Name: Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda a avaliação funcional de bibliotecas de mutagênese de saturação em proteínas usando sequenciamento de alta vazão. Este método permite estudar restrições bioquímicas e engenharia de proteínas com novas funções.

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Os autores declaram não ter interesses financeiros conflitantes

Aqui é um protocolo descrito para realizar a avaliação funcional de bibliotecas de mutagénese de saturação total em proteínas, usando a tecnologia de sequenciação de alto rendimento. Um aspecto importante do método é o uso de iniciadores ortogonais durante o processo de clonagem. Resumidamente, cada posição de aminoácido é ao acaso por PCR mutagénica, e misturados entre si em grupos de posições em que o comprimento de sequência combinada é acomodada por sequenciação de alto rendimento. Estes grupos são clonados em vecto...

A mutagénese foi longa empregues no laboratório para estudar as propriedades de sistemas biológicos e a sua evolução, e para produzir proteínas mutantes ou organismos com funções melhoradas ou novos. Embora as primeiras abordagens invocado métodos que produzem mutações aleatórias em organismos, o advento da tecnologia de DNA recombinante permitiu aos investigadores a introduzir alterações seleccione a ADN de um modo específico do local, isto é., Mutagénese dirigida ao local 1,2. Com as técnicas actuais, tipicamente utilizando oligonucleótidos mutagénicos numa reacção em cadeia da polimerase (PCR), é relativamente fácil de criar e avaliar um pequeno número de mutações (por exemplo., Mutações pontuais) num dado gene 3,4. É muito mais difícil no entanto, quando as abordagens de meta, por exemplo, a mutações criação e avaliação de todos os possíveis single-site (ou de ordem superior). Embora muito tenha sido aprendido com os primeiros estudos que tentam avaliar um grande número de mutations em genes, as técnicas utilizadas foram muitas vezes trabalhosa, por exemplo exigindo a avaliação de cada mutação de forma independente usando um absurdo supressor estirpes 5-7, ou foram limitados na sua capacidade quantitativa devido à baixa profundidade sequenciação de Sanger seqüenciamento 8. As técnicas utilizadas nestes estudos têm sido largamente suplantado por métodos que utilizam high-throughput tecnologia de sequenciação 9-12. Estas abordagens conceptualmente simples implicam a criação de uma biblioteca que compreende um grande número de mutações, sujeitando a biblioteca para uma tela ou selecção para a função, e depois profunda-sequenciação (isto é., Da ordem dos&gt; 10 6 sequenciação lê) a biblioteca obtida antes e após selecção. Desta forma, os efeitos fenotípicos ou aptidão de um grande número de mutações, representada como a alteração na frequência de cada população mutante, pode ser avaliada simultaneamente e quantitativamente mais. Nós já introduziu uma simp(., ou seja, de toda a proteína bibliotecas de mutagénese de saturação) le abordagem para avaliar bibliotecas de todas as mutações de um único aminoácido em proteínas possíveis, aplicáveis ​​aos genes com um comprimento maior que o comprimento ler sequenciação 11,13: Em primeiro lugar, cada posição de aminoácido é randomizado pelo Site-Directed PCR mutagênico. Durante este processo, o gene é dividido em grupos compostos de posições contíguas com um comprimento total acomodados pela plataforma de sequenciação. Os produtos de PCR mutagénica para cada grupo são, então, combinados, e cada grupo submetido independentemente a selecção e sequenciação de alto rendimento. Ao manter uma correspondência entre a localização de mutações na sequência e do comprimento de sequenciação de leitura, esta abordagem tem a vantagem de maximizar a profundidade de sequenciação: enquanto um poderia simplesmente sequenciar tais bibliotecas em janelas curtas sem divisão em grupos (por exemplo, uma espingarda padrão. abordagem de sequenciação), mais leituras obtida seria do tipo selvagem e assim a maioria de rendimento desperdiçado sequenciação (por exemplo, para um conjunto de proteínas biblioteca de mutagénese de saturação de uma proteína de 500 amino ácido sequenciado em 100 aminoácidos (300 pb) janelas, no mínimo 80% de leituras vão ser a sequência de tipo selvagem). Aqui, um protocolo que utiliza é apresentado sequenciação de alto rendimento para a avaliação funcional de bibliotecas de mutagénese de saturação total em proteínas, utilizando a abordagem acima (descrito na Figura 1). Importante, introduz-se o uso de iniciadores ortogonais no processo de clonagem da biblioteca de código de barras para cada grupo de sequência, o que lhes permite ser multiplexados em uma biblioteca, simultaneamente submetido a rastreio ou selecção, e depois de-multiplexados para a sequenciação de profundidade. Uma vez que os grupos de sequência não são submetidas a selecção de forma independente, o que reduz a carga de trabalho e assegura que cada mutação experimenta o mesmo nível de selecção. TEM-1 β-lactamase, uma enzima que confere resistência de alto nível aoantibióticos β-lactâmicos (por exemplo., ampicilina) em bactérias é usado como um sistema modelo 14-16. Um protocolo é descrito para a avaliação de uma biblioteca de mutagénese de saturação todo-proteína de TEM-1 em E. coli sob selecção com um nível de soro aproximada para uma dose clínica de ampicilina (50 ug / ml) 17,18.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Produtos de Pesquisa Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de</td><td>Petri Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>Oligonucleotide primers</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>escala de 25 nmol, pBR322_AvrII de dessalinização padrão</td></tr><tr><td></td><td>disponíveis mediante solicitação</td><td></td><td>plasmídeo pBR322 modificado para conter o local de restrição AvrII a jusante do gene TEM-1</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &ndash; pBR322_OP5</td><td>disponíveis mediante solicitação</td><td></td>, <td>cinco plasmídeos pBR322 modificados, cada um contendo um par de locais de priming ortogonais</td></tr><tr><td>DNA polimerase de alta fidelidade Q5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>inclui 5x tampão PCR e aditivo de PCR (intensificador de GC)</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 ml</td><td>Pipetas Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Multicanal (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR, 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Vedação de placa de 96 poços</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclador de 96 poços</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x corante de carregamento de gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador UV (FOTO/Analyst ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>tampão EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de ensaio de fundo transparente de parede preta de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>DNA de fago Lambda</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente PicoGreen dsDNA Reagente</td> de quantificação <td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>dsDNA, usado na etapa 2.2.4 do protocolo</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Victor 3 V</td> Kit de purificação de DNA <td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador UV de comprimento de onda longo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de extração de DNA em gel de agarose</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 eletrocompetente E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml</td><td>Kit</td><td></td> de purificação de plasmídeo Corning 430828 <td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tira de PCR de 8 poços</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit de ensaio</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA reagente de quantificação</td></tr><tr><td>Tubos de ensaio Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq sequenciador de mesa</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternativamente, pode-se sequenciar na plataforma Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>o software FLASh</td><td>John Hopkins University - software http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ de código aberto</td><td></td> <td>para mesclar leituras de extremidade emparelhada de dados de sequenciamento de próxima geração</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACATAGAGGCACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr></tbody></table>

um protocolo de avaliação funcional da whole-protein saturação mutagênese bibliotecas utilizando-high throughput sequencing

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

A mutagênese dirigida ao local tem sido usada há muito tempo como um método para interrogar a estrutura, função e evolução da proteína. Avanços recentes na tecnologia de sequenciamento massivamente paralelo abriram a possibilidade de avaliar os efeitos funcionais ou de aptidão de um grande número de mutações simultaneamente. Aqui, apresentamos um protocolo para determinar experimentalmente os efeitos de todas as possíveis mutações de aminoácidos únicos em uma proteína de interesse utilizando tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, usando a enzima de resistência a antibióticos de 263 aminoácidos TEM-1 β-lactamase como exemplo. Nesta abordagem, uma biblioteca de mutagênese de saturação de proteína inteira é construída por PCR mutagênico dirigido ao local, randomizando cada posição individualmente para todos os aminoácidos possíveis. A biblioteca é então transformada em bactéria e selecionada pela capacidade de conferir resistência aos antibióticos β-lactâmicos. O efeito de aptidão de cada mutação é então determinado pelo sequenciamento profundo da biblioteca antes e depois da seleção. É importante ressaltar que este protocolo introduz métodos que maximizam a profundidade de leitura do sequenciamento e permitem a seleção simultânea de toda a biblioteca de mutações, misturando posições adjacentes em grupos de comprimento acomodados pelo comprimento de leitura de sequenciamento de alto rendimento e utilizando primers ortogonais para codificar cada grupo. Resultados representativos usando este protocolo são fornecidos avaliando os efeitos de aptidão de todas as mutações de aminoácidos únicos em TEM-1 em uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina. O método deve ser facilmente extensível a outras proteínas para as quais existe um ensaio de seleção de alto rendimento.

O mapa do plasmídeo para as cinco plasmídeos pBR322 contendo locais de iniciação modificados ortogonais (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) é mostrado na Figura 2A. Para testar se os iniciadores são específicos ortogonais, os PCRs foram realizadas utilizando cada par de iniciadores de individualmente ortogonais, juntamente com todos os cinco plasmídeos pBR322_OP1-5, ou com todos os plasmídeos menos o plasmídeo combinando o par de iniciadores ortogonal. O produto correcto só foi ob...

Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever a avaliação funcional de bibliotecas abrangentes de mutagênese de saturação de local único de proteínas, utilizando sequenciamento de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da bioquímica e evolução molecular. Por exemplo, quais são as restrições bioquímicas, estruturais e evolutivas das proteínas?E como podemos projetar proteínas com novas funções? A principal vantagem dessa técnica é que ela maximiza uma série de leituras úteis de sequenciamento em um estudo de mutagênese de saturação de proteína inteira, multiplicando a construção e o sequenciamento de bibliotecas. Depois de preparar uma placa de PCR Master Mix de acordo com o protocolo do texto, use uma pipeta multicanal para transferir 10 microlitros das placas de 96 poços contendo os primers de mutagênese sense previamente diluídos para os poços cognatos nas placas de PCR.Use um selo de placa para cobrir cada placa de PCR e centrifugue a 200 Gs por dois minutos. Em seguida, transfira as placas de PCR para um termociclador e execute o programa a seguir. Depois de realizar PCR adicional e diluir as reações, de um a 100, transfira um microlitro

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Biologia

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

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Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Os modelos de proteinopatia de levedura são ferramentas valiosas para avaliar a toxicidade e a agregação de proteínas implicadas na doença. Aqui, apresentamos métodos para triagem de bibliotecas de variantes de Hsp104 para supressores de toxicidade. Este protocolo pode ser adaptado para rastrear qualquer biblioteca de proteínas em busca de supressores de toxicidade de qualquer proteína tóxica em leveduras.

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Proteínas que se ligam a sequências específicas de RNA desempenham um papel crítico na expressão do gene. Caracterização detalhada destes sítios de ligação é fundamental para nossa compreensão da regulação genética. Aqui, uma abordagem passo a passo para mutagénese saturação de proteína ligadora de sites no RNA é descrita. Esta abordagem é relevante para todos os sites de proteína ligadora de RNA.

Uma abordagem de mutagénese romance saturação: Caracterização de única etapa de proteína reguladora vinculação Sites no RNA usando fosforotioatos

Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.

Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.

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Pessoas com mutações BRCA1 têm maior risco de desenvolver câncer, o que garante uma avaliação precisa da função das variantes BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base de citosina mediados pelo CRISPR que permitem a conversão de C:G para T:A direcionada em células vivas.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Aprenda a avaliação funcional de bibliotecas de mutagênese de saturação em proteínas usando sequenciamento de alta vazão. Este método permite estudar restrições bioquímicas e engenharia de proteínas com novas funções.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

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