Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic
22 de junho de 2016
As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.
O objetivo geral deste protocolo é gerar células dendríticas tolerogênicas e maduras a partir de monócitos para experimentação ou desenvolvimento de vacinas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, fornecendo um modelo para estudar o desenvolvimento, maturação e apresentação de antígenos de células dendríticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração de um grande número de células dendríticas in vitro para experimentação.
Comece o enriquecimento de monócitos misturando 20 microlitros de células mononucleais do sangue periférico previamente preparadas, ou suspensão de células PBMC com 20 microlitros de azul de tripano, para contar o número de células vivas usando um citômetro. Em seguida, centrifugue a suspensão celular. Aspire o sobrenadante completamente e ressuspenda o pellet celular a uma concentração de 80 microlitros de tampão de coloração para 10 a sétima células.
Adicione 20 microlitros de microesferas de CD-4 por 10 às sétimas células. Misture bem e incube as células por 15 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células com um mililitro de tampão de coloração por 10 até a sétima célula e centrifugue as células.
Aspirar completamente o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular. Obter uma coluna média para um máximo de duas vezes 10 elevado ao oitavo total de células e colocar a coluna no campo magnético do separador. Em seguida, enxágue a coluna com 500 microlitros de tampão de coloração.
Pipete a suspensão celular na coluna e colete as células não marcadas que passam pela coluna em um tubo de 15 mililitros. Substitua um novo tubo de 15 mililitros sob a coluna e lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de coloração. Certifique-se de que o reservatório da coluna esteja vazio antes de adicionar um novo tampão de coloração entre as lavagens.
Remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo novo de 15 mililitros. Pipetar um mililitro de tampão de coloração para a coluna e lavar imediatamente as células marcadas magneticamente, empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Em seguida, repita as etapas de separação magnética usando a fração ilustrada em uma nova coluna para aumentar a pureza das células CD14 plus.
Semear quatro conjuntos de CD14 mais monócitos em uma concentração de zero vírgula três a zero vírgula cinco vezes 10 elevado a sexto por mililitro de meio de cultura celular de IL-4 em seis placas de poço. Incube as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2. No quarto dia, remova 850 microlitros de meio da cultura e centrifugue.
Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um mililitro de meio de cultura celular. Adicione a mistura de células de volta à cultura. No quinto dia, adicione um microlitro de caldo de vitamina D3 e um microlitro de caldo de dexametazona por um litro de meio a dois dos conjuntos, para gerar moDCs tolerogênicos.
No sexto dia, adicione 200 nanogramas por mililitro de GMCSF e 200 nanogramas por mililitro de IL-4 a todos os conjuntos. Adicionar um micrograma por mililitro de LPS a um dos conjuntos tratados apenas com GMCSF e IL-4 para gerar moDCs maduros. Adicione um micrograma por mililitro de LPS a um conjunto de moDCs tolerogênicos para gerar moDCs tolerogênicos de LPS.
Finalmente, no sétimo dia, colha os diferentes tipos de moDCs lavando a placa de cultura com PVS EDTA. Os moDCs imaturos foram gerados pela adição de GMCSF e IL-4 a CD-14 purificado mais monócitos nos dias zero, quatro e seis. A adição de vitamina D3 e dexametazona pós-GMCF e IL-4 resultou na diferenciação de moDCs imaturos em moDCs tolerogênicos.
LPS foi adicionado para induzir a maturação de moDCs imaturos para moDCs maduros. E moDCs tolerogênicos foram estimulados com LPS para verificar resistência à maturação. Uma análise dos marcadores de superfície DC revelou que os moDCs maduros expressam os maiores níveis de marcadores de maturação HLA-DR, CD80, CD83 e CD86.
Por outro lado, os moDCs tolerogênicos exibiram expressão aumentada de CD14, BDCA3 e transcritos semelhantes a imunoglobulinas em comparação com moDCs imaturos e maduros. Usando CMXRos vermelhos para refletir a atividade mitocondrial, observou-se que os moDCs tolerogênicos têm maior atividade mitocondrial em comparação com os outros subtipos diferenciados de moDC. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem características metabólicas em células dendríticas para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapia.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para gerar células dendríticas tolerogênicas e maduras a partir de monócitos, que podem ser utilizadas para pesquisa imunológica e desenvolvimento de vacinas. O método permite a diferenciação de células dendríticas derivadas de monócitos imaturas (moDCs) em fenótipos distintos com características metabólicas variadas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia da célula dendrítica
- Diferenciação celular
Contexto
- As células dendríticas desempenham um papel crucial na regulação da imunidade e da tolerância.
- Compreender a diferenciação das moDCs pode fornecer informações sobre as respostas imunes.
- As células dendríticas tolerogênicas podem ser benéficas no desenvolvimento de terapias para doenças autoimunes.
- As células dendríticas maduras são essenciais para uma apresentação eficaz de antígenos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para gerar grandes quantidades de células dendríticas in vitro.
- Explorar as características metabólicas das células dendríticas durante a diferenciação.
- Fornecer um modelo para estudar a maturação e função das células dendríticas.
Métodos Utilizados
- Enriquecimento de monócitos a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
- Separacão magnética para isolar monócitos CD14+.
- Cultivo de monócitos com citocinas e compostos específicos para induzir diferenciação.
- Análise de marcadores superficiais de células dendríticas e atividade metabólica.
Resultados Principais
- Os moDCs tolerogênicos exibiram maior atividade mitocondrial em comparação com outros subtipos.
- Os moDCs maduros expressaram níveis elevados de marcadores de maturação, como HLA-DR e CD80.
- Os moDCs tolerogênicos mostraram aumento na expressão de CD14 e transcritos semelhantes a imunoglobulinas.
- O protocolo de diferenciação gerou com sucesso populações distintas de células dendríticas para pesquisa.
Conclusões
- Este método permite a geração eficaz de células dendríticas para estudos imunológicos.
- O entendimento dos perfis metabólicos das células dendríticas pode auxiliar no desenvolvimento de vacinas.
- Os achados contribuem para o conhecimento da biologia das células dendríticas e de seu papel na regulação imunológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A geração de células dendríticas com fenótipos imunogênicos ou tolerogênicos definidos permite a investigação precisa de mecanismos imunológicos relevantes para imunoterapia e desenvolvimento de vacinas. Essa capacidade sustenta a confiança preditiva na validação precoce de alvos e reduz riscos em programas translacionais, fornecendo modelos celulares padronizados e escalonáveis. A abordagem é diretamente relevante para equipes de portfólio que buscam alinhar a biologia de descoberta com a tradução clínica posterior na modulação imunológica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite estudos mecanicistas da maturação de células dendríticas e das vias de apresentação de antígenos.
- Apoia a validação funcional de alvos imunológicos mediante a geração de fenótipos distintos de células dendríticas in vitro.
- Facilita a desmistificação biológica ao esclarecer o impacto do estado metabólico na função imunológica.
- Oferece um sistema reprodutível para investigação orientada por hipóteses dos mecanismos de tolerância imunológica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece populações validadas de células dendríticas fenotipicamente distintas para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Padroniza a caracterização dos marcadores de superfície e do fenótipo metabólico para reprodutibilidade do ensaio.
- Permite a avaliação quantitativa do potencial de apresentação de antígenos e ativação de células T.
- Oferece suporte à preparação escalonável de células dendríticas para plataformas de triagem de compostos ou antígenos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos de DC in vitro com estratégias de modulação imunológica relevantes para doenças.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de imunoterapias e intervenções tolerogênicas.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados preditivos sobre a função de DC e fenótipo metabólico.
- Facilita a exploração de biomarcadores translacionais associados à maturação e tolerância de DC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a geração e caracterização de subtipos de células dendríticas para estudos de modulação imunológica.
- Biologia da Descoberta: Fornece uma plataforma para testes de hipóteses sobre maturação de DCs, apresentação de antígenos e indução de tolerância.
- Triagem: Fornece DCs fenotipicamente definidas e reproduzíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de marcadores de superfície e atividade metabólica para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos de intervenção imunológica e desenvolvimento de vacinas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para a geração de DCs em múltiplos programas de imunologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos imunológicos e na desvinculação mecanicista de riscos.
- Valor Operacional: Padroniza a geração e caracterização de DCs para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção de programas imunomoduladores e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos de modulação imunológica e candidatos translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em isolamento de monócitos, cultura celular e imunofenotipagem.
- Requer acesso à citometria de fluxo e ensaios de atividade metabólica para caracterização de DCs.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de citocinas e maturação para reprodutibilidade.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes fontes de doadores ou modelos de doenças.
- As limitações incluem variabilidade nas fontes de células primárias e possíveis efeitos de lote.
