Name: Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a purificação, marcação por spin dirigida e reconstituição de canais iônicos pentaméricos para estudos de RPE. Este protocolo permite analisar a dinâmica de proteínas de membrana em ambientes fisiologicamente relevantes.

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Estamos muito gratos aos membros atuais e antigos do laboratório Chakrapani para leitura crítica e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção (1R01GM108921) e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 12SDG12070069) e SC.

Os autores não têm nada a divulgar.

espectroscopia EPR tem provado ser uma abordagem estrutural inigualável em quantificar mudanças conformacionais em proteínas de membrana em um ambiente quase nativo. Esta abordagem permite-nos uma espiada nos detalhes moleculares da dinâmica de proteínas que são obscurecidos em estruturas de alta resolução a partir de cristalografia de raios X e microscopia Cryo-elétron. No entanto, é importante considerar as limitações técnicas dessa abordagem que possa afetar a aplicabilidade geral para outros sistemas e também para m...

Durante a última década, a compreensão estrutural dos canais iónicos dependentes de ligando pentaméricos (pLGIC) tem crescido nos trancos e barrancos, devido a multidões de estruturas de alta resolução de vários membros da família. Principais fatores que levaram aos avanços atuais no campo incluem a descoberta de canais pLGIC procariotas, 1-3 grandes avanços na expressão de proteína de membrana eucariótica, 4-6 e avanços tremendos em abordagens de determinação de estrutura. 7 Estas estruturas proporcionam um consenso claro sobre a conservação geral da arquitectura tridimensional de pLGIC. No entanto, duas grandes áreas que parecem arrastar para trás são a caracterização funcional destas preparações de canal e a descrição mecanicista da função do canal. Gating alterações conformacionais são complexos e ocorrem a uma distância de 60 Â ao longo do comprimento do canal e estas transições são extensivamente modulada pelalípidos de membrana. Em particular, lipidos negativos, colesterol e fosfolípidos foram mostrados para modular a função de pLGIC 8-11. Embora o papel preciso destes constituintes lipídicos na função do canal permanece desconhecida, uma compreensão completa molecular de gating exigiria estudar estes canais no seu ambiente nativo. Spin Dirigido local Labeling (SDSL) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) espectroscopia são as técnicas de escolha para o estudo da dinâmica de proteínas em sistemas reconstituídos. espectroscopia de EPR não é limitada pelo tamanho molecular (como é NMR) ou a propriedade óptica da amostra (como é a espectroscopia de fluorescência), e, assim, permite medições de construções de comprimento total reconstituído em condições nativas lipídicas. A técnica é extremamente sensível e tem requisitos relativamente baixos de amostra (no intervalo de pico-molar). Ambos estes aspectos tornar a técnica bem adequado para o estudo de proteínas de membrana grandes que são difíceis de expressar em mais miligramaquantidades. A utilização de espectroscopia de EPR em combinação com marcação de spin dirigida ao local foi desenvolvido por Wayne Hubbell e colegas, e foi adaptado para o estudo de uma variedade de tipos de proteínas. 12-24 os dados de RPE foram utilizados para investigar estruturas secundárias, mudanças na proteína conformação, profundidades de inserção de membrana, e proteína-proteína / interacções proteína-ligando. O método envolve a substituição de cisteína nas posições de interesse por mutagénese dirigida ao local. Para garantir a etiquetagem específica do local, é necessário substituir cisteínas nativas com outro aminoácido (por exemplo., Serina) para criar um modelo de cisteína-menos. De longe, o marcador de spin mais popular é um MTSL específico tiol-: (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metanotiosulfonato que se liga à proteína através de uma ponte de ligação de dissulfureto. Devido à sua elevada especificidade, de tamanho relativamente pequeno (ligeiramente maior do que o triptofano), e flexidade da região de ligante, este marcador de spin tem sido mostrado ter uma excelente reactividade, mesmo com uma cisteína enterrado. Além disso, para maximizar a reactividade, a reacção de marcação da proteína é realizada sob a forma detergente solubilizado. Depois da separação do excesso de rotação livre do rótulo por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, a proteína é reconstituído em lipossomas ou sistemas que mimetizam a bicamada lipídica de composição definida. Em geral, cisteína mutagênese é bem tolerada na maioria das partes da proteína, e o tamanho relativamente pequeno do spin-sonda provoca perturbação mínima para as estruturas secundárias e terciárias. Para assegurar que a modificação retido funções de tipo selvagem, os canais marcados e reconstituídas pode ser avaliado por medidas de patch-clamp. A proteína marcada-funcional é então sujeita a medições espectroscópicas, que fornecem essencialmente três tipos principais de informação: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-sonda dinâmica por lineshanálise de macaco; acessibilidade da sonda para agentes de relaxamento paramagnético; e a distância de distribuição. 27 distâncias EPR são medidos por duas abordagens diferentes. A primeira baseia-se na técnica de onda contínua (CW), onde alargamento espectral resultantes de interacções dipolares entre spin-etiquetas (no 8 - gama de distâncias de 20 Â). É usada para determinar a distância 28,29 A segunda é uma pulsado-EPR método em que as medições de distância pode ser estendida até 70 Å. 30-34 em Duplo Electron Electron ressonância (DEER), oscilações na amplitude spin-echo são analisados ​​para determinar distâncias e distribuições de distância. Aqui o eco de spin é modulado na frequência da interação dipolar. Juntos, estes parâmetros são utilizados para determinar a topologia de proteína, elementos estruturais secundários, e as alterações da proteína-conformacional.

<table><tbody><tr><td>Mutações de Mutagênese e Cys</td><td></td><td></td><td></td>Dirigidas</tr><tr><td>ao Sítio 10x PfuUltra HF tampão de reação</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polimerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td></td><td>DPNI New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC media</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB mídia</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 células competentes</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expressão e Purificação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Biorreagentes Fisher</td> <td>Triptona</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Biorreagentes Fisher</td> de<td>glicerol</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-tio-&beta;-galactosídeo)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecil-&beta;-D-Maltopiranosídeo)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilose</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Coluna vazia de cromatografia de polipropileno</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Rotulagem de rotação dirigida ao local</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-3-pirrolina-3-metil) metantiossulfonato</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-&Delta; 3-pirrolina-3-metil) metantiossulfonato</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstituição</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipídio de asoletina</td><td>Avanti lipídios polares Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (grânulos de poliestirena)</td> <td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher produtos químicos</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína-maleimida</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina-maleimida</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti lipídios polares Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti lipídios polares Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli extrato lipídico polar</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR medição</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX capilares plásticos</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (etilenodiamina-N, N'-ácido diacético)</td> <td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

local dirigido labeling rotação e epr espectroscópicos estudos de canais pentamérica ligand-gated ion

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

O canal iônico é uma orquestração orientada por estímulos de movimentos de proteínas que leva a transições entre estados fechados, abertos e dessensibilizados. Fundamental para essas transições é a flexibilidade intrínseca da proteína, que é criticamente modulada pela composição lipídica da membrana. Para entender melhor a base estrutural da função do canal, é necessário estudar a dinâmica das proteínas em um ambiente de membrana fisiológica. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) é uma ferramenta importante para caracterizar transições conformacionais entre estados funcionais. Em comparação com a RMN e a cristalografia de raios-X, as informações obtidas da EPR são intrinsecamente de menor resolução. No entanto, ao contrário de outras técnicas, no EPR não há limite superior para o peso molecular da proteína, os requisitos da amostra são significativamente menores e, mais importante, a proteína não é restringida pelas forças da rede cristalina. Portanto, o EPR é exclusivamente adequado para estudar grandes complexos de proteínas e proteínas em sistemas reconstituídos. Neste artigo, discutiremos protocolos gerais para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição da membrana usando um canal iônico controlado por ligante pentamérico dependente de prótons procariótico (pLGIC) de Gloeobacter violaceus (GLIC) como exemplo. Uma combinação de abordagens EPR de onda contínua (CW) e pulsada (ressonância eletrônica de elétron duplo-DEER) em estado estacionário será descrita para permitir uma caracterização quantitativa completa da dinâmica do canal.

Caracterização bioquímica dos Mutantes GLIC marcado por rotação Seguindo o protocolo descrito acima seria normalmente produzem proteína de fusão MBP-GLIC na gama de 10 - 12 mg / L de cultura. Embora este valor pode variar entre os diferentes mutantes, em particular para as posições enterradas no interior da proteína, o rendimento pode ser significativamente comprometida. Nestes casos, os volumes de cultura pod...

Este artigo descreve métodos para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição de canais controlados por ligantes pentaméricas para estudos de ressonância paramagnética eletrônica. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer proteína de membrana. O método de reconstituição descrito aqui também pode ser usado para medições de patch clamp de correntes macroscópicas e de canal único em um sistema lipídico definido.

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a purificação, marcação com spin direcionada ao sítio e a reconstituição de um canal iônico ligado a ligantes pentamérico para estudos de ressonância paramagnética eletrônica. Estudar a dinâmica de proteínas de membrana em um ambiente fisiologicamente relevante é fundamental para compreender completamente como esta proteína transportadora de membrana funciona. E, devido a essas necessidades, acredito que a marcação com spin direcionada ao sítio e a técnica de RPE são particularmente adequadas.A principal vantagem dessa técnica é que ela não é limitada pelo tamanho da proteína. Portanto, a marcação com spin direcionada a sítios específicos e a espectroscopia de RPE seriam técnicas de escolha se você deseja estudar a dinâmica de proteínas grandes ou proteínas reconstruídas em membranas. Introduza mutações únicas de cisteína no gene GLIC por meio de mutagênese direcionada a sítios específicos.Prepare um cultivo noturno do mutante de cisteína da GLIC conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione 100 mililitros de tampão estéril de fosfato de potássio ao meio terrific broth autoclavado. Depois, adicione glicose estéril, canami

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Research

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Chemistry

Química

Nós descrevemos um protocolo simples para identificar proteínas cerebrais que se ligam ao terminal de todo o comprimento C da ATP-gated P2X2 receptores. A extensão e aplicação sistemática desta abordagem para todos os receptores P2X deverá levar a uma melhor compreensão da sinalização do receptor P2X.

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Vamos descrever um método que mede a cinética de transporte de íons de proteínas da membrana juntamente com site-specific análise das mudanças conformacionais usando fluorescência em células individuais. Esta técnica é adaptável a canais iônicos, transportadores e bombas de íons e pode ser utilizado para determinar restrições de distância entre as subunidades da proteína.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

Este protocolo apresenta as ferramentas disponíveis para modelar ligantes de moléculas pequenas em mapas crioEM de macromoléculas.

Modelagem de ligantes em mapas derivados da criomicroscopia eletrônica

A eletrofisiologia é o padrão-ouro para investigar a atividade do canal iônico. No entanto, existem muitas abordagens alternativas, incluindo métodos ópticos. Aqui, descrevemos um método para monitorar a atividade da repetição rica em leucina contendo canais de ânions formados por 8 canais (LRRC8) usando um método baseado em transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitoramento da atividade de 8 canais (LRRC8/VRAC) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de Förster de emissão sensibilizada (SE-FRET)

Aprenda a purificação, marcação por spin dirigida e reconstituição de canais iônicos pentaméricos para estudos de RPE. Este protocolo permite analisar a dinâmica de proteínas de membrana em ambientes fisiologicamente relevantes.

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