Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

O objetivo geral desta técnica é investigar sistematicamente o cenário de metilação do DNA em todo o genoma em grandes coortes de pacientes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo epigenético, especialmente no que diz respeito a quais regiões no cenário de metilação do DNA são desreguladas em pacientes. A principal vantagem desta técnica é que o grande número de pacientes pode ser investigado de maneira econômica.

Essa tecnologia pode ter implicações positivas na terapia e no diagnóstico do paciente, pois podemos investigar os biomarcadores existentes e também identificar novos biomarcadores. Embora esse método possa fornecer informações sobre a coorte de pacientes, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a metilação do DNA em células derivadas de linhagens celulares cultivadas de amostras derivadas de camundongos. Demonstrando este procedimento junto com o Dr.Ya-Ting Hsu estará o Sr. Joseph Liu, um técnico em nosso laboratório.

A parte de sequenciamento será demonstrada pela Sra. Dawn Garcia, que é técnica em nosso núcleo de sequenciamento. Depois de isolar o DNA genômico do tumor ou tecido normal de acordo com o protocolo de texto, adicione 1,2 microgramas de DNA genômico total a 96 microlitros de tampão TE e 24 microlitros de tampão de lavagem 5X para fazer uma solução de 120 microlitros. Sonicar a solução de ADN durante 30 segundos e depois deixá-la repousar durante 30 segundos.

Repita a sonicação um total de 20 a 25 vezes. Use um sistema bioanalisador com um kit comercial de DNA de alta sensibilidade de acordo com o protocolo do fabricante para executar um microlitro de solução de DNA sonicado para verificar o tamanho dos fragmentos. Eles devem estar na faixa de 150 a 350 pares de bases.

Para realizar a eluição de fração única, prepare o tampão de eluição fazendo uma solução um-para-um de tampão com baixo teor de sal e tampão com alto teor de sal. Use 200 microlitros do tampão de eluição para ressuspender o DNA de ligação de metila ou grânulos de MBD e incube a suspensão em um misturador rotativo por três minutos. Após a incubação, coloque o tubo no suporte magnético por um minuto, depois pipete cuidadosamente o líquido sem tocar na ponta da pipeta nas esferas e transfira-o para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro sem DNase.

Armazene esta amostra no gelo. Repetir a eluição para a segunda amostra e recolhê-la no mesmo tubo que a primeira amostra. Para cada fração de lavagem e diluição não capturada, adicione um microlitro de glicogênio, um décimo do volume de acetato de sódio de três molares, pH 5,2, e dois volumes de amostra de etanol a 100%.

Depois de misturar bem a solução, incubar a 80 graus Celsius negativos durante pelo menos duas horas. Em seguida, centrifugue a reação a 11.363 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 500 microlitros de etanol frio a 70%.

Gire o tubo novamente antes de repetir a lavagem com etanol. Seque o pellet ao ar por cinco minutos. Em seguida, use água ou tampão sem DNase para ressuspendê-lo.

Verifique se a quantidade total de DNA é superior a 20 nanogramas de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, coloque o DNA no gelo ou armazene a 20 graus Celsius negativos até o uso posterior. Para a preparação da biblioteca de sequenciamento de DNA, use um sistema de construção de biblioteca totalmente automatizado e siga o protocolo padrão fornecido pelo fabricante.

Selecione fragmentos de DNA de 200 a 400 pares de bases de comprimento para preparação da biblioteca. Depois de preparar a biblioteca de sequenciamento de DNA, remova a reação e use um sistema de quantificação fluorométrica para quantificar a biblioteca de sequenciamento de DNA. Para configurar uma reação de amplificação de PCR, em um tubo de PCR adicione 15 microlitros de biblioteca de sequenciamento de DNA, 25 microlitros de mistura principal de PCR, dois microlitros de mistura de primer de PCR e oito microlitros de água.

Use o programa descrito no protocolo de texto, fazendo os ajustes necessários com base nas recomendações do fabricante da mistura de PCR. Realize ciclos suficientes para produzir de dois a 10 milimolares de DNA de biblioteca. Depois de limpar as reações de PCR, codifique cada amostra e junte quatro amostras em uma pista de uma célula de fluxo.

Use o protocolo padrão de leitura única de 50 pares de bases de nosso sequenciamento. Realizar bioinformática de acordo com o protocolo de texto. Usando o MBD cap para identificar ilhas CpG em diferentes regiões genômicas que são diferencialmente metiladas no tumor em relação ao tecido normal, este estudo revelou que do total de ilhas CpG localizadas em promotores de genes, 19,5% apresentaram metilação diferencial em tumores em comparação com o normal.

Da mesma forma, 55,2% das ilhas intragênicas de CpG investigadas apresentaram metilação diferencial. Os promotores intragênicos apresentaram 28,1% e para os promotores de genes sem ilhas CpG, 1,8% apresentaram metilação diferencial. Este mapa de calor descreve claramente regiões diferencialmente metiladas em 77 tumores de mama, 10 tecidos normais de mama e 38 linhagens celulares de câncer de mama.

Nesta figura, a metilação é quantificada em dois subgrupos de câncer de endométrio, não recorrente vs. recorrente, em duas pacientes em diferentes locais de CpG na ilha promotora CpG do gene alvo identificado SFRP1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a cinco dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar primeiro a qualidade de um DNA genômico que está sendo testado. Seguindo este procedimento, métodos adicionais como pirosequenciamento podem ser realizados para responder a perguntas como, quais são os CpGs exatos nas regiões diferencialmente enriquecidas identificadas que foram alteradas? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética explorarem a metilação do DNA em grandes coortes de pacientes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar a metilação do DNA em todo o genoma em amostras de pacientes usando a técnica de sequenciamento de tampas MBD. Tenha isso em mente, às vezes pode ser difícil capturar a alta qualidade do DNA, como FFP e amostras de DNA, portanto, a avaliação adequada do DNA genômico é sempre feita quando realizamos o procedimento.