Name: Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela Bacillus subtilis Strain (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a avaliar o efeito preventivo da cepa Bacillus subtilis BSB3 contra complicações do estresse térmico em ratos. Este protocolo flexível permite adaptações para diferentes vias de administração e compostos.

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Este trabalho foi apoiado pelo fundo FOP 101002-139294-2050 da Universidade de Auburn.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Auburn, Auburn, Alabama. 1. Preparação de Meios de Cultura, pratos e Cultura bacteriana <ol><li> Inocular 10 ml de caldo nutriente num frasco com uma única colónia de cultura BSB3 Bacillus subtilis, cultivadas durante a noite numa placa de agar nutriente. </li><li> Adicione 500 ml de meio de esporulação 19 (por litro: Bacto Caldo Nutriente, 8 g; 10% (w / v) de KCl, 10 mL; 1,2% (w / v), MgSO 4 x 7H 2 O, 10 mL; agar, 15 g) e autoclave a 121 ° C durante 20 min. Deixar arrefecer até 50 ° C e adicione as seguintes soluções estéreis: 1 M Ca (NO3) 2, 1 ml; 0,01 M de MnCl2, 1 ml; 1 mM de FeSO4, 1 ml. </li><li> Arrefecer meio preparado a 40 ° C durante 20 min à temperatura ambiente e verter em 25 ml de cada uma das 20 placas de Petri estéreis no gabinete estéril. Deixe o meio solidificar durante a noite. </li><li> Espalhe 0,5 ml da cultura durante a noite de Bacillus subtilis BSB3 sobre a superfície do meio em placas de Petri. Incubar a cultura a 37 ° C durante 5 dias até 90% a esporulação. Revelar esporos fase brilhante por microscopia de alta resolução. </li><li> bactérias colheita por adição de 1 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) para a placa de raspagem e bactérias a partir de uma superfície usando um espalhador de células estéril. Conserve a suspensão na geladeira até ser necessário. </li><li> Confirmar viabilidade das bactérias por plaqueamento de 0,1 ml de uma diluição adequada (10 -5 a 10 -6) de uma suspensão de bactérias em placas de meio de esporulação seguido de incubação durante 18 - 24 h a 37 o C. </li><li> Contagem das colónias bacterianas das placas utilizando um contador de colónias e calcular a título de bactérias na suspensão testado. Prepare suspensão bacteriana com a concentração final de 1 x 10 8 UFC / ml em PBS. </li></ol> 2. Os animais <ol><li> Usar 32 ratazanas macho Sprague-Dawley (250-300 g). Manter animais sob condições específicas isentos de agentes patogénicos com livre acesso a comida pellet padrão e água. Estabelecer uma temperatura média (21 ± 1 ° C), humidade (50 ± 5%) e um ciclo de luz-escuro de 12 h. </li></ol> 3. Design Experimental <ol><li> Iniciar o tratamento dos animais por sondagem oral de 11, após 2 dias de aclimatização. Use seringa com a agulha de gavagem oral. Trate 16 ratos com B. suspensão subtilis BSB3 (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo de B. subtilis). Tratar 16 ratos com PBS (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo PBS) (Figura 1). </li><li> Após o tratamento, subdivisão de cada grupo (8 ratos por grupo): Grupo 1- controle (PBS / sem estresse), Grupo 2- B. subtilis (B. subtilis / sem estresse), Grupo 3 tensão (PBS / estresse por calor) e Grupo B. 4- subtilis + estresse (B. subtilis estresse / calor). </li><li> Medir a temperatura rectal de cada rato usando um electronic termômetro digital. Manter os ratos dos grupos 1 e 2 à temperatura ambiente durante 25 min. Animais Local de grupos 3 e 4 em uma câmara climática a 45 o C e umidade relativa de 55% durante 25 min. </li><li> Em seguida, medir a temperatura rectal de cada rato em todos os grupos usando um termômetro digital eletrônico. Coloque todos os animais à temperatura ambiente durante 4 h. </li><li> Anestesiar ratos com isoflurano (2-4%) em um frasco selável anestesia e observar até os ratos são anestesiados profundamente (ausência de resposta ao aperto do dedo do pé). Euthanize ratos por decapitação rápida com uma guilhotina. </li><li> Recolha de sangue do tronco de cada rato 20 (15 - 16 ml) com as pipetas apirogénica apirogénica em tubos para se obter soro imediatamente e recolher amostras de sangue (7 ul) de cada rato com uma pipeta para exame microscópico. </li><li> Colocar os tubos com o sangue no frigorífico durante pelo menos 30 min para permitir a coagulação. Tubos de centrifugação a 20 ° C, 7,000 xg durante 10 min e rapidamenteremover o soro com uma pipeta. Soro alíquota obtidos a partir de cada rato em 50 volumes ul e armazenar a -20 ° C até ao ensaio. </li></ol> 4. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Cut / aparar todas as peles do abdômen e tórax do lado de baixo da carcaça com tesouras elétricas. Coloque a carcaça em um armário estéril e tratar a superfície raspada da carcaça com álcool a 70%. </li><li> Use um bisturi estéril para criar uma incisão na linha média do abdome. Remover fígado, nódulos linfáticos mesentéricos, baço e intestino delgado de cada rato usando uma pinça estéreis. </li></ol> 5. Análise de translocação bacteriana <ol><li> Coloque cada amostra de fígado, linfonodos mesentéricos e baço em tubos estéreis pré-pesado e pesar. Calcule o peso da amostra, tal como uma diferença entre o peso de um tubo com uma amostra e o peso de um tubo vazio. </li><li> Adicionar PBS estéril ao tubo para se obter uma diluição de 1:10 (w / v) da amostra e homogenhecer cada amostra com um homogeneizador de tecidos de vidro estéril para se obter uma suspensão homogénea de 21. </li><li> Fazer diluições em série (10 -1 a 10 -4) de cada amostra em PBS estéril. Placa de 0,1 ml de todas as diluições de todos os tecidos sobre a superfície de MacConkey e de 5% de agar de sangue e de agar de sangue de Brucella com hemina (0,005 g / L) e vitamina K1 (0,01 g / L) placas. </li><li> Incubar MacConkey de e 5% ágar sangue aerobicamente e Brucella placas de agar de sangue em condições anaeróbias a 37 o C 22. </li><li> Contagem das colónias de bactérias aeróbias, após 24 horas, e as colónias de bactérias anaeróbicas após 48 horas de incubação utilizando um contador de colónias. Expressar os resultados como o número de unidades formadoras de colónias (CFU) em um grama de tecido. </li></ol> 6. Análise histológica <ol><li> Retirar amostras do intestino delgado de cada rato pelo procedimento cirúrgico (passos 4,1-4,2). Fix amostras em fixador de Bouin, incorporar em parafina,preparar 6 mm seções e seções mancha com hematoxilina e eosina utilizando procedimentos padrão 23. </li><li> Use um sistema de microscópio de alta resolução para medição da altura das vilosidades intestinais e espessura total da mucosa em cada amostra (ampliação 100X) 24. Analise 4 amostras de cada rato e fazer pelo menos vinte medições em cada amostra. Expressar os resultados em micrômetros. </li></ol> 7. citocinas Assay <ol><li> Use kits de rato comerciais ELISA para IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ, e IL-10 para medir os níveis de citocinas no soro de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Gerar curvas padrão para cada conjunto de amostras testadas usando padrões para o kit relevante. Definir o nível de citocinas em cada amostra por comparação dos dados experimentais com a curva padrão apropriada. </li></ol> 8. Lipopolissacarídeo Assay <ol><li> Analisar nível de LPS no soro utilizando um kit de rato de LPS de acordo com ELISAo protocolo do fabricante. Estimar a concentração de LPS em amostras por comparação dos valores obtidos com os valores da curva padrão. </li></ol> 9. alta resolução Microscopia de Luz de Sangue <ol><li> Usar o sistema de microscópio descrito anteriormente 25,26. Use uma plataforma de isolamento de vibração como uma base para o sistema de microscópio e câmera de vídeo e de computador 25 para gravar as imagens ao vivo. Calibrar imagens de teste usando uma lâmina de Richardson como descrito anteriormente 27. </li><li> Coloque 7 l de sangue recentemente retirada de cada rato em uma lâmina de vidro, lamela, fotografar e gravar dez quadros de imagem de 72 × 53,3 mm 2 em cada amostra (ampliação 1,700X). </li><li> Medir a concentração de vesículas usando software que fornece imagens ópticas com vista directa de alta resolução em tempo real. Examine um mínimo de 20 quadros de imagem para cada condição experimental 28. </li></ol> 10. Statistiques <ol><li> Expresso de todos os valores como média e desvio padrão. Realizar a análise estatística e plotagem gráfico. Analisar os resultados obtidos com o teste t de duas amostras, definir o nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A exposição a resultados de alta temperatura em condições graves de saúde 29. Prevenção e detecção precoce de complicações relacionadas ao estresse por calor são de importância vital 30. O protocolo apresentado pode ser usado para avaliar a eficácia de várias abordagens para a prevenção do stress térmico efeitos adversos. Passos críticos dentro deste protocolo incluem: o processo de tratamento de calor (45 ° C, 25 min); a utilização de mate...

Diferentes estressores afetam a saúde humana e animal. A temperatura é um dos fatores mais estressantes, causando doenças crônicas, agudas e até letais1. Alterações na morfologia intestinal e perda da integridade da barreira intestinal após estresse térmico foram documentadas em muitos casos2,3. Essa barreira protetora é responsável pela defesa contra a translocação de bactérias intestinais e suas toxinas, em particular os lipopolissacarídeos (LPS), do lúmen para a circulação interna4,5. A estabilidade da microbiota intestinal influencia significativamente a função da barreira intestinal, a resposta imune do hospedeiro e a tolerância às condições de estresse6. Assim, a modulação da microbiota intestinal pode fornecer uma nova abordagem para a prevenção de efeitos adversos relacionados ao estresse. 
As bactérias benéficas têm sido utilizadas como uma estratégia promissora para modificar a microbiota intestinal para o tratamento bem-sucedido de várias condições clínicas, como diarreia, doença inflamatória intestinal, dermatite atópica, distúrbios metabólicos7-10. Os efeitos probióticos das bactérias benéficas incluem a produção de metabólitos essenciais para apoiar a saúde intestinal, estimulação do sistema imunológico, promoção da tolerância à lactose, restauração da disfunção epitelial. Os probióticos foram eficazes na prevenção das complicações relacionadas ao estresse in vitro e em modelos animais11,12. 
Os pesquisadores deram mais atenção às bactérias Bacillus como probióticos porque essas bactérias suportam a homeostase intestinal13 e têm efeitos benéficos no hospedeiro14. Nossos dados anteriores demonstraram alta eficácia dos probióticos Bacillus contra patógenos in vitro15,16 e em ensaios clínicos17,18. Aqui, pretendemos avaliar o efeito preventivo da cepa BSB3 de B. subtilis contra complicações após estresse térmico.

<table><tbody><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico</td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT, EUA&nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar</td><td>VWR</td><td>97064-334</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar MacConkey</td><td>VWR</td><td>470180-742</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar sangue 5%</td><td>VWR</td><td>89405-024</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ágar sangue Brucella com hemin e vitamina K</td><td>VWR</td><td>89405-032</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s Fixative</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>15990</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 Rat ELISA kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0101</td><td></td></tr><tr><td>IL-1beta Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0011</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0061</td><td></td></tr><tr><td>INF-gamma Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td></td><td></td>KRC4021</tr><tr><td>Kit ELISA de rato TNF-alfa</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, EUA</td><td>Kit ELISA LPS de</td> rato KRC3011 <td></td></tr><tr><td></td><td>NeoBioLab, MA, EUA</td><td>Câmara Ambiental RL0275</td><td></td></tr><tr><td>6020-1</td><td>Caron, Marietta, OH, EUA</td><td>Centrífuga 6020-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Indianápolis, IN, EUA</td> Sistema óptico de microscópio óptico <td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light</td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de colônias</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA</td><td>RE-3325</td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Haier, Brooklyn, NY, EUA</td><td>HCMO50LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra microplaca leitor</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx 808</td><td></td></tr><tr><td>Auto Strip Washer</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx50</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Gilson, Pipetman, França</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Incubadora</td><td>Shaker New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA</td> Classic <td>C24</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker&nbsp;</td><td>Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, Sanford, ME, USA</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultivo de cultura</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY, USA</td><td>4995</td><td>Frascos Erlenmeyer PYREX 250 ml</td></tr><tr><td>Espectrômetro óptico Genesys 20</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Sony DXC-33 Câmera de vídeo</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Richardson lâmina de teste</td><td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA</td><td>80303</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água Millipore</td><td></td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus software</td><td>Media Cybernetics, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple Beam Balance</td><td>OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos, Dounce</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr></tbody></table>

prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela<em&gt; bacillus subtilis</em&gt; strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Este estudo foi desenhado para avaliar o efeito protetor da estirpe Bacillus subtilis contra as complicações relacionadas ao estresse térmico. Trinta e dois ratos Sprague-Dawley foram usadas neste estudo. Os animais foram tratados por via oral duas vezes por dia durante dois dias com B. subtilis estirpe BSB3 ou PBS. No dia seguinte, após o último tratamento, cada grupo foi dividido e dois grupos experimentais (tratados com um PBS e tratadas com um B. subtilis) foram colocados a 45 ° C durante 25 min. Dois grupos de controlo permaneceu por 25 min à temperatura ambiente. Todos os ratos foram sacrificados e diferentes parâmetros foram analisados ​​em todos os grupos. Os efeitos adversos do estresse por calor são registrados pela diminuição da altura das vilosidades e espessura total da mucosa do epitélio intestinal; translocação de bactérias a partir do lúmen; vesiculação aumento de eritrócitos e elevação dos lipopolissacáridos (LPS) de nível no sangue. A eficácia protectora do tratamento é avaliada por prévenção destes efeitos secundários. O protocolo foi definido acima para o tratamento oral de ratos com bactérias para a prevenção de complicações de stress de calor, mas este protocolo pode ser modificado e utilizado para outras vias de administração e para a análise de compostos diferentes.

A temperatura corporal médio dos animais antes e imediatamente após o estresse térmico foi de 36,7 ± 0,07 o C e 40,3 ± 0,17 o C, respectivamente (P &lt;0,05). A exposição de ratos a calor (grupo 3), resultou na inibição significativa da altura das vilosidades da mucosa e espessura total (Figuras 2, 3). A administração oral de tensão BSB3 antes protegidos estresse intestino do efeito nocivo do calor. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

Descrevemos um protocolo para prevenção dos efeitos do estresse térmico em ratos por pré-tratamento oral com bactérias benéficas. Este protocolo pode ser modificado e usado para várias vias de administração e para análise de diferentes compostos.

Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar o efeito preventivo da linhagem B.subtilis BSB3 contra complicações após estresse térmico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na prevenção de efeitos adversos decorrentes do estresse térmico. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada para avaliar diferentes abordagens para mitigar as complicações do estresse térmico.Demonstrando este procedimento estarão Ludmila Globa e Oleg Pusovyy, pesquisadores associados do nosso laboratório. Para começar, com uma única colônia de Bacillus subtilis BSB3 que foi cultivada durante a noite em uma placa de ágar nutriente.Inocule dez mililitros de caldo nutriente em um frasco. Incube a cultura durante a noite a 37 graus Celsius. Prepare 500 mililitros de meio de esporulação de acordo com a receita mostrada aqui.E autoclavar a 121 graus Celsius por 20 minutos. Deixe o meio esfriar até 50 graus Celsius antes de adicionar as seguintes soluções estéreis. Em um gabinete estéril, deixe o meio preparado esfriar à temperatura ambiente até 40 graus Celsius por 20 minutos.E despeje 25 mililitros em cada uma de 20 placas de Petri estéreis. Deixe o meio solidificar durant

prevention-heat-stress-adverse-effects-rats-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Fonte: Sorokulova, I., et al. Prevenção de efeitos adversos do estresse térmico em ratos por cepa de Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra ratos pré-tratados com bactérias benéficas ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostos ao estresse térmico para avaliar a integridade da barreira intestinal. Menos colônias bacterianas derivadas do intestino do fígado de ratos tratados, em contraste com numerosas colônias em ratos controle, indicam uma barreira epitelial...

Avaliando o efeito de bactérias benéficas na translocação microbiana intestinal em ratos estressados pelo calor

Fonte: Sorokulova, I., et al. Prevenção dos Efeitos Adversos ao Estresse Térmico em Ratos pela Cepa Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo apresenta análises histológicas e de microscopia hematológica usadas para avaliar os efeitos protetores do Bacillus subtilis em ratos expostos ao estresse térmico.

Análises histológicas e hematológicas para avaliar os efeitos do Bacillus subtilis em ratos sob estresse térmico

Neste vídeo, descrevemos um protocolo passo a passo para estudar a insolação por esforço (EHS) em um modelo de camundongo.

Modelo de camundongo com insolação por esforço: um protocolo para estudar os mecanismos subjacentes à insolação por esforço

Apresentamos um protocolo para induzir e detectar CMHs causadas pela injeção de LPS em ratos Sprague-Dawley, que pode ser utilizaram no futuro pesquisa investigações na patogênese do CMHs.

Subaguda Microhemorrhages Cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos

Aqui, descrevemos o protocolo e a implementação de metil-Seq, uma plataforma de epigenomic, usando um modelo do rato para identificar alterações epigenéticas associadas com exposição de estresse crônico. Os resultados demonstram que a plataforma de metil-Seq rato é capaz de detectar diferenças de metilação que surgem a partir da exposição de estresse em ratos.

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

O protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo padronizado, repetível e pré-clínico de insolação exercional (EHS) em camundongos livres de estímulos externos adversos, como choque elétrico. O modelo fornece uma plataforma para estudos mecanicistas, preventivos e terapêuticos.

Um modelo pré-clínico de insolação exercional em camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer o modelo de camundongo com colite induzida por sódio com sulfato de dextrano livre de germes induzido por antibióticos para investigar o papel da microbiota intestinal na regulação dos efeitos positivos do Bacillus cereus na colite.

Investigando os efeitos aliviadores da administração de Bacillus cereus na colite por meio da modulação da microbiota intestinal

Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um modelo de estresse leve imprevisível crônico (CUMS) para depressão baseado na teoria médica mongol, juntamente com métodos para validar testes comportamentais.

Estresse Leve Imprevisível Crônico em Ratos com base na medicina mongol

Aprenda a avaliar o efeito preventivo da cepa Bacillus subtilis BSB3 contra complicações do estresse térmico em ratos. Este protocolo flexível permite adaptações para diferentes vias de administração e compostos.

Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela

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