Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

O objetivo geral deste experimento é visualizar a transferência de energia de uma fita de DNA modificada com corante para outra. Este método pode auxiliar em questões fundamentais na área da biologia molecular, como a interferência de RNA ao monitorar o processamento e a integridade do siRNA em células vivas em tempo real.

A principal vantagem desta técnica é a facilidade de monitorar a propagação da fluorescência e a mudança de cor, fornecendo um resultado claro. Assim, são eliminados os resultados falsos positivos. Para iniciar este procedimento, adicione os reagentes apropriados, conforme indicado no protocolo do texto, a um balão de fundo redondo de 20 mililitros, equipado com barra de agitação magnética e condensador de refluxo.

Em seguida, adicione zero vírgula zero seis mililitros de piperidina. E aqueça a mistura de reação a 80 graus Celsius por quatro horas. Após a reação ter esfriado até a temperatura ambiente, colete o precipitado resultante por filtração.

E lave com éter dietílico três vezes. Em seguida, adicione cem mililitros de éter dietílico ao sobrenadante. E colete o precipitado resultante por filtração.

Após lavar três vezes com éter dietílico, combine o precipitado com o sólido isolado da primeira filtração. Usando o computador, conectado a um sintetizador de DNA, insira a sequência de DNA desejada e o método de acoplamento. Siga as instruções do protocolo do fabricante.

Em seguida, monte a coluna contendo o vidro de fluxo controlado, que é modificado com um micromol da primeira face, no sintetizador. Agora, inicie a síntese no sintetizador de DNA. Após o processamento das fitas de DNA, adicione os reagentes apropriados conforme indicado no protocolo do texto ao alquino dietilado, amostra de DNA modificada.

Incube a amostra a 60 graus Celsius por uma hora e meia. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de 10 mililitros. Após o resfriamento à temperatura ambiente, adicione 150 microlitros de uma solução 0,05 molar de sal de cloreto de sódio de EDTA e 450 microlitros de uma solução 0,3 molar de acetato de sódio à amostra de DNA.

Em seguida, adicione 10 mililitros de etanol à amostra e mantenha-a a menos 32 graus Celsius por 16 horas. Em seguida, centrifugue a amostra por 15 minutos a mil vezes G. Quando terminar, remova o sobrenadante.

Lave o pellet de DNA resultante com dois mililitros de etanol a 80% frio. Em seguida, seque o pellet sob pressão reduzida utilizando um liofilizador. Purifique o pellet de DNA bruto por CLAE. Monitore a corrida verificando 260 nanômetros e 459 nanômetros para o corante um.

Ou 542 nanômetros para o corante dois. Colete as frações que apresentam absorção em ambos os canais de comprimento de onda. Para medições espectroscópicas de absorção de fita simples, registre uma medição em branco contendo apenas cloreto de sódio 200 milimolar e tampão de fosfato de sódio 50 milimolar.

Em seguida, transfira a solução de DNA1 previamente preparada para uma cubeta de vidro de quartzo de um centímetro. Registre a absorção. Em seguida, determine o valor máximo de absorção do corante.

Para medições de espectroscopia fluorescente de fita simples, registre uma medição em branco contendo apenas cloreto de sódio 200 milimolar e fosfato de sódio 50 milimolar, utilizando o comprimento de onda de excitação do Corante um. Em seguida, coloque a cubeta com a solução de DNA1 no espectrômetro. Registre o espectro de fluorescência.

Para realizar a medição da dupla fita por espectroscopia de fluorescência, coloque a cubeta com a solução da dupla fita de DNA1 e DNA2 no espectrômetro. Em seguida, registre o espectro de fluorescência utilizando o comprimento de onda de excitação do Corante um. Para obter uma melhor compreensão do que os espectros registrados estão mostrando, irradie as cubetas com lâmpadas de UV portáteis.

Observe a mudança na cor da fluorescência do DNA de fita simples para o DNA de dupla fita. Os espectros de absorção registrados mostram máximos em 465 nanômetros para o DNA de fita simples1 e 546 nanômetros para o DNA de fita simples2. A dupla fita hibridizada de DNA1 e DNA2 apresenta máximos em 469 e 567 nanômetros.

Os dois máximos de absorção apresentam um deslocamento bathocrômico. E as menores alterações espectroscópicas são resultado de interações excitônicas entre os corantes dentro da arquitetura do DNA de dupla hélice. Os espectros fluorescentes correspondentes exibem um máximo em 537 nanômetros para o DNA de fita simples1.

Em 607 nanômetros para o DNA de fita simples2. E em 615 nanômetros para o DNA hibridizado, dupla fita, de DNA1 e DNA2. O DNA de dupla fita de DNA1 e DNA2 mostra exclusivamente o máximo de emissão do Corante dois, embora o Corante um seja excitado seletivamente, o que evidencia que a transferência de energia ocorre de forma eficiente do Corante um para o Corante dois.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como modificar sinteticamente o DNA por meio de uma série de reações catalíticas entre uma fita de DNA marcada com alquino e um lado A.