Name: Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a isolar linfócitos do intestino delgado murino para análise por citometria de fluxo. Este método rápido e reprodutível facilita estudos em imunologia mucosa e na relação entre microbiota e sistema imune intestinal.

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NKS é apoiado pelo prêmio NIH K08 AI108690.

Todos os estudos foram conduzidos em análise rigorosa e orientações de acordo com a Comissão dos Assuntos Institucionais animal Cuidado e Uso (IACUC) da Harvard Medical School, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela Associação Americana de Ciência Animal Laboratory (AALAS). 1. Horizontal transmissão de bactérias via co-habitação (Opcional) <ol><li> Para minimizar a contaminação exógena (especialmente se estiver usando camundongos gnotobióticos), praticar uma técnica asséptica durante a montagem gaiolas descartáveis ​​estéreis, utilizando alimentos e água que ambos foram autoclavados. </li><li> Use socos de ouvido ou tags para marcar individualmente 6 semanas de idade C57BL / 6 ratos que abrigam diferentes microbiotas e abrigá-los na mesma gaiola. Dado que os ratos são coprofagia e comer a partir de peletes fecais do chão da gaiola, micróbios irá, naturalmente, ser transmitida horizontalmente entre os ratinhos. </li><li> camundongos co-casa para ≥1 semana para dar tempo para a transferência de microrganismos e mudança imunológica antes da análise. </li></ol&gt; 2. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da camada intra-epitelial do intestino delgado e Lâmina Própria <ol><li> Preparação de Soluções <ol><li> Prepare meios de extracção (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93% 5 ul de ditiotreitol (DTT) (v / W) + 60 ul de EDTA 0,5 M + 500 uL de soro fetal de bovino (FBS). Adicione o DTT imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare a mídia de digestão (por intestino delgado): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de colagenase II + 300 ml FBS. Adicione o dispase e colagenase imediatamente antes da utilização. </li><li> Para todas as incubações realizadas a 37 ° C, soluções Pré-aquecer a 37 ° C. </li></ol></li><li> Euthanize o mouse por asfixia com CO2, seguido por deslocamento cervical. </li><li> Coloque o lado o rato dorsal para baixo e pulverizar o abdômen com etanol 70%. Use a tesoura para realizar uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e fáscia então peritoneal ao longo da linha média ventral from da sínfise púbica até o processo xifóide, expondo a cavidade peritoneal. </li><li> Utilize uma tesoura para separar o intestino delgado a partir do estômago, ao seccionar o esfíncter pilórico. Remova cuidadosamente o intestino delgado do peritônio, provocando afastado a gordura mesentérica. <ol><li> Para remover completamente o intestino delgado, fazer um segundo corte na junção íleo-cecal. Colocar o intestino delgado isolado em frio (isto é., 4 ° C) RPMI contendo 10% de FBS para maximizar a viabilidade celular. </li></ol></li><li> Gentilmente remover grandes pedaços de gordura usando uma pinça curva. Tenha cuidado para evitar rasgar o próprio tecido intestinal durante a tentativa de remover a gordura. </li><li> Para remover conteúdo intestinal, intestino delicadamente lave com 15 - 20 ml de PBS frio utilizando uma agulha de alimentação 18 G aposta em uma seringa. </li><li> Use a tesoura para extirpar PPs, e colocá-los em RPMI frio contendo 5% de FBS. PPs estão localizados no lado antimesentérica do intestino delgado e aparecem como um branco multi-lobuladamassa. Dependendo da estirpe específica, um rato tem tipicamente 8 - 12 PPs. </li><li> Cortar o intestino delgado em 3 - 4 segmentos polegadas. </li><li> Remover a gordura residual rolando cada segmento do intestino delgado em uma toalha de papel umedecido com RPMI, utilizando um bisturi maçante para provocar a gordura para fora do tecido. </li><li> Rodar o tecido de dentro para fora através da canulação os segmentos intestinais com pinças curvas e agarrar a extremidade distai do tecido. Em seguida, usar um par de pinças consecutivas para remover suavemente o segmento de tecido a partir das pinças curvas (com início na extremidade proximal), resultando no tecido a ser invertido. </li><li> Coloque segmentos de tecido em um copo contendo 30 ml de meio de extracção e uma barra de agitação. Fixar a tampa no copo, e agitar a 500 rpm durante 15 min a 37 ° C; agitação deve ser vigorosa, mas não turbulento. </li><li> Após a incubação, usar um filtro de aço para separar pedaços de tecido a partir do sobrenadante contendo o epitélio, que deve aparecer turva. Este sobrenadante contém intraepithelial linfócitos que pode ser ainda mais analisados, se desejado, ao proceder à filtração da amostra nos passos 2.18 - 2.23. </li><li> agitar manualmente as peças de tecidos em meio RPMI para lavar meios de extracção residuais. </li><li> Coloque o tecido sobre uma toalha de papel seco e lançá-lo sobre a extremidade final várias vezes para facilitar a remoção de muco residuais que não foi libertada por meio de extracção. </li><li> Coloque fragmentos de tecido em um tubo de 1,5 mL com 600 uL de meio de digestão. </li><li> Use a tesoura para picar o tecido até peças não ficar com a tesoura e a solução aparece homogênea. Este passo é crítico para assegurar uma digestão enzimática completa do tecido. </li><li> Adicionar o intestino delgado triturada para um copo contendo 25 ml de meio de digestão. Agita-se a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. No meio da digestão (ie., A 15 min), pipeta cima e para baixo com uma pipeta sorológica para ajudar a quebrar qualquer grandes pedaços de tecido. </li><li> Filtro de tecido digerido (ou epithcamada Elial a partir do passo 2.12, se IELs processamento) através de um filtro de células 100 mm em um tubo de 50 ml. Lavar o filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar a solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Filtrar células ressuspensas através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Lavar filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS. </li></ol> 3. Preparação de uma suspensão de células individuais de placas de Peyer <ol><li> Transferência excisadas PPs a um copo com 25 ml de meio de digestão e uma barra de agitação. Seguro tampa, e centrifugação a 500 rpm durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Filtrar PPs digerido através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Se qualquer rema aglomeradosem, pressioná-los através do filtro utilizando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de 1 ml. </li><li> Lavar filtro com 10 ml de RPMI contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS. </li></ol> 4. manchas na superfície de Citometria de Fluxo <ol><li> Aliquota volume apropriado de células (por ex., A 200 ul de LPLs) numa placa de fundo redondo de 96 poços. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 90 jil de meio RPMI contendo FBS a 2% e uma diluição 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloco Fc). Incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante atravésinvertendo a placa. </li><li> células Mancha (opcional) com corante de viabilidade, se desejado, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul 1% de formalina para fixar as células. Incubar durante 1 hora no escuro a 4 ° C. </li><li> Adicionar 200 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de PBS. Analise as células utilizando um citómetro de fluxo. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos pequenos-intestinal, incluindo a LPLs, IELs e linfócitos no PPs. Para aqueles interessados ​​em avaliar como as mudanças na microbiota afetam o sistema imunológico do intestino delgado, detalhamos os passos simples envolvidos na transmissão horizontal de organismos entre os ratos que abrigam diferentes microbiotas. Embora este protocolo centra-se no intestino delgado, o procedimento é o mesmo para a análise do intestino...

A tarefa principal do intestino delgado é muitas vezes considerada a digestão e absorção de nutrientes 1. Enquanto essa função metabólica é claramente essencial, o intestino delgado tem um papel igualmente importante na defesa do hospedeiro, da barragem contínua de antigénios ambientais encontradas no interior do lúmen 2. O tracto intestinal separa o mundo exterior (por exemplo., Antigénios luminais) a partir do ambiente interno do hospedeiro com uma camada epitelial que é apenas uma única camada de células de espessura. Como tal, o sistema imune do intestino delgado tem a tarefa formidável de equilibrar o seu limiar de reactividade, permitindo antigénios estranhos provenientes dos micróbios dieta e comensais de introduzir a mucosa com mínima, se alguma, resposta imune, enquanto a montagem de uma resposta robusta contra patogénios invasores e outras &quot;prejudiciais&quot; antígenos. Respostas imunes excessiva ou inadequada para esses antígenos pode levar a doença patológica (por exemplo., Inflammadoença tory intestino, diabetes tipo I, esclerose múltipla) e deve ser evitado 06/03. No geral, o tracto gastrointestinal é pensado para representar a maior órgão imune no corpo, contendo mais de 70% de todas as células secretoras de anticorpos 7. O sistema imunitário do intestino delgado é constituída por 3 compartimentos principais - a lâmina própria (LP), a camada intraepitelial, e placas de Peyer (PP) - que cada um contém um grupo distinto de linfócitos 2. Os linfócitos LP (LPLs) são principalmente as células TCRαβ + T com ~ células 20% de B; linfócitos intra-epiteliais (IELs) contêm células B muito poucos com mais células TCRγδ + T do que as células TCRαβ + T; e PPS, que são órgãos linfóides secundários embutidos no intestino delgado, parede contêm células ~ 80% de B. Embora cada uma destas regiões anatómicas tem funções ligeiramente distintas e bases ontológicas, elas funcionam em AHmoda armonized para proteger o hospedeiro de insultos patogénicos. Além disso, há um crescente apreciação que a microbiota é um determinante crítico para o desenvolvimento do sistema imunitário intestinal, com o aumento do reconhecimento cognato da relação entre os micróbios e a ontogenia específicos de determinadas linhagens celulares 8,9. Além disso, dado que a formação do sistema imune intestinal afeta as respostas imunes em locais anatomicamente distantes (por ex., Artrite, esclerose múltipla, a pneumonia), tornou-se claro que o desenvolvimento do sistema imunitário do intestino é relevante para mais processos de doença do que anteriormente reconhecido 10 -12. Como tal, o interesse em avaliar quantitativamente o sistema imunológico intestinal foi muito além interações patógeno-hospedeiro para incluir agora interações hospedeiro-comensais e patogênese de muitas doenças sistêmicas bem. Tendo em conta a variabilidade dos métodos actuais naisolamento de linfócitos intestinais, um método que é otimizado para a produção, viabilidade e consistência, equilibrando o tempo necessário é cada vez mais crítica. Os protocolos que envolvem gradientes de Percoll são tempo e trabalho intensivo e potencialmente mais propenso a erro humano, levando a um rendimento variável e viabilidade 13. Aqui, nós fornecemos um protocolo optimizado para o isolamento e caracterização de linfócitos a partir de todos os compartimentos 3 imunes no intestino delgado. Além disso, dado o interesse crescente em alterações induzidas pelo micróbio no sistema imune das mucosas, que incluem passos que podem ser utilizados para permitir a transmissão horizontal de microrganismos entre ratos para avaliar como estas alterações afectam quantitativamente o sistema imune do intestino.

<table><tbody><tr><td>Luvas estéreis</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>gaiola de rato estéril</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contém tampa, fundo da gaiola e cama alfa-dri</td></tr><tr><td>Alimentador de metal</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de água</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Porta-cartões</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Roedor autoclavável chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI médio 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>a concentração no protocolo é baseada em um nível de atividade de 1,878 U/mg</td></tr><tr><td>de colagenase, tipo II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>a concentração no protocolo é baseada em um nível de atividade de 245 U/mg</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de alimentação (18 G, 2" de comprimento)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável (15 lâminas)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Pinça reta</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Copos multiusos, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitação</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitação multiposições, 9 posições</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Aço inoxidável cônico Escorador, 3 polegadas&nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Filtro de célula</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços, fundo redondo</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (bloco Fc)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr>(<tr><td>Opcional) Corante de viabilidade fixável eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina, tamponado neutro</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino intestino delgado

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Os intestinos - que contêm o maior número de células imunes de qualquer órgão do corpo - são constantemente expostos a antígenos estranhos, tanto microbiana e dietética. Dado que uma maior compreensão destes antigénios luminais ajudar a dar forma a resposta imune e que a formação de células imunitárias no intestino é crítica para uma série de doenças sistémicas, tem havido um interesse crescente na caracterização do sistema imune do intestino. No entanto, muitos protocolos publicados são árduos e consumidores de tempo. Apresentamos aqui um protocolo simplificado para o isolamento de linfócitos a partir da própria lâmina do intestino delgado, a camada intraepitelial, e placas de Peyer, que é rápido, reprodutível, e não necessita de gradientes de Percoll laboriosos. Embora o protocolo centra-se no intestino delgado, é também adequado para a análise do cólon. Além disso, destacam-se alguns aspectos que podem precisar de otimização adicional, dependendo do ques científica específicação. Esta abordagem resulta no isolamento de um grande número de linfócitos viáveis ​​que podem, subsequentemente, ser utilizadas para a análise de citometria de fluxo ou meio alternativo de caracterização.

Análise citométrica de fluxo de suspensões de células únicas de linfócitos no intestino delgado deve produzir uma população discreta de células que têm características semelhantes dispersão frontal e lateral como esplenócitos (Figuras 1A e 1B). Os linfócitos podem começam a morrer, se o tecido não é mantida a 4 ° C durante as fases iniciais do isolamento, resultando na população de linfócitos com uma dispersão frontal inferior e sendo mais difíceis de separar das outras ...

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar populações de células individuais de diferentes compartimentos intestinais delgados, que posteriormente podem ser utilizadas para análise por citometria de fluxo ou por outro meio de caracterização. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na imunologia da mucosa, como a forma como a microbiota influencia o desenvolvimento do sistema imunológico intestinal. As principais vantagens desta técnica são sua rapidez, reprodutibilidade e o fato de não exigir gradientes laboriosos de percólico.Para iniciar este procedimento, posicione o camundongo com o lado dorsal voltado para baixo e pulverize o abdômen com etanol a 70 por cento; realize uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e, em seguida, a fáscia peritoneal ao longo da linha média ventral, da sínfise púbica até o processo xifoide, expondo assim a cavidade peritoneal. Em seguida, separe o intestino delgado do estômago seccionando o esfíncter pilórico. Remova cuidadosamente o intestino delgado do peritônio e separe a gordura mesentérica.Para remover completamente o intestino delgado, faça um segundo corte na junção ileocecal. Coloque o intestino delgado isolado em meio RPMI a quatro graus Celsius contendo 10 por cento de FBS para maximizar a viabilidade celular. Remova cuidadosamente grandes pedaços de gordura usando pinças curvas e tenha cuidado para evitar rasgar o próprio tecido intestinal durante o processo.Para remover o conteúdo intestinal, canule a extremidade proximal do intestino delgado com uma agulha de alimentação de 18 gauge fixada a uma seringa e lave suavemente o intestino com 15 a 20 mililitros de PBS frio. Use tesoura para excisar as placas de Peyer, localizadas no lado antimesentérico do intestino delgado e que se apresentam como uma massa branca multilobulada. Em seguida, coloque-as em meio RPMI frio contendo 5% de FBS.Em seguida, corte o intestino delgado em segmentos de sete a dez centímetros, remova a gordura residual enrolando cada segmento intestinal em uma toalha de papel umedecida com RPMI e use uma lâmina de bisturi romba para separar cuidadosamente a gordura do tecido. Prestar atenção rigorosa à remoção completa da gordura mesentérica é essencial para garantir a viabilidade dos linfócitos, pois mesmo pequenas quantidades de gordura podem causar morte celular. Depois disso, vire o tecido do avesso canulando os segmentos intestinais com pinças curvas, segurando a extremidade distal do tecido e, em seguida, use um par de pinças retas para remover suavemente o segmento tecidual da extremidade proximal, resultando na inversão do tecido.Coloque os segmentos de tecido em um copo contendo 30 mililitros de meio de extração e um bastão de agitação. Fixe a tampa firmemente e agite por 15 minutos a 37 graus Celsius. A agitação deve ser vigorosa, mas não turbulenta.Após 15 minutos, utilize um coador de aço para separar os fragmentos de tecido do sobrenadante contendo o epitélio, que deve apresentar-se turvo. Agite manualmente os fragmentos de tecido no meio RPMI para remover o meio de extração residual. Em seguida, coloque o tecido sobre uma toalha de papel seca e vire-o várias vezes para facilitar a remoção do muco residual que não foi liberado pelo meio de extração.Posteriormente, coloque os fragmentos de tecido em um tubo de um ponto cinco mililitro com 600 microlitros de meio de digestão. Pique o tecido até que os pedaços não aderem mais à tesoura e a solução pareça homogênea. Esta etapa é essencial para garantir a digestão enzimática completa do tecido.Picar o tecido até que os pedaços não aderem mais à tesoura e a solução pareça homogênea é essencial para garantir o rendimento celular, bem como a reprodutibilidade dos resultados. Adicione o intestino delgado picado a um copo contendo 25 mililitros de meio de digestão e agite durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Na metade do tempo de digestão, aspire e expulse o meio com uma pipeta serológica para ajudar a quebrar quaisquer fragmentos maiores de tecido.Em seguida, filtre o tecido digestivo através de uma peneira celular de 100 micrômetros para um tubo de 15 mililitros. Enxágue a peneira com 20 mililitros de meio RPMI contendo 10 por cento de FBS. Posteriormente, centrifugue a solução filtrada por 10 minutos a quatro graus Celsius.Decante cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de meio RPMI contendo 10 por cento de FBS. Filtre as células re-suspensas através de um filtro celular de 40 micrômetros em um tubo de 15 mililitros. Enxágue o filtro com 20 mililitros de RPMI contendo 10 por cento de FBS.Posteriormente, centrifugue a solução filtrada por 10 minutos a quatro graus Celsius. Decante cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de meio RPMI, contendo dois por cento de FBS. Neste procedimento, transfira os fragmentos de placas de Peyer removidos para um copo contendo 25 mililitros de meio de digestão e um agitador magnético.Feche a tampa e centrifugue por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, filtre os fragmentos digeridos das placas de Peyer através de um filtro celular de 40 micrômetros para um tubo de 15 mililitros. Se ainda houver agregados, pressione-os através do filtro utilizando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de um mililitro.Em seguida, lave o filtro com 10 mililitros de meio RPMI, contendo 10 por cento de FBS. Centrifugue a solução filtrada por 10 minutos a quatro graus Celsius. Então, remova cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de meio RPMI contendo dois por cento de FBS.A análise por citometria de fluxo de suspensões simples de células de linfócitos do intestino delgado deve gerar uma população distinta de células com características semelhantes de dispersão para frente e dispersão lateral às dos esplenócitos. Os linfócitos podem começar a morrer se o tecido não for mantido a quatro graus Celsius durante as fases iniciais do isolamento, resultando em uma população de linfócitos com menor dispersão para frente e mais difícil de separar de outras células epiteliais e mortas. Além disso, se a gordura mesentérica não for completamente removida do tecido intestinal delgado, haverá uma perda praticamente completa dos linfócitos.Normalmente, obtém-se uma viabilidade de 80 por cento para linfócitos do LP intestinal delgado. Após dominar a técnica, pode-se processar quatro camundongos e ter suspensões de células únicas prontas para coloração em menos de quatro horas. Durante este procedimento, é importante remover completamente toda a gordura mesentérica e picar bem o tecido para garantir uma digestão completa.Após este procedimento, as suspensões de células únicas podem ser utilizadas para fins diferentes da citometria de fluxo, como experimentos in vitro, análise de expressão gênica ou transferência adotiva para caracterizar ainda mais a função dessas células. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores em imunologia mucosal explorarem a ontogenia e as implicações funcionais do sistema imunológico intestinal em camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar suspensões de células únicas de diferentes compartimentos intestinais, limpando a gordura mesentérica, removendo a camada epitelial e digerindo o tecido com colagenase.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

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Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

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Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

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