Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

O objetivo geral deste procedimento é isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado que podem ser posteriormente usadas para análise de citometria de fluxo ou um meio alternativo de caracterização. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na imunologia da mucosa, como a forma como a microbiota afeta o desenvolvimento do sistema imunológico intestinal. As principais vantagens desta técnica são que elas são rápidas, reprodutíveis e não requerem gradientes de percoll trabalhosos.

Para iniciar este procedimento, coloque o lado dorsal do camundongo para baixo e borrife o abdômen com etanol a 70%, realize uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e, em seguida, a fáscia peritoneal ao longo da linha média ventral da sínfise púbica ao processo xifóide, expondo assim a cavidade peritoneal. Em seguida, separe o intestino delgado do estômago seccionando o esfíncter pilórico. Remova suavemente o intestino delgado do peritônio e retire a gordura mesentérica.

Para remover completamente o intestino delgado, faça um segundo corte na junção ileocecal. Coloque o intestino delgado isolado em um meio RPMI de quatro graus Celsius contendo 10% de FBS para maximizar a viabilidade celular. Remova suavemente grandes pedaços de gordura usando uma pinça curva e tenha cuidado para evitar rasgar o próprio tecido intestinal durante o processo.

Para remover o conteúdo intestinal, canule a extremidade proximal do intestino delgado com uma agulha de alimentação de calibre 18 afixada a uma seringa e lave suavemente o intestino com 15 a 20 mililitros de PBS frio. Use uma tesoura para extirpar os adesivos de Peyer, que estão localizados no lado antimesentérico do intestino delgado e aparecem como uma massa branca multilobulada. Em seguida, coloque-os em um meio RPMI frio contendo cinco por cento de FBS.

Em seguida, corte o intestino delgado em segmentos de três a quatro polegadas, remova a gordura residual rolando cada segmento do intestino delgado em uma toalha de papel umedecida com RPMI e use um bisturi cego para afastar a gordura do tecido. Prestar muita atenção à remoção completa da gordura mesentérica é fundamental para garantir a viabilidade dos linfócitos, pois mesmo pequenos pedaços de gordura podem causar a morte das células. Depois disso, vire o tecido do avesso canulando os segmentos intestinais com uma pinça curva e segurando a extremidade distal do tecido, depois use um par de pinças retas para remover suavemente o segmento de tecido da extremidade proximal, resultando na inversão do tecido.

Coloque os segmentos de tecido em um copo contendo 30 mililitros de meio de extração e uma barra de agitação. Feche a tampa na tampa e mexa por 15 minutos a 37 graus Celsius. A agitação deve ser vigorosa, mas não turbulenta.

Após 15 minutos, use um filtro de aço para separar os pedaços de tecido do epitélio contendo sobrenadante, que deve parecer turvo. Agite manualmente os pedaços de tecido em meio RPMI para lavar o meio de extração residual. Em seguida, coloque o tecido sobre uma toalha de papel seca e vire-o várias vezes para facilitar a remoção do muco residual que não foi liberado pelo meio de extração.

Em seguida, coloque os fragmentos de tecido em um tubo de um vírgula cinco mililitros com 600 microlitros de meio de digestão. Pique o tecido até que os pedaços não grudem mais na tesoura e a solução pareça homogênea. Esta etapa é fundamental para garantir a digestão enzimática completa do tecido.

Picar o tecido até que os pedaços não grudem mais na tesoura e a solução pareça homogênea são essenciais para garantir o rendimento celular, bem como garantir a reprodutibilidade dos resultados. Adicione o intestino delgado picado a uma xícara contendo 25 mililitros de meio de digestão e mexa por 30 minutos a 37 graus Celsius. No meio da digestão, canalize-o para cima e para baixo com uma pipeta sorológica para ajudar a quebrar quaisquer pedaços grandes de tecido.

Em seguida, filtre o tecido digestivo através de um filtro de células de 100 micrômetros em um tubo de 15 mililitros. Enxágue o filtro com 20 mililitros de meio RPMI contendo 10% de FBS. Em seguida, centrifugue a solução filtrada por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet num mililitro de meio RPMI contendo 10 % de FBS. Filtrar as células ressuspensas através de um filtro de células de 40 micrómetros para um tubo de 15 mililitros. Enxágue o filtro com 20 mililitros de RPMI contendo 10% de FBS.

Em seguida, centrifugue a solução filtrada por 10 minutos a quatro graus Celsius. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet num mililitro de meio RPMI, contendo dois por cento de FBS. Neste procedimento, transfira os adesivos de Peyer excisados para um copo com 25 mililitros de meio de digestão e uma barra de agitação.

Feche a tampa e gire por 10 minutos a 37 graus Celsius. Depois, filtre os adesivos de Peyer digeridos através de um filtro de células de 40 micrômetros em um tubo de 15 mililitros. Se restarem grumos, pressione-os através do filtro usando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de um mililitro.

Em seguida, enxágue o filtro com 10 mililitros de meio RPMI, contendo 10% de FBS. Centrifugue a solução filtrada por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em um mililitro de meio RPMI contendo dois por cento de FBS.

A análise por citometria de fluxo de suspensões unicelulares de linfócitos do intestino delgado deve produzir uma população discreta de células com características de dispersão frontal e lateral semelhantes às dos esplenócitos. Os linfócitos podem começar a morrer se o tecido não for mantido a quatro graus Celsius durante os estágios iniciais do isolamento, resultando em uma menor dispersão para a frente e sendo mais difícil de separar de outras células epiteliais e mortas. Além disso, se a gordura mesentérica não for completamente removida do tecido do intestino delgado, haverá uma perda praticamente completa de linfócitos.

Normalmente, é obtida uma viabilidade de 80% para linfócitos LP do intestino delgado. Uma vez dominado, pode-se processar quatro camundongos e ter suspensões de célula única prontas para coloração em menos de quatro horas. Durante este procedimento, é importante remover completamente toda a gordura mesentérica e picar bem o tecido para garantir a digestão completa.

Seguindo este procedimento, suspensões unicelulares podem ser usadas para outros fins que não a citometria de fluxo, como experimentos in vitro, análise de expressão gênica ou transferência adotiva para caracterizar ainda mais a função dessas células. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em imunologia da mucosa explorarem a ontogenia e as implicações funcionais do sistema imunológico intestinal em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar suspensões unicelulares de diferentes compartimentos do intestino delgado, limpando a gordura mesentérica, extraindo a camada epitelial e digerindo o tecido com colagenase.