Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

O objetivo geral deste protocolo é descrever a avaliação funcional de bibliotecas abrangentes de mutagênese de saturação de local único de proteínas, utilizando sequenciamento de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da bioquímica e evolução molecular. Por exemplo, quais são as restrições bioquímicas, estruturais e evolutivas das proteínas?

E como podemos projetar proteínas com novas funções? A principal vantagem dessa técnica é que ela maximiza uma série de leituras úteis de sequenciamento em um estudo de mutagênese de saturação de proteína inteira, multiplicando a construção e o sequenciamento de bibliotecas. Depois de preparar uma placa de PCR Master Mix de acordo com o protocolo do texto, use uma pipeta multicanal para transferir 10 microlitros das placas de 96 poços contendo os primers de mutagênese sense previamente diluídos para os poços cognatos nas placas de PCR.

Use um selo de placa para cobrir cada placa de PCR e centrifugue a 200 Gs por dois minutos. Em seguida, transfira as placas de PCR para um termociclador e execute o programa a seguir. Depois de realizar PCR adicional e diluir as reações, de um a 100, transfira um microlitro dos produtos de PCR mutagênicos misturados e diluídos da primeira rodada para os poços cognatos de novas placas de PCR contendo Master Mix.

Use um selo de placa para cobrir cada placa de PCR. Centrifugar as placas a cerca de 200 Gs durante dois minutos. Em seguida, transfira as placas para o termociclador e execute o mesmo programa listado anteriormente no vídeo.

Depois de verificar os tamanhos dos produtos de PCR e medir as concentrações de acordo com o protocolo de texto, misture 100 nanogramas de cada produto de PCR da subbiblioteca NNS em cinco grupos de subbibliotecas NNS. Depois de executar as reações de PCR da subbiblioteca e digerir os vetores de clonagem nas reações de PCR, de acordo com o protocolo de texto, configure as reações de ligação seguindo estas diretrizes para cada grupo de subbiblioteca NNS digerido, com seu vetor de clonagem digerido de restrição cognata. Em seguida, incube em temperatura ambiente por uma hora.

Uma vez que as células de E.coli eletrocompetentes tenham sido descongeladas, adicione dez microlitros de células a cada reação de ligação purificada e transfira para uma cubeta de eletroproração. Eletroprorate as células a 1,8 quilovolts, adicione um mililitro de meio SOB e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, ressuspenda 10 microlitros de cada cultura de recuperação em 990 microlitros de LB. E espalhe 100 microlitros em placas de trado LB contendo 12 microgramas por mililitro de tetraciclina.

Para cada cultura de recuperação, prepare um frasco de cultura de 250 mililitros com 50 mililitros de LB e 50 microlitros de teto-estoque. Transferir os restantes cerca de um mililitro de cultura de recuperação para um balão. Incube a 37 graus Celsius e 200 rpm durante a noite.

Depois de contar o número de transformantes bem-sucedidos nas placas e isolar o DNA plasmático das culturas noturnas, misture 100 nanogramas de cada plasmídeo. Depois de transformar a biblioteca de DNA de acordo com o protocolo de texto, dilua a biblioteca durante a noite para um OD-600 igual a 0,1. E adicione um mililitro a um frasco.

Incubar a cultura de pré-seleção a 37 graus Celsius e 200 RPM. Monitore periodicamente o crescimento medindo o OD-600, até que seja igual a 0,1. Transferir 100 mililitros da cultura de pré-seleção para dois tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugar a 4.000 Gs por seis minutos, a quatro graus Celsius.

Remova a maior parte do sobrenadante e combine os pellets em um único tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, após repetir a centrifugação, remova todo o sobrenadante. Adicionar tetraciclina aos outros dois frascos até uma concentração final de 12 microgramas por mililitro.

E um volume da cultura de pré-seleção, de modo que o OD-600 final seja igual a 0,001. Adicionar a um balão um mililitro de 50 miligramas por mililitro de ampicilina a uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Esta é a cultura de seleção.

Enquanto incuba as culturas a 37 graus Celsius em 200 RPM, monitore o crescimento da cultura sem ampicilina até atingir um OD-600 igual a 0,1. Meça também o OD-600 da cultura de seleção. Depois de dividir o OD-600 da cultura de seleção em 0,1 e multiplicar por 100, transfira esse volume para tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue a 4.000 Gs e quatro graus Celsius por seis minutos.

Depois de remover a maior parte do sobrenadante, combine os pellets em um único tubo antes de girar novamente e remover todo o sobrenadante. Para realizar o sequenciamento de alto rendimento, prepare um Master Mix de PCR e transfira 23 microlitros para 10 tubos de PCR. Adicione um microlitro de 0,5 nanogramas por microlitro de DNA de plasmídeo purificado da cultura de pré-seleção aos tubos de um a cinco.

E da cultura de seleção para os tubos de seis a 10. Misture 50 microlitros de 50 primers ortogonais diretos micromolares, OP1F a OP5F, com os respectivos primers ortogonais reversos, OP1R a OP5R. Na mesma ordem, transfira um microlitro para os tubos de PCR de um a cinco e de seis a 10.

Transfira os tubos de PCR para o termociclador e execute o programa a seguir. Em seguida, dilua as reações de PCR em 100 vezes, transferindo um microlitro de cada tubo para 99 microlitros de água. Misture bem, pipete 99 microlitros dos tubos e descarte.

Misture 50 microlitros dos primers dianteiros e reversos. Em seguida, transfira um microlitro para os tubos de PCR de um a cinco e de seis a 10. Em seguida, depois de preparar um Master Mix de PCR, adicione 23 microlitros a cada tubo de PCR e execute o programa a seguir.

Para realizar as PCRs finais para adicionar sequências de indexação, após diluir as reações de PCR 100 vezes, como antes, e manter um microlitro, adicionar 23 microlitros do PCR Master Mix. Para tubos com modelo originário dos grupos de subbibliotecas NNS de um a cinco, adicione 0,5 microlitros de primers diretos 501F a 505F, respectivamente. Para tubos com gabarito resultante das culturas de pré-seleção e seleção, adicione 0,5 microlitros de primers reversos 701R e 702R.

Execute o mesmo programa de PCR que acabamos de indicar. Em seguida, depois de medir as concentrações de cada reação de acordo com o protocolo de texto, misture 100 nanogramas de cada produto de PCR em um único tubo de microcentrífuga. Depois de adicionar o corante de carregamento de gel 6X, carregue toda a amostra de PCR combinada em um gel de agarose a dois por cento.

E execute o gel a 100 volts, por 50 minutos. Usando um iluminador UV de comprimento de onda longo, visualize e, em seguida, excise a fatia contendo o produto de PCR de aproximadamente 360 pares de bases. Purifique, sequencie e analise a amostra de acordo com o protocolo de texto.

O mapa de plasmídeo para os cinco plasmídeos pBR322 modificados contendo locais de priming ortogonais é mostrado aqui. O teste da especificidade dos primers ortogonais usando PCR mostrou que o produto de PCR correto só foi obtido quando o plasmídeo correspondente foi incluído na reação. E nenhum produto de qualquer tamanho foi obtido em sua ausência.

Após o processamento de um experimento, foram obtidas 6,2 vezes 10 elevado à sexta leitura da condição de pré-seleção e 6,3 vezes 10 elevado à sexta leitura da condição de ampicilina. As contagens para cada mutação de aminoácido da condição de pré-seleção exibem uma distribuição log-normal. Esta figura mostra o efeito de aptidão relativa, FIA, para cada mutação em cada posição de TEM-um.

E sua distribuição é mostrada aqui. Sob seleção de 50 microgramas por mililitro de ampicilina, a maioria das mutações tem um efeito de aptidão neutro ou quase neutro. Correspondendo aos pixels brancos aqui e ao pico grande aqui.

Uma pequena fração de mutações nessa concentração de antibióticos tem efeitos substanciais na aptidão. Como esperado, isso inclui mutações nos resíduos do sítio ativo altamente conservados. Em contraste, poucos pixels aparecem como significativamente vermelhos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente uma semana. Se for executado corretamente e todos os reagentes estiverem disponíveis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de se manter organizado durante a clonagem para combinar os produtos de PCR mutagênicos nos grupos corretos e clonar nos vetores corretos.

E durante a preparação do sequenciamento, usar os primers corretos. Estendendo-se a partir deste procedimento, as principais etapas do protocolo podem ser modificadas para examinar combinações de mutações, diferentes ambientes de seleção e outros sistemas de proteínas, a fim de responder a questões adicionais sobre a dependência do contexto genético e ambiental das mutações. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do trabalho necessário para construir uma biblioteca de mutagênese de saturação de proteína inteira e avaliar os efeitos funcionais de cada mutação simultaneamente, usando sequenciamento de alto rendimento.

Não se esqueça de que trabalhar com brometo de etídio e luz ultravioleta pode ser perigoso e precauções como luvas, jaleco e proteção UV devem sempre ser tomadas durante a execução de partes deste protocolo.