Name: Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Sincronização de condições maternas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprenda a medir o tempo de sobrevivência em rotíferos Brachionus para pesquisa de envelhecimento, sincronizando condições maternas. Este método reprodutível oferece alta potência estatística e mitiga efeitos maternos.

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Somos gratos a George Jarvis, Martha Bock, e Bette Hecox-Lea, Laboratório de Biologia Marinha, por sua ajuda na filmagem.

1. Preparação de Mídia Nota: Use meio diluída Brujewicz água do mar artificial da salinidade 16,5 ppt (PSU). Outros seawaters artificiais também são frequentemente usados ​​para cultura Brachionus rotíferos 25,26. <ol><li> Adicionar NaCl a 454 mM, 26 mM de MgCl2, 27 mM de MgSO4, 10 mM de KCl e 10 mM de CaCl 2 a 4,5 L de água destilada (volume final será de 5 L). Em alternativa, usar água de diluição desionizada em vez de água destilada. Adicionar CaCl2 depois de se dissolverem todos os outros sais. </li><li> Prepare o M NaHCO solução 0,48 3 estoque (concentração de 200x). Adicionar 25 ml de solução para o acima. A concentração final de NaHCO 3 é de 2,4 mm. </li><li> Preparar a solução stock M NaBr 0,4 (concentração 500x). Adicionar 10 ml da solução para o acima. A concentração final de NaBr é de 0,8 mm. Perfaz-se 5 L com água destilada. </li><li> Filtra-se a solução com um filtro de membrana de 0,45 um.Diluir duas vezes com água estéril antes da sua utilização (v / v). Nota: É possível fazer uma concentração 2x de Brujewicz água do mar artificial como uma solução estoque. </li></ol> 2. Condições Gerais Cultura <ol><li> laboratório-raise Cultura ou rotíferos selvagens-capturado em um copo de 100 ml estéril entre 20 e 30 ° C. As temperaturas mais elevadas resultam em expectativa de vida mais curtos e reprodução acelerada. Usar 25 ° C para a conveniência dos experimentos. A densidade de rotíferos ou o volume de água do mar artificial não é um grande problema aqui. </li><li> Cultura espécies de microalgas alimentares em água do mar artificial 11. Veja Snell et al. (2014) para mais detalhes 11. Tipicamente, usar Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 células / ml) 27,28, T. suecica (~ 6 x 10 5 células / mL), 25,29 e Nannochloropsis oculata (~ 7 X 10 6 células / ml 30,31). Uma vez que dieta algas (espécies, Condit culturaíons, composições bioquímicas) influencia significativamente o tempo de sobrevivência de rotíferos Brachionus, use o mesmo lote de microalga em todos os grupos experimentais. </li><li> Manter uma população de ações de rotíferos em uma cultura em lote através da alimentação e mudando media ocasionalmente (por exemplo, alimentar a cada 2 dias e inocular todas as semanas). Muitos recém-nascidos e adultos portadores de 2-3 ovos pode ser observado quando rotíferos estão em condições óptimas. Nota: Uma forma alternativa de obter rotíferos experimentais é para chocar ovos de repouso. Rotíferos eclodidos de ovos de repouso são considerados para ser bem sincronizados, e o seu tempo de vida não é significativamente diferente da de rotíferos eclodidos de ovos amictic 11. No entanto, rotíferos de ovos que descansam iniciar a reprodução mais cedo do que os de ovos amictic. Assim, é necessária cautela para medições de suas características reprodutivas. </li></ol> 3. Sincronização de rotíferos pelo Pré-cultura <ol><li> Selecione um único rotíferos do stpopulação e cultura ock como descrito no 2,1-2,3 para estabelecer uma sub-população que vai ser utilizado para experiências. Normalmente cultura durante duas semanas. </li><li> Recolha rotíferos portadores de ovos da sub-população (a cobrar o dobro do número de indivíduos que serão utilizados para o experimento). Cultura-los como uma única coorte (densidade: ~ 50 indivíduos / mL) em uma placa de cultura de 6 poços, como descrito no 2,1-2,3 no estado fresco de comunicação sob alimentação ad libitum. Controlando a densidade de população é importante porque o meio condicionado afecta a fisiologia reprodutiva de rotíferos Brachionus 32,33. </li><li> Transferir recém-nascidos nascidos de primeiros ovos dos adultos para meios de cultura recém-preparado. Repita este procedimento ao longo de 2-3 gerações. </li><li> Use neonatos nascidos dentro de um determinado período de tempo (por exemplo, &lt;3 h) para medir o tempo de sobrevivência. Para evitar um possível viés na seleção do único indivíduo, embora muito improvável, verificar a reprodutibilidade usando vários independentes sub-populações. Nota: Como rotíferos normalmente se reproduzem assexuadamente sob esta condição, garantir que não haja homens estão presentes durante todo o experimento. Os machos são menores do que recém-nascidos e, normalmente, se mover mais rápido do que as fêmeas. Fêmeas Mictic têm diferentes tempos de vida das fêmeas amictic sob certas condições 29. </li></ol> 4. Medições de Tempo de Sobrevivência <ol><li> neonatos lugar em placas de plástico (tipicamente de 24 ou 48 poços placas, com cada uma das cavidades contendo 1 ml de água do mar artificial). </li><li> Em intervalos de 24 horas, transferir os rotíferos aos meios de cultura recém-preparados ou em intervalos de 12 horas, se a temperatura mais elevada (acima de 30 ° C ou). Grave o número de filhos e se cada indivíduo está vivo ou morto. Grave o rotíferos como morto quando o movimento dos cílios da corona parou completamente. Nota: Rotíferos muitas vezes atribuem às paredes laterais das cavidades. pipetagem suave da água ajuda a encontrá-los. Se rotíferos não são encontrados ou are acidentalmente danificado pelo pipetagem, gravá-las como &quot;censurado&quot;, não como &quot;morto&quot;. </li><li> Remover neonatos quando rotíferos experimentais estão reproduzindo ativamente. Os recém-nascidos crescem rapidamente e às vezes é difícil distingui-los dos rotíferos experimentais. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Criar a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier (Figuras 1 e 2) através da representação gráfica taxa de sobrevivência cumulativa no eixo Y e o tempo no eixo x. Esta é a representação mais comum de dados de sobrevivência. Use o teste de log-rank não paramétrico (também chamado de teste de Mantel-Cox) para comparação estatística de tempo de sobrevivência 34. O teste de log-rank também está incluído em outros pacotes estatísticos padrão, tais como JMP e R. Nota: Não use t-teste ou análise de variância (ANOVA), seguido de comparação múltipla paramétrico Student porque distribuição normal geralmente não é encontrado por dados de sobrevivência 35. Além disso, estes metods não levam indivíduos censurado em conta. Mann-Whitney U Test pode ser usada se não houver dados censurados. </li></ol>

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<li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O actual protocolo descreve um método para medir o tempo de sobrevivência em rotíferos Brachionus. O passo crítico é a sincronização das condições de rotíferos ao longo de várias gerações. Quando rotíferos experimentais são bem sincronizados, um tipo de curva típica I sobrevivência é observada com muito pouco mortalidade precoce como relatado em vários estudos anteriores 18,24,37,38. desvios-padrão de seu tempo de sobrevivência, portanto, tornam-se menores em comparação com rotíferos sincronizados ma...

Rotíferos são microscópicos cosmopolita zooplâncton (&lt;1 mm), que constituem o filo rotifera 1. Eles têm um plano de corpo simples composto por cerca de 1000 células somáticas, bem como um dispositivo de roda-ciliar como característica chamada coroa, que é usado para locomoção e de alimentação. A maioria dos rotíferos pertencem a classes monogononta ou bdelloidea, que contêm cerca de 1.600 e 500 espécies, respectivamente 2. Rotíferos monogononta geralmente têm duas fases reprodução sexuada e assexuada (partenogênese cíclico), enquanto rotíferos bdelloid reproduzir por partenogênese obrigatória 3. É, assim, possível a obtenção de indivíduos geneticamente idênticos rotíferos, o que assegura uma elevada reprodutibilidade em experiências. Além disso, eles têm várias outras vantagens como organismos modelo, tal como um tempo de vida curto, facilidade de cultura, a disponibilidade de dados de sequências genómicas e transcriptomic 4-7, e uma posição filogenética a partir de uma única distanterthropods 8 e nemátodos. Rotíferos são, portanto, prometendo modelos de invertebrados em ecológica, toxicológicas e envelhecimento estudos 9-12. O tempo de sobrevivência sob a exposição ao stress ambiental ou produtos químicos é um parâmetro frequentemente medida nestes campos de pesquisa 13-19. No entanto, é preciso ter cuidado quando se mede o tempo de sobrevivência de rotíferos porque é suscetível às condições ambientais de suas mães. Ou seja, no monogononta Manjavacas rotíferos Brachionus, descendentes do sexo feminino a partir de mães com idade têm uma vida útil mais curta do que os de mães jovens; no entanto, a restrição calórica materna (CR) compensa parcialmente os efeitos deletérios da avançada idade materna 20. Em B. plicatilis, CR materno proporciona longevidade prole, o tempo de sobrevivência muito tempo sob fome e de resistência ao estresse oxidativo alta associada com a expressão aumentada de enzimas antioxidantes 21,22. O efeito da idade maternaTambém tem sido observado em rotíferos bdelloid 23. Portanto, as condições de rotíferos experimentais devem ser cuidadosamente sincronizada ao longo de várias gerações antes das medições do tempo de sobrevivência. Aqui nós fornecemos um protocolo para a medição do tempo de sobrevivência em rotíferos Brachionus seguinte sincronização das condições de cultivo ao longo de várias gerações. Jejum intermitente (IF), uma variação do CR onde rotíferos são alimentados periodicamente, foi aplicado para revelar o efeito de sincronização devido aos efeitos conhecidos de SE na longevidade 22,24.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Wako</td><td>190-13921</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Wako</td><td>136-03995</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Wako</td><td>131-00427</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Wako</td><td>168-22111</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Wako</td><td>035-00455</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de sódio</td><td>Wako</td><td>190-01515</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de membrana (0.45 &micro; m tamanho dos poros)</td> Placa <td>de cultura de HAWP04700</td><td></td> <td>Millipore</td></tr><tr><td>, 6 poços, não tratada</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D01</td> Placa de cultura de <td>fundo plano</td></tr><tr><td>, 48 poços, não tratada</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D07</td><td>Tetraselmis de fundo plano</td></tr><tr><td>, Living</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>152610</td><td></td></tr><tr><td>PRISM 6</td><td>GraphPad Software</td><td>Versão 6.0d</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of survival time in<em&gt; brachionus</em&gt; rotifers: sincronização de condições maternas

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Os rotíferos são zooplânctons microscópicos cosmopolitas usados como modelos em estudos ecotoxicológicos e de envelhecimento devido às suas diversas vantagens, como vida útil curta, facilidade de cultivo e partenogênese que permite a cultura clonal. No entanto, é necessário cautela ao medir seu tempo de sobrevida, pois é afetado pela idade materna e pelas condições de alimentação materna. Aqui, fornecemos um protocolo para medição poderosa e reprodutível do tempo de sobrevivência em rotíferos de Brachionus após uma sincronização cuidadosa das condições de cultivo ao longo de várias gerações. Empiricamente, a má sincronização resulta em mortalidade precoce e diminuição gradual da taxa de sobrevida, resultando em fraco poder estatístico. De fato, sob tais condições, a restrição calórica (RC) não conseguiu prolongar significativamente a vida útil de B. plicatilis, embora a longevidade induzida por RC tenha sido demonstrada com amostras de rotíferos bem sincronizadas em estudos anteriores e atuais. Este protocolo é provavelmente útil para outros modelos de invertebrados, incluindo a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster e o nematóide Caenorhabditis elegans, porque os efeitos da idade materna também foram relatados nessas espécies.

A Figura 1 mostra as curvas de sobrevida representativas de populações mal sincronizados (de duas repetições). Neste experimento, os rotíferos ou eram todos os dias Fed [ad libitum grupo (AL)] ou em dias alternados (IF grupo). A sobrevida média foi de 13 e 18 dias na AL e se os grupos, respectivamente. Embora seja bem sabido que se estende a vida útil do rotíferos, esta experiência não conseguiu detectar uma diferença estatisticamente significativa entre a...

Os rotíferos são zooplânctons microscópicos usados como modelos em estudos ecotoxicológicos e de envelhecimento. Aqui, fornecemos um protocolo para medição poderosa e reprodutível do tempo de sobrevivência em rotíferos de Brachionus. A sincronização das condições de cultura ao longo de várias gerações é de particular importância porque a condição materna afeta a história de vida da prole.

Measurement of Survival Time in<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotifers: Sincronização de condições maternas

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

O objetivo geral deste procedimento é medir com precisão o tempo de sobrevivência de rotíferos do gênero Brachionus, compensando possíveis efeitos deletérios das gerações maternas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na pesquisa sobre envelhecimento.Ao fornecer uma maneira confiável de medir o tempo de sobrevivência de rotíferos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é reproduzível e possui alto poder estatístico. Para começar, adicione a 4,5 litros de água de diluição destilada ou deionizada 454 milimolares de cloreto de sódio, 26 milimolares de cloreto de magnésio, 27 milimolares de sulfato de magnésio, 10 milimolares de cloreto de potássio e 10 milimolares de cloreto de cálcio.Prepare uma solução estoque de bicarbonato de sódio 0,48 molar. E adicione 25 mililitros dela à solução salina recém-preparada. Prepare uma solução estoque de brometo de sódio 0,4 molar.E adicione dez mililitros dele à solução salina. Em seguida, com água destilada, complete o volume da solução salina até cinco litros. E, utilizando uma membrana de filtro de 0,45 micrômetro, filtre a solução.Para cultivar rotíferos criados em laboratório ou capturados na natureza, coloque-os em um béquer estéril de 100 mililitros contendo água do mar artificial e cultive-os a 25 graus Celsius. De acordo com os métodos de Snell, cultive espécies de microalgas dietéticas em água do mar artificial.Certifique-se de que o mesmo lote de microalgas seja usado em todos os grupos experimentais. Mantenha uma população estoque de rotíferos em cultivo descontínuo, alimentando-os a cada dois dias e trocando o meio semanalmente.Muitos neonatos e adultos com dois a três ovos podem ser observados quando os rotíferos estão em condições ideais. Para sincronizar os rotíferos por meio de pré-cultivo, selecione um único rotífero da população estoque e cultive-o em água do mar artificial em um béquer de 100 mililitros, conforme descrito anteriormente, por cerca de duas semanas.Após a incubação, colete rotíferos portadores de ovos da subpopulação. Cultive-os como uma única coorte colocando aproximadamente 50 rotíferos por mililitro de água do mar nas cavidades de uma placa de seis poços e alimente-os ad libitum. Quando os ovos eclodirem, transfira os neonatos para meio de cultura recém-preparado.Repita o cultivo e a transferência de neonatos por duas a três gerações. Para medir o tempo de sobrevivência, coloque neonatos eclodidos dentro de um período de três horas nos poços de placas de 24 ou 48 poços contendo um mililitro de água do mar artificial. Em intervalos de 12 ou 24 horas, transfira os rotíferos para meio de cultura recém-preparado.Registre o número de descendentes e se cada indivíduo está morto ou vivo. Considere o rotífero como morto quando o movimento ciliar da coroa tiver parado completamente. Quando os rotíferos experimentais estiverem se reproduzindo ativamente, remova os neonatos, pois eles crescem rapidamente e às vezes são difíceis de distinguir dos rotíferos experimentais.Realize a análise dos dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra curvas de sobrevivência de duas réplicas de populações de rotíferos mal sincronizadas. Alimentadas ad libitum, indicadas como A-L, ou em dias alternados, indicadas como Jejum Intermitente, J-I.A sobrevida mediana foi de 13 e 18 dias, respectivamente, nos dois grupos. Embora seja bem conhecido que o jejum intermitente prolonga a longevidade do rotífero, as diferenças não foram estatisticamente significativas. Neste experimento, as condições dos rotíferos foram ótimas e bem sincronizadas.E os animais tenderam a sobreviver até a fase posterior do experimento. A sobrevida mediana foi de 13 dias para os rotíferos AL e de 20 dias para os grupos IF, o que foi estatisticamente significativo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sincronizar as condições de rotíferos. Esperamos que este protocolo aprimore o uso de rotíferos aditivos, do organismo modelo e da pesquisa sobre envelhecimento.

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Research

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Biology

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Aprenda a medir o tempo de sobrevivência em rotíferos Brachionus para pesquisa de envelhecimento, sincronizando condições maternas. Este método reprodutível oferece alta potência estatística e mitiga efeitos maternos.

Measurement of Survival Time in

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