FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

O objetivo geral deste método experimental é permitir o estudo em tempo real da sinalização intracelular por meio da imagem de FRET de células incorporadas em hidrogéis tridimensionais que mimetizam tecidos naturais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia do desenvolvimento, farmacologia e medicina regenerativa, como o desenvolvimento de biomateriais ideais e a triagem de alta produtividade de fármacos em microtecidos tridimensionais projetados. A principal vantagem desta técnica é que o FRET pode ser utilizado em um grande número de células em diversos tipos de hidrogel, empregando sistemas convencionais de microscopia de campo amplo.

Após fabricar moldes para a moldagem de hidrogéis e suspender células cultivadas em solução de hidrogel, de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione, em uma cabine de cultura de tecidos, o precursor contendo células aos moldes de moldagem utilizando técnica estéril. Antes da reticulação, centrifugue as células suspensas no precursor de hidrogel para otimizar a imagem, confinando as células a um único plano focal e minimizando o sinal fora do plano. Em seguida, para reticular os hidrogéis de PC, utilize uma fonte de luz UVA por um tempo de exposição equivalente a 3,2 joules por centímetro quadrado por milímetro de espessura, para irradiar o precursor contendo células.

Alternativamente, utilize uma lâmpada dental manual menos cara. Evite expor excessivamente o hidrogel, pois isso reduzirá a viabilidade celular. Os hidrogéis reticulados fisicamente são colocados a 37 graus Celsius.

Após a reticulação, remova o molde de vazamento do hidrogel de PDMS e substitua-o pelo recipiente de PDMS previamente preparado. Use uma espátula estéril para pressionar o PDMS contra o vidro, a fim de fixá-lo. Adicione ao poço formado no recipiente de PDMS com lamínula um meio sem soro livre de fenol ou um meio quimicamente definido, mantendo o hidrogel imerso.

Incube o recipiente a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após o recipiente de PDMS com o hidrogel ter sido fixado na platina do microscópio e o óleo ter sido aplicado na objetiva, utilize luz transmitida para localizar pelo menos 15 células para aquisição de imagens e verifique a transfeção por meio de imagem de fluorescência. No software do microscópio, configure as configurações da câmera para os canais de imagem FRET escolhendo algumas células próximas ao centro do campo de visão e otimize o tempo de exposição e o ganho para cada canal de imagem conforme descrito no protocolo textual.

Escolha células que estejam próximas ao centro do hidrogel, dentro do campo de iluminação relativamente plano, que não sejam nem muito brilhantes nem muito fracas, e com uma razão de FRET entre 0,0 e 1,0. Em seguida, selecione múltiplos campos de visão para adquirir imagens de pelo menos 15 células transfectadas. Desligue a luz ao finalizar para limitar a exposição.

Para configurar a taxa de captura para a aquisição de imagens em lapso de tempo, insira a periodicidade das capturas. Utilize uma taxa rápida para a captura do sinal de referência, como a cada cinco segundos por campo de visão, e uma taxa mais lenta para a cinética de sinalização subsequente de longo prazo. Selecione Executar agora para iniciar a aquisição de imagens e capturar imagens durante cinco minutos, a fim de estabelecer uma linha de base para a resposta da sonda no campo de visão designado.

Após os cinco minutos de aquisição de imagens, adicione com pipeta o agonista ou antagonista desejado, misture por pipetagem e continue a obtenção de imagens. Após realizar a calibração de FRET de acordo com o protocolo descrito, no software do microscópio selecione a seta no ícone da região de interesse de fundo e escolha Desenhar Região de Interesse Elíptica de Fundo. Desenhe e designe uma região de interesse, ou ROI, por campo de visão próximo às células para definir o nível de fundo.

Garanta que a opção Manter Atualização do Deslocamento de Fundo esteja selecionada, então ative a visualização da região de interesse do fundo clicando no ícone Região de Interesse do Fundo. Alternativamente, selecione o ícone de região de interesse e defina as propriedades da região de interesse como Usar como Região de Interesse de Fundo e Regiões de interesse são diferentes em cada Ponto Múltiplo. Usando o ícone de fundo da região de interesse, selecione Subtrair Fundo Utilizando Região de Interesse.

No menu suspenso, em Subtrair Região de Interesse de Fundo, selecione Toda Imagem e em Aplicar A, selecione Todos os Quadros. Para cada campo de visão, para definir uma região de interesse ao redor da célula utilizando o canal de emissão do aceptor e uma máscara binária, use o menu Binário, Definir Limiar e selecione Aplicar ao Quadro Atual. Em seguida, ajuste o limiar inferior para selecionar as células.

Em seguida, utilize a função Binário Fechar para preencher os buracos na máscara binária, se necessário. Depois, use o ícone Região de Interesse para selecionar Copiar Binário para Região de Interesse, a fim de salvar a máscara binária como regiões de interesse. Acrescente as regiões de interesse para os campos subsequentes de visão ao conjunto existente de regiões de interesse.

Exclua quaisquer regiões de interesse espúrias. Em seguida, clique com o botão direito nas Regiões de Interesse e verifique se suas propriedades estão definidas como Usar como Região de Interesse Padrão e Regiões de Interesse diferentes em cada Ponto Múltiplo. As regiões de interesse celulares podem ser desenhadas manualmente, mas é necessário ter cuidado para remover valores espúrios.

O protocolo contém procedimentos para células que estão fora do campo de iluminação plano e para microscópios que não possuem campo plano. A centrifugação dos precursores do hidrogel antes da gelificação maximizou o número de células em um único plano focal próximo à lamínula. Isso minimizou o ruído de fundo e aumentou a produtividade do imageamento.

Neste experimento de FRET, para o cálculo da razão FRET da emissão quenchada, ou QE, apenas duas imagens foram necessárias para a sonda binária de cadeia única ICUE1, incluindo QE igual a CFP para excitação e emissão, e emissão do aceptor igual a YFP para excitação e emissão. Vários campos de visão foram selecionados nos quais várias células estavam localizados na área de iluminação homogênea, conforme mostrado aqui. As ROI para correção de fundo dos sinais dos canais e para análise celular foram definidas utilizando imagens de emissão do aceptor com limiar definido no início dos experimentos.

Além disso, conforme mostrado aqui, foram selecionadas células que expressavam sonda suficiente. As razões FRET por pixel baseadas na eficiência quântica (QE) e na emissão sensibilizada, bem como a razão média de FRET por célula, foram calculadas. O inverso da razão de emissão sensibilizada foi calculado e ambas as razões foram normalizadas.

Sob a estimulação com forskolina, as razões FRET baseadas em QE e SE detectam o aumento da atividade de AMP cíclico em condrócitos. Tanto os géis fisicamente reticulados quanto os quimicamente reticulados mostraram um aumento na razão FRET de QE ao longo do tempo, indicando uma resposta aumentada de sinalização de AMP cíclico à adição de forskolina. Este procedimento pode ser usado com outras técnicas de microscopia, como FRAP, FLIM FRET e medidas de anisotropia, para responder perguntas como: quais são as diferenças na permeabilidade e na sinalização celular entre diferentes tipos de microtecidos?

Como a reticulação é interrompida próximo ao PDMS, é importante lembrar de projetar as moldes para os hidrogéis foto-reticuláveis ligeiramente maiores em diâmetro do que os próprios hidrogéis.