Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

O objetivo geral deste experimento é visualizar a transferência de energia de uma fita de DNA modificada por corante para outra. Este método pode ajudar nas questões-chave no campo da biologia molecular. Como a interferência de RNA monitorando o processamento e a integridade do siRNA em células vivas em tempo real.

A principal vantagem desta técnica, é a facilidade de monitorar o alcance da florescência e a mudança de cor, dando um resultado claro. Assim, os resultados falsos positivos são eliminados. Para iniciar este procedimento, adicione os reagentes apropriados, conforme indicado no protocolo de texto, a um balão de fundo redondo de 20 mililitros, equipado com uma barra de agitação magnética e condensador de refluxo.

Em seguida, adicione zero vírgula zero seis mililitros de piperidina. E aqueça a mistura de reação a 80 graus Celsius por quatro horas. Depois de a reacção ter arrefecido à temperatura ambiente, recolher o precipitado resultante por filtração.

E lave com éter dietílico três vezes. Em seguida, adicione cem mililitros de éter dietílico ao sobrenadante. E colete o precipitado resultante por filtração.

Depois de lavar três vezes com éter dietílico, combinar o precipitado com o sólido isolado da primeira filtração. Usando o computador, conectado a um sintetizador de DNA, insira a sequência de DNA desejada e o método de acoplamento. Seguindo as instruções do protocolo do fabricante.

Em seguida, monte a coluna contendo o vidro de vazamento controlado, que é modificado com um micro mol da primeira face no sintetizador. Agora, inicie a síntese no sintetizador de DNA. Após a investigação das fitas de DNA, adicione os regentes apropriados, conforme indicado no protocolo de texto, à amostra de DNA modificado com alcino dietilizado.

Incubar a amostra a 60 graus Celsius por um vírgula cinco horas. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de 10 mililitros. Após o resfriamento à temperatura ambiente, adicione 150 microlitros de uma solução de sal dissódico EDTA zero zero cinco molares e 450 microlitros de uma solução de acetato de sódio de três molares zero à amostra de DNA.

Em seguida, adicione 10 mililitros de etanol à amostra. E mantenha-o a menos 32 graus Celsius por 16 horas. Em seguida, centrifugue a amostra por 15 minutos a mil vezes G. Quando terminar, remova o sobrenadante.

Lave o pellet de DNA resultante com dois mililitros de etanol frio a 80%. Em seguida, seque o pellet sob pressão reduzida usando um liofilizador. Purifique o pellet de DNA bruto por HP LC.Monitore a corrida verificando 260 nanômetros e 459 nanômetros para o corante um.

Ou 542 nanômetros para o corante dois. Colete as frações que mostram absorção em ambos os canais de comprimento de onda. Para medições de espectroscopia de absorção de fita simples, registar uma medição em branco contendo apenas 200 milimolares de cloreto de sódio e 50 milimolares de tampão fosfato de sódio.

Em seguida, transfira a solução de DNA1 previamente preparada para uma cubeta de vidro de quartzo de um centímetro. Registre a absorção. Em seguida, determine o valor máximo de absorção do corante.

Para medições de espectroscopia fluorescente de fita simples, registar uma medição em branco contendo apenas 200 milimolares de cloreto de sódio e 50 milimolares de fosfato de sódio, utilizando o comprimento de onda de excitação do corante um. Em seguida, coloque a cubeta com a solução de DNA1 no espectrômetro. Registre o espectro de florescência.

Para realizar a medição de espectroscopia fluorescente de fita dupla, coloque a cubeta com a fita dupla de solução de DNA1 e DNA2 no espectrômetro. Em seguida, registre o espectro fluorescente usando o comprimento de onda de excitação do corante um. Para entender melhor o que os espectros registrados estão mostrando, irradie as cubetas com lâmpadas UV portáteis.

Observe a mudança na cor da florescência do DNA de fita simples para dupla. Os espectros de absorção registrados mostram os máximos de 465 nanômetros para DNA1 de fita simples e 546 nanômetros para DNA2 de fita simples. A fita dupla recozida de DNA1 e DNA2 mostra máximos em 469 e 567 nanômetros.

Ambos os máximos de absorção mostram uma mudança batoohromica. E as menores mudanças espectroscópicas são o resultado de interações excitônicas entre os corantes dentro da arquitetura de DNA de dupla hélice. Os espectros fluorescentes correspondentes exibem um máximo de 537 nanômetros para DNA de fita simples1.

A 607 nanômetros para DNA de fita simples2. E a 615 nanômetros para fita dupla recozida de DNA1 e DNA2. Fita dupla de DNA1 e DNA2, mostra apenas o máximo de emissão do corante dois, embora o corante um seja seletivamente excitado, o que evidencia que a transferência de energia ocorre de forma eficiente do corante um para o corante dois.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como postar modificar sinteticamente o DNA por uma reação catalítica de casal de uma fita de DNA marcada com alcino com um lado A.