Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela Bacillus subtilis Strain

Descrevemos um protocolo para prevenção dos efeitos do estresse térmico em ratos por pré-tratamento oral com bactérias benéficas. Este protocolo pode ser modificado e usado para várias vias de administração e para análise de diferentes compostos.

O objetivo geral deste experimento é avaliar o efeito preventivo da cepa B.subtilis BSB3 contra complicações após estresse térmico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na prevenção de efeitos adversos do estresse térmico. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para avaliar diferentes abordagens para mitigar as complicações do estresse térmico.

Demonstrando este procedimento estará Ludmila Globa. E Oleg Pusovyy, pesquisadores associados de nosso laboratório. Para começar, com uma única colônia de Bacillus subtilis BSB3 que foi cultivada durante a noite em uma placa de ágar nutriente.

Inocular dez mililitros de caldo nutritivo em um frasco. Cultive a cultura durante a noite a 37 graus Celsius. Prepare 500 mililitros de meio de esporulação de acordo com a receita mostrada aqui.

E autoclave a 121 graus Celsius por 20 minutos. Deixe o meio esfriar a 50 graus Celsius antes de adicionar as seguintes soluções estéreis. Em um gabinete estéril, resfrie o meio preparado em temperatura ambiente a 40 graus Celsius por 20 minutos.

E despeje 25 mililitros em cada uma das 20 placas de Petri estéreis. Deixe o meio solidificar durante a noite. Em seguida, espalhe 0,5 mililitros da cultura noturna de Bacillus subtilis BSB3 na superfície das placas do meio de esporulação.

Incubar as placas a 37 graus Celsius por cinco dias até 90% de esporulação. Em seguida, use microscopia de alta resolução para verificar se há esporos de fase brilhante. Para colher as bactérias, adicione um mililitro de PBS às placas e use um espalhador de células estéreis para raspar as bactérias da superfície.

Armazene a suspensão a quatro graus Celsius até que seja necessário. Confirme a viabilidade da bactéria plaqueando 0,1 mililitro da diluição apropriada de uma suspensão bacteriana em placas de meio de esporulação e incube a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas. Use um contador de colônias para contar as colônias bacterianas e calcular o título de bactérias na suspensão testada.

Em seguida, prepare uma suspensão bacteriana em PBS a uma concentração final de um vezes dez elevado a oitavo UFC por mililitro. Depois de tratar ratos por gavagem oral com B. subtilis BSB3 ou PBS por dois dias, depois subdividir os animais e medir sua temperatura, manter os ratos dos grupos um e dois em temperatura ambiente por 25 minutos. Coloque os animais dos grupos três e quatro em uma câmara climática a 45 graus Celsius e 55% de umidade relativa por 25 minutos.

Após a medição da temperatura retal de cada rato, colocar todos os animais à temperatura ambiente durante quatro horas. Em seguida, após a eutanásia dos animais, coleta do sangue do tronco e isolamento dos órgãos de acordo com o protocolo de texto, coloque cada amostra de órgão em tubos estéreis pré-pesados e pese. Adicione PBS estéril a cada tubo para obter uma diluição de um a dez pesos por volume da amostra e use um homogeneizador de tecido de vidro estéril para gerar suspensões de tecido homogêneo.

Em seguida, use PBS estéril para fazer diluições em série de cada amostra. Em seguida, coloque 0,1 mililitros de todas as diluições na superfície de MacConkeys e ágar 5% de sangue. E ágar sangue brucela com hemina e vitamina K1. Depois de incubar as placas, use um contador de colônias para contar as colônias em cada grupo de placas.

Expresse os resultados como o número de unidades formadoras de colônias, ou UFCs, por grama de tecido. Depois de preparar e colorir seções do intestino delgado de acordo com o protocolo de texto, use um microscópio de alta resolução para medir as vilosidades intestinais e a espessura total da parede da mucosa. Analise pelo menos quatro amostras de cada rato e faça pelo menos 20 medições em cada amostra.

Para realizar microscopia de luz de alta resolução de amostras de sangue, use a plataforma de isolamento de vibração como base para o sistema de microscópio com câmera de vídeo e computador para gravar imagens ao vivo. Depois de calibrar as imagens de teste de acordo com o protocolo de texto, coloque sete microlitros de sangue recém-coletado de cada rato em uma lâmina de vidro e adicione uma lamínula. Em seguida, fotografe e registre dez quadros de imagem de 72 por 53,3 micrômetros quadrados em cada amostra.

Finalmente, usando um software que fornece imagens ópticas de visão direta de alta resolução em tempo real, meça a concentração de vesículas. A temperatura corporal média dos animais antes e imediatamente após o estresse térmico foi de 36,7 graus Celsius para mais ou para menos e 40,3 graus Celsius para mais ou para menos 0,17 graus Celsius, respectivamente. A exposição de ratos ao calor resultou em inibição significativa da altura das vilosidades e da espessura total da mucosa.

No entanto, o tratamento com a cepa BSB3 antes do estresse protegeu o intestino do efeito nocivo do calor. Para a translocação de bactérias do intestino, foram analisados linfonodos mesentéricos, fígado e baço. Conforme ilustrado aqui, as bactérias foram isoladas em uma concentração de 1,7 vezes dez elevado a três mais ou menos 4,6 vezes dez elevado a duas UFC por grama de tecido apenas em amostras de linfonodos mesentéricos e fígado de ratos tratados com PBS expostos ao calor.

Por outro lado, todas as amostras testadas de animais controle e estressados pelo calor que receberam a cepa BSB3 foram estéreis. Nenhuma alteração nos níveis de citocinas IL 1beta, IL-6, TNFalfa ou interferon gama foi registrada em ratos estressados pelo calor. No entanto, os níveis de IL-10 e LPS foram elevados nos animais tratados com PBS antes do tratamento térmico.

Portanto, o pré-tratamento com B. subtilis BSB3 impediu o aumento de IL-10 e LPS no soro após o tratamento térmico. Finalmente, um aumento significativo na concentração de vesículas livres foi encontrado no sangue de ratos que receberam PBS antes do estresse térmico, mas não nos animais tratados com BSB3. É importante lembrar de usar materiais pirogênicos para coleta de sangue e precisão para manter os líquidos séricos a menos 20 graus Celsius com congelamento e descongelamento repetidos, e seguir um procedimento estéril durante a análise da translocação bacteriana.

Seguir este procedimento, como a administração de bactérias após o estresse térmico, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais sobre complicações do estresse térmico.