Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a purificação, marcação com spin direcionada ao sítio e a reconstituição de um canal iônico ligado a ligantes pentamérico para estudos de ressonância paramagnética eletrônica. Estudar a dinâmica de proteínas de membrana em um ambiente fisiologicamente relevante é fundamental para compreender completamente como esta proteína transportadora de membrana funciona. E, devido a essas necessidades, acredito que a marcação com spin direcionada ao sítio e a técnica de RPE são particularmente adequadas.

A principal vantagem dessa técnica é que ela não é limitada pelo tamanho da proteína. Portanto, a marcação com spin direcionada a sítios específicos e a espectroscopia de RPE seriam técnicas de escolha se você deseja estudar a dinâmica de proteínas grandes ou proteínas reconstruídas em membranas. Introduza mutações únicas de cisteína no gene GLIC por meio de mutagênese direcionada a sítios específicos.

Prepare um cultivo noturno do mutante de cisteína da GLIC conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione 100 mililitros de tampão estéril de fosfato de potássio ao meio terrific broth autoclavado. Depois, adicione glicose estéril, canamicina e 10 mililitros do cultivo noturno.

Incube a 37 graus Celsius em agitador a 250 rpm. Adicione 50 mililitros de glicerol e continue agitando a cultura até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja de 1,0 a 1,2. Após induzir as células com IPTG 200 micromolar, reajuste o agitador para 250 rpm e incube por aproximadamente 16 horas a 18 graus Celsius.

Recolha as células em frascos de centrífuga de um litro por meio de centrifugação a 8500 × g, a quatro graus Celsius, durante 15 minutos. Decante o sobrenadante e pese o frasco com o pellet celular conforme descrito no protocolo textual. Re-suspenda o pellet bacteriano em 150 mililitros de tampão A gelado por litro de cultura.

Homogeneíze as células passando-as por um disruptor celular em uma câmara fria a quatro graus Celsius. Repita o processo três vezes para que a maioria das bactérias seja lisada. Centrifugue as células a 14.000 ×g por 15 minutos.

Em seguida, pipete o sobrenatante e transfira para um tubo de centrífuga limpo. Após centrifugar o sobrenatante a 168.000 ×g durante uma hora, decante cuidadosamente o sobrenatante sem perturbar o pellet de membrana. Recolha o pellet de membrana obtido a partir de um litro de cultura e ressuspenda-o no Tampão A, suplementado com 10% de glicerol, até um volume final de 50 mililitros.

Adicione 0,5 gramas de DDM à suspensão de membrana e agite suavemente por duas horas a quatro graus Celsius. Após a solubilização da membrana, remova os detritos celulares do lisado por centrifugação a 168.000 vezes G durante uma hora. Enquanto isso, prepare a resina de amilose.

Transfira três mililitros de resina utilizando uma pipeta para uma coluna de cromatografia vazia de polipropileno. Lave a resina passando 10 volumes da cama de água por três vezes e, em seguida, 10 volumes da cama do Tampão A, contendo DDM 0,5 milimolar. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta e transfira para um tubo cônico limpo de 50 mililitros.

Para ligação em lote, adicione a resina de amilose pré-equilibrada ao tubo cônico. Ligue a proteína extraída à resina de amilose agitando suavemente a mistura por duas horas a quatro graus Celsius. Em seguida, passe toda a suspensão por uma coluna de cromatografia e colete o fluxo inicial.

Dilua a proteína GLIC com 10 mililitros do Tampão A contendo 40 milimolar de maltose, além de 0,5 milimolar de DDM e 0,5 milimolar de TCEP. O TCEP evita a oxidação das cadeias laterais de cisteína. Colete todo o eluato.

Concentre a proteína eluída utilizando um concentrador centrífugo até uma concentração entre quatro e seis miligramas por mililitro. Adicione a protease HRV 3C e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Para realizar a marcação específica por spin, adicione inicialmente um excesso molar dez vezes maior do marcador de spin MTSL à amostra digerida pela protease, obtendo uma razão molar de 1:10 entre o monômero de GLIC e o MTSL.

Após uma hora de incubação, adicione mais marcador de spin em uma proporção em excesso molar cinco vezes maior e incube por mais uma hora. Passe a amostra por uma coluna de cromatografia líquida de proteínas rápida por exclusão de tamanho, ou FPLC, previamente equilibrada com o Tampão A e DDM 0,5 milimolar para separar a etiqueta MBP clivada e o excesso de marcador de spin livre dos pentâmeros de GLIC. Concentre a solução proteica utilizando um concentrador centrífugo até uma concentração final de aproximadamente oito a dez miligramas por mililitro e coloque-a no gelo.

A amostra está agora pronta para reconstituição. Para preparar os lipossomos, lave um frasco redondo limpo de 25 mililitros com cinco mililitros de clorofórmio e seque o frasco sob um fluxo contínuo de gás nitrogênio na cabine de segurança. Em seguida, transfira 10 miligramas de asolecitina para o frasco e seque os lipídios sob um fluxo contínuo de gás nitrogênio.

Após a evaporação do clorofórmio, coloque o frasco em vácuo durante uma hora para garantir a secagem completa. Em seguida, adicione um mililitro do tampão de reconstituição A ao lipídio seco e vortexe o frasco vigorosamente para suspender o pellet lipídico. Para preparar vesículas unilamelares pequenas, sonique a suspensão lipídica em um banho de ultrassom refrigerado até que a solução de vesículas fique mais ou menos translúcida e não se observem agregados.

A esta mistura, adicione DDM até uma concentração final de quatro milimolares e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Para reconstituir a proteína, adicione a proteína purificada à mistura lipídica. Após a incubação da amostra a quatro graus Celsius por uma hora com rotação suave, dilua a amostra até 15 mililitros com Tampão A. Remova o detergente residual na suspensão utilizando esferas de poliestireno com poros hidrofóbicos que retêm o detergente.

Adicione 80 miligramas de esferas limpas e incube a suspensão de lipossomos durante a noite em um agitador rotativo a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira o lipossomo para um tubo de ultracentrífuga de 25 mililitros utilizando um filtro em coluna para remover as esferas e dilua ainda mais a amostra até 25 mililitros. Após centrifugar as amostras a 168.000 ×g por duas horas, despreze o sobrenadante e re-suspenda o pellet utilizando 100 microlitros do Tampão B. Para realizar espectroscopia de RPE em onda contínua, primeiro transfira a suspensão de lipossomos para um tubo de 200 microlitros e pelletize as amostras utilizando uma centrífuga.

Após descartar o sobrenatante, a amostra está pronta para as medições de RPE. Remova o máximo de tampão possível da amostra de lipossomos. Para realizar a troca de tampão, transfira 20 microlitros do pellet de lipossomos para um tubo microcêntrifuga usando uma pipeta.

Adicione 180 microlitros do Tampão D e incube a 42 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue a amostra, remova o sobrenadante utilizando uma pipeta e repita o processo três vezes para garantir a troca completa do tampão. Capilares plásticos permeáveis a gases são adequados para medições de formas de linha espectrais e acessibilidade ao solvente.

Toque a extremidade da capilar com o proteolipossomo em pellet para aspirar a amostra para dentro e feche a extremidade com cera óssea. É mostrada aqui a caracterização bioquímica de mutantes de GLIC marcados com spin, por meio do cromatograma de filtração em gel de GLIC marcado com spin após a clivagem proteolítica da etiqueta MBP. Os picos correspondem ao pentâmero de GLIC e ao MBP livre.

O gel de SDS-PAGE mostra a proteína de fusão monomérica GLIC-MBP não cortada antes da filtração em gel, bem como as frações de MBP e GLIC obtidas pela filtração em gel. Foi realizado um ensaio baseado em FRET para monitorar o estado de agregação do GLIC reconstruído em diversos lipídios de membrana. As medições de FRET foram realizadas em amostras após reconstrução durante a noite e após múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento das amostras.

Em um "patch" dentro-fora excisado de vesículas de asolecina reconstituídas, GLIC é ativado por saltos de pH utilizando um trocador rápido de solução. Observa-se que os canais se ativam em aproximadamente 10 milissegundos e se dessensibilizam com uma constante de tempo de um a três segundos. Rearranjos estruturais são observados durante a ativação do canal.

Aqui, espectros de ressonância paramagnética eletrônica de onda contínua para uma posição na hélice M2 revestida pelo poro exibem alterações na amplitude e mudanças nas formas em resposta a variações de pH. A espectroscopia por RPE é uma abordagem estrutural incomparável para medir mudanças conformacionais de proteínas de membrana em nosso ambiente nativo, fornecendo um vislumbre dos detalhes moleculares da dinâmica proteica que permanecem ocultos nas estruturas de alta resolução obtidas por cristalografia de raios X ou por microscopia crioeletrônica. Ao trabalhar com esta técnica, é importante ter em mente que mutações frequentemente levam a baixa estabilidade oligomérica e pobre estabilidade do oligômero da proteína.

Portanto, você pode precisar elaborar uma estratégia para lidar com essas questões. Combinar essas descobertas provenientes desses estudos de RPE com medições funcionais pode nos fornecer uma imagem mais completa para estudar a relação entre estrutura e função, e os avanços tecnológicos futuros visam utilizar essa abordagem poderosa para investigar canais humanos mais complexos em condições lipídicas mais sofisticadas.