar manualmente as peças de tecidos em meio RPMI para lavar meios de extracção residuais. </li><li> Coloque o tecido sobre uma toalha de papel seco e lançá-lo sobre a extremidade final várias vezes para facilitar a remoção de muco residuais que não foi libertada por meio de extracção. </li><li> Coloque fragmentos de tecido em um tubo de 1,5 mL com 600 uL de meio de digestão. </li><li> Use a tesoura para picar o tecido até peças não ficar com a tesoura e a solução aparece homogênea. Este passo é crítico para assegurar uma digestão enzimática completa do tecido. </li><li> Adicionar o intestino delgado triturada para um copo contendo 25 ml de meio de digestão. Agita-se a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. No meio da digestão (ie., A 15 min), pipeta cima e para baixo com uma pipeta sorológica para ajudar a quebrar qualquer grandes pedaços de tecido. </li><li> Filtro de tecido digerido (ou epithcamada Elial a partir do passo 2.12, se IELs processamento) através de um filtro de células 100 mm em um tubo de 50 ml. Lavar o filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar a solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Filtrar células ressuspensas através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Lavar filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS. </li></ol> 3. Preparação de uma suspensão de células individuais de placas de Peyer <ol><li> Transferência excisadas PPs a um copo com 25 ml de meio de digestão e uma barra de agitação. Seguro tampa, e centrifugação a 500 rpm durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Filtrar PPs digerido através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Se qualquer rema aglomeradosem, pressioná-los através do filtro utilizando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de 1 ml. </li><li> Lavar filtro com 10 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS. </li></ol> 4. manchas na superfície de Citometria de Fluxo <ol><li> Aliquota volume apropriado de células (por ex., A 200 ul de LPLs) numa placa de fundo redondo de 96 poços. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 90 jil de meio RPMI contendo FBS a 2% e uma diluição 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloco Fc). Incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante atravésinvertendo a placa. </li><li> células Mancha (opcional) com corante de viabilidade, se desejado, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul 1% de formalina para fixar as células. Incubar durante 1 hora no escuro a 4 ° C. </li><li> Adicionar 200 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de PBS. Analise as células utilizando um citómetro de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos pequenos-intestinal, incluindo a LPLs, IELs e linfócitos no PPs. Para aqueles interessados ​​em avaliar como as mudanças na microbiota afetam o sistema imunológico do intestino delgado, detalhamos os passos simples envolvidos na transmissão horizontal de organismos entre os ratos que abrigam diferentes microbiotas. Embora este protocolo centra-se no intestino delgado, o procedimento é o mesmo para a análise do intestino...

A tarefa principal do intestino delgado é muitas vezes considerada a digestão e absorção de nutrientes 1. Enquanto essa função metabólica é claramente essencial, o intestino delgado tem um papel igualmente importante na defesa do hospedeiro, da barragem contínua de antigénios ambientais encontradas no interior do lúmen 2. O tracto intestinal separa o mundo exterior (por exemplo., Antigénios luminais) a partir do ambiente interno do hospedeiro com uma camada epitelial que é apenas uma única camada de células de espessura. Como tal, o sistema imune do intestino delgado tem a tarefa formidável de equilibrar o seu limiar de reactividade, permitindo antigénios estranhos provenientes dos micróbios dieta e comensais de introduzir a mucosa com mínima, se alguma, resposta imune, enquanto a montagem de uma resposta robusta contra patogénios invasores e outras &quot;prejudiciais&quot; antígenos. Respostas imunes excessiva ou inadequada para esses antígenos pode levar a doença patológica (por exemplo., Inflammadoença tory intestino, diabetes tipo I, esclerose múltipla) e deve ser evitado 06/03. No geral, o tracto gastrointestinal é pensado para representar a maior órgão imune no corpo, contendo mais de 70% de todas as células secretoras de anticorpos 7. O sistema imunitário do intestino delgado é constituída por 3 compartimentos principais - a lâmina própria (LP), a camada intraepitelial, e placas de Peyer (PP) - que cada um contém um grupo distinto de linfócitos 2. Os linfócitos LP (LPLs) são principalmente as células TCRαβ + T com ~ células 20% de B; linfócitos intra-epiteliais (IELs) contêm células B muito poucos com mais células TCRγδ + T do que as células TCRαβ + T; e PPS, que são órgãos linfóides secundários embutidos no intestino delgado, parede contêm células ~ 80% de B. Embora cada uma destas regiões anatómicas tem funções ligeiramente distintas e bases ontológicas, elas funcionam em AHmoda armonized para proteger o hospedeiro de insultos patogénicos. Além disso, há um crescente apreciação que a microbiota é um determinante crítico para o desenvolvimento do sistema imunitário intestinal, com o aumento do reconhecimento cognato da relação entre os micróbios e a ontogenia específicos de determinadas linhagens celulares 8,9. Além disso, dado que a formação do sistema imune intestinal afeta as respostas imunes em locais anatomicamente distantes (por ex., Artrite, esclerose múltipla, a pneumonia), tornou-se claro que o desenvolvimento do sistema imunitário do intestino é relevante para mais processos de doença do que anteriormente reconhecido 10 -12. Como tal, o interesse em avaliar quantitativamente o sistema imunológico intestinal foi muito além interações patógeno-hospedeiro para incluir agora interações hospedeiro-comensais e patogênese de muitas doenças sistêmicas bem. Tendo em conta a variabilidade dos métodos actuais naisolamento de linfócitos intestinais, um método que é otimizado para a produção, viabilidade e consistência, equilibrando o tempo necessário é cada vez mais crítica. Os protocolos que envolvem gradientes de Percoll são tempo e trabalho intensivo e potencialmente mais propenso a erro humano, levando a um rendimento variável e viabilidade 13. Aqui, nós fornecemos um protocolo optimizado para o isolamento e caracterização de linfócitos a partir de todos os compartimentos 3 imunes no intestino delgado. Além disso, dado o interesse crescente em alterações induzidas pelo micróbio no sistema imune das mucosas, que incluem passos que podem ser utilizados para permitir a transmissão horizontal de microrganismos entre ratos para avaliar como estas alterações afectam quantitativamente o sistema imune do intestino.

<table><tbody><tr><td>Luvas estéreis</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>gaiola de rato estéril</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contém tampa, fundo da gaiola e cama alfa-dri</td></tr><tr><td>Alimentador de metal</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de água</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Porta-cartões</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Roedor autoclavável chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI médio 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>a concentração no protocolo é baseada em um nível de atividade de 1,878 U/mg</td></tr><tr><td>de colagenase, tipo II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>a concentração no protocolo é baseada em um nível de atividade de 245 U/mg</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de alimentação (18 G, 2" de comprimento)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável (15 lâminas)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Pinça reta</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Copos multiusos, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitação</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitação multiposições, 9 posições</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Aço inoxidável cônico Escorador, 3 polegadas&nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Filtro de célula</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços, fundo redondo</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (bloco Fc)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr>(<tr><td>Opcional) Corante de viabilidade fixável eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina, tamponado neutro</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino intestino delgado

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Os intestinos - que contêm o maior número de células imunes de qualquer órgão do corpo - são constantemente expostos a antígenos estranhos, tanto microbiana e dietética. Dado que uma maior compreensão destes antigénios luminais ajudar a dar forma a resposta imune e que a formação de células imunitárias no intestino é crítica para uma série de doenças sistémicas, tem havido um interesse crescente na caracterização do sistema imune do intestino. No entanto, muitos protocolos publicados são árduos e consumidores de tempo. Apresentamos aqui um protocolo simplificado para o isolamento de linfócitos a partir da própria lâmina do intestino delgado, a camada intraepitelial, e placas de Peyer, que é rápido, reprodutível, e não necessita de gradientes de Percoll laboriosos. Embora o protocolo centra-se no intestino delgado, é também adequado para a análise do cólon. Além disso, destacam-se alguns aspectos que podem precisar de otimização adicional, dependendo do ques científica específicação. Esta abordagem resulta no isolamento de um grande número de linfócitos viáveis ​​que podem, subsequentemente, ser utilizadas para a análise de citometria de fluxo ou meio alternativo de caracterização.

Análise citométrica de fluxo de suspensões de células únicas de linfócitos no intestino delgado deve produzir uma população discreta de células que têm características semelhantes dispersão frontal e lateral como esplenócitos (Figuras 1A e 1B). Os linfócitos podem começam a morrer, se o tecido não é mantida a 4 ° C durante as fases iniciais do isolamento, resultando na população de linfócitos com uma dispersão frontal inferior e sendo mais difíceis de separar das outras ...

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar populações de células individuais de diferentes compartimentos intestinais delgados, que posteriormente podem ser utilizadas para análise por citometria de fluxo ou por outro meio de caracterização. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na imunologia da mucosa, como a forma como a microbiota influencia o desenvolvimento do sistema imunológico intestinal. As principais vantagens desta técnica são sua rapidez, reprodutibilidade e o fato de não exigir gradientes laboriosos de percólico.Para iniciar este procedimento, posicione o camundongo com o lado dorsal voltado para baixo e pulverize o abdômen com etanol a 70 por cento; realize uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e, em seguida, a fáscia peritoneal ao longo da linha média ventral, da sínfise púbica até o processo xifoide, expondo assim a cavidade peritoneal. Em seguida, separe o intestino delgado do estômago seccionando o esfíncter pilórico. Remova cuidadosamente o intestino delgado do peritônio e separe a gordura mesentérica.Para remover completamente o intestino delgado, faça um segundo corte na junção ileocecal. Coloque o intestino delgado isolado em meio RPM

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.

Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Aprenda a isolar linfócitos do intestino delgado murino para análise por citometria de fluxo. Este método rápido e reprodutível facilita estudos em imunologia mucosa e na relação entre microbiota e sistema imune intestinal.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

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