Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

O objetivo geral deste protocolo é descrever a avaliação funcional de bibliotecas abrangentes de mutagênese de saturação de local único de proteínas, utilizando sequenciamento de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da bioquímica e evolução molecular. Por exemplo, quais são as restrições bioquímicas, estruturais e evolutivas das proteínas?

E como podemos projetar proteínas com novas funções? A principal vantagem dessa técnica é que ela maximiza uma série de leituras úteis de sequenciamento em um estudo de mutagênese de saturação de proteína inteira, multiplicando a construção e o sequenciamento de bibliotecas. Depois de preparar uma placa de PCR Master Mix de acordo com o protocolo do texto, use uma pipeta multicanal para transferir 10 microlitros das placas de 96 poços contendo os primers de mutagênese sense previamente diluídos para os poços cognatos nas placas de PCR.