Name: FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda imagem FRET em hidrogéis tridimensionais para estudar sinalização intracelular em tempo real usando microscopia de epifluorescência convencional. Este método permite análise de alta vazão em múltiplas células.

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Os autores reconhecem o apoio financeiro da Escola de Medicina Dentária da Universidade de Pittsburgh, o prêmio K01 AR062598 do National Institutes of Health e a concessão do P30 DE030740. Os autores também agradecem ao Dr. Jin Zhang pelo plasmídeo ICUE1, Wayne Rasband pelo desenvolvimento do ImageJ e Michael Cammer pela macro ImageJ.

Os autores não têm conflitos a declarar.

Este trabalho demonstra como a imagem FRET pode ser usada para analisar a sinalização celular em hidrogéis 3D. Embora estudos anteriores tenham demonstrado imagens FRET de células semeadas em substratos de hidrogel35-37, de interações extracelulares com hidrogéis38 e de moléculas presas em hidrogéis39-41, esta é a primeira publicação a descrever a análise intracelular baseada em imagens FRET de células incorporadas em hidrogéis 3D. O trabalho resolve vários problemas de implementação ao traduzir imagens FRET de 2D para 3D. Primeiro, objetivas de alta abertura numérica são necessárias para que a imagem FRET colete sinal de emissão suficiente, mas limitam a profundidade de campo. As células aqui podem se assentar ligeiramente por centrifugação para aumentar o número de células em um plano focal próximo ao vidro para compensar isso. Em segundo lugar, os andaimes de hidrogel 3D podem flutuar no campo de visão durante a imagem, o que complica a análise. Os hidrogéis aqui são ligados à lamínula para que permaneçam fixos durante todo o experimento. Em terceiro lugar, a seleção de composições de hidrogéis apropriadas para FRET 3D é essencial porque os hidrogéis podem dificultar a visualização das células. Aqui, são usados hidrogéis transparentes de PC-gel e TR-gel. No entanto, reunir as células com centrifugação em um plano focal próximo à lamínula pode ser usado para obter imagens de células em hidrogéis com maior difração. A escolha do hidrogel depende das condições do microambiente que devem ser simuladas, que podem ser encontradas em uma revisão sobre hidrogéis42. Em quarto lugar, um cálculo alternativo é empregado aqui para a razão FRET da sonda ICUE1 de cadeia única (ou seja, EQE = QE / cAem) para minimizar o número de canais de imagem necessários para análise e, assim, minimizar o fotobranqueamento. A taxa FRET média por célula é calculada como a média das taxas por pixel dentro de uma célula para minimizar a subestimação da taxa FRET real. Finalmente, é descrita uma análise raciométrica linear e meios para calcular a fração ativada de sondas binárias de cadeia única.
Existem vários aspectos críticos da realização de experimentos FRET bem-sucedidos usando microscopia de campo amplo. Com relação ao hardware, a câmera deve ser sensível o suficiente para resolver pequenas mudanças de sinal, deixando as câmeras CMOS científicas mais recentes e os CCDs multiplicadores de elétrons mais adequados do que os CCDs convencionais. Para melhor analisar a distribuição espacial da razão FRET, a câmera deve, no mínimo, possuir o dobro da resolução espacial da função de propagação de pontos da objetiva (critério de Nyquist). Isso torna os sistemas de visão dupla menos adequados para a tarefa. Mais crucial é selecionar uma exposição apropriada e taxa de aquisição de imagem para o par FRET fornecido, de modo a minimizar o fotobranqueamento dos fluoróforos. Uma taxa de aquisição reduzida é recomendada à medida que a duração do experimento aumenta. O uso de rodas de filtro rápido aumenta a taxa de aquisição e o número de FOVs para análise, evitando os problemas de registro de imagem com cubos de filtro de torre e visão dupla. O campo de iluminação não homogêneo complica a correção da fluorescência de fundo que surge da autofluorescência da amostra e do ruído do sistema da câmera. Alguns hidrogéis, particularmente aqueles que contêm proteínas colágenas, são altamente autofluorescentes43,44. Os índices FRET são subestimados sem correção de fundo. Aqui, empregamos um método simples de correção de fundo que se baseia no campo de iluminação relativamente plano, que muitas vezes pode ser configurado com iluminação de epifluorescência sobre o centro da imagem (Figura 3B, Etapa 7.2). Este método, portanto, restringe as células de interesse àquelas dentro deste campo de iluminação. A correção de fundo descrita aqui não leva em conta a autofluorescência celular nos comprimentos de onda lidos para a sonda binária. Nesse caso, as células não marcadas (sem transfecção de sonda) devem ser visualizadas nas mesmas condições e subtraídas o fundo. Uma combinação de células rotuladas e não rotuladas pode ser usada e as células não rotuladas selecionadas para o ROI de fundo. Métodos alternativos que fornecem análise celular em todo o campo da imagem incluem o uso de uma máscara de sombreamento, várias ROIs de fundo ou amostras idênticas sem células e um protocolo está disponível mediante solicitação.
Especificamente para imagens 3D FRET, a resposta da sonda é altamente sensível à permeabilidade do hidrogel ao analito (Figura 6). Portanto, as mesmas regiões de hidrogel são comparadas entre os tratamentos experimentais, de preferência em um ponto de simetria geométrica, como próximo ao centro do andaime, conforme usado aqui. Alternativamente, câmaras / biorreatores microfluídicos podem ser empregados para perfundir rápida e uniformemente o hidrogel com solução analita45. Um sinal FRET pode não ser detectado (a relação sinal-ruído é muito baixa) quando a autofluorescência do hidrogel é muito alta; Um hidrogel mais fino ou uma sonda diferente (fluoróforos diferentes) devem ser usados. Com relação à imagem 3D FRET em hidrogéis fotoreticulados, recomenda-se o uso de exposição mínima à irradiação e comprimentos de onda fora dos espectros de excitação dos fluoróforos da sonda. O LAP pode ser usado com uma fonte de luz visível a 405 nm para minimizar ainda mais o dano celular potencial31,46. No entanto, o uso de LAP com irradiação de 365 nm é recomendado porque isso minimiza o branqueamento da sonda. 365 nm situa-se na extremidade final do espectro de excitação do doador CFP, enquanto 405 nm situa-se no pico de excitação. Como alternativa, a expressão do teste pode ser recuperada por um dia. O uso de sondas binárias minimiza questões de sensibilidade a diferenças nos níveis de expressão e na difusão molecular dos fluoróforos doadores e aceptores. Sondas não binárias podem ser usadas, mas com SE em vez de imagem QE e correção adicional para sangramento espectral de espectros de excitação e emissão (veja abaixo). Além disso, a baixa disponibilidade comercial e a complexidade no projeto de sondas FRET podem ser um obstáculo. O fator mais crítico para experimentos bem-sucedidos continua sendo a correção e análise adequadas dos sinais de fluorescência.
Um cálculo alternativo da razão FRET é utilizado por várias razões adicionais, além da minimização do fotobranqueamento. Para sondas binárias de cadeia única, a razão comumente relatada é a emissão do doador sob excitação do doador (emissão sensibilizada, SE) para a emissão do doador sob excitação do doador (emissão extinta, QE), ou seja, razão FRET = SE/QE25,47,48. SE/QE é não linear em relação às mudanças na eficiência do FRET21,22,47. Ou seja, a razão tem uma relação exponencialmente não linear com a eficiência FRET inerente da sonda (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM trabalho não publicado. (2015)), com a proporção mais linear para Ei inferior a aproximadamente 15%. SE/QE também subestimará a fração de sondas ativadas (FAP, ou seja, fração de analito de ligação de sondas). Portanto, a análise de SE/QE requer um estudo complicado de resposta à dose de equilíbrio e ajuste de curva. Felizmente, as razões de SE ou QE para a emissão do aceptor sob excitação do aceptor (Aem) são lineares em relação a Ei e ao FAP, ou seja, as razões FRET SE/Aem e QE/Aem. SE/Aem é frequentemente usado para sondas binárias e requer apenas calibração de ponto final (sem atividade de sonda e atividade total da sonda), mas a sinalização celular basal torna isso difícil. Para eliminar a necessidade de calibração de ponto final, o SE pode ser corrigido (cSE) para sobreposição espectral de espectros de excitação e emissão de doadores e aceptores (sangramento espectral) e para o rendimento quântico e sensibilidade espectral (QS) dos fluoróforos de sonda combinados e sistema de imagem microscópica. A razão SE FRET corrigida com base em cSE define a eficiência FRET observada das sondas dentro de cada pixel de uma imagem, ou seja, ESE = cSE/Aem. Software comercial e livre está disponível para corrigir o SE para esses efeitos e o leitor é encaminhado para o trabalho de Chen e Periasamy 2006 para uma explicação detalhada dos métodos50. No entanto, o cálculo de ESE requer a captura de três canais de imagem por ponto de tempo (SE, QE, Aem). Portanto, neste trabalho também empregamos uma razão FRET alternativa EQE = 1 - QE/cAem, que requer a captura de apenas dois canais de imagem (QE e Aem). O cálculo de EQE desses canais requer apenas a correção de Aem para QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem/Aem é facilmente estimado usando duas imagens de uma amostra de calibração, onde Dem é a emissão do doador sob excitação do doador com o aceptor branqueado. O FAP a qualquer instante pode ser calculado comparando ESE ouE QE com o Ei da sonda.
Em última análise, a seleção da razão FRET (ESE = cSE/Aem vs. EQE = QE/cAem) deve ser baseada na consideração do tipo de sonda e dos canais com melhor sinal. Ambas as abordagens incluem correção de ruído de fundo de imagens por quadro, conforme descrito acima, para levar em conta as mudanças na autofluorescência ao longo do tempo. Eles não assumem nenhuma sobreposição da luz de excitação Aem no espectro de excitação Dem, o que geralmente é o caso devido ao design da sonda e à configuração do filtro do microscópio. As sondas de cadeia única podem usar qualquer um e a seleção é baseada no melhor sinal da sonda (brilho) para o ruído da câmera e para o sinal de fundo nos canais SE e QE. Para a sonda ICUE1 e as condições experimentais usadas aqui (tipos de células e hidrogel), SE tem um sinal mais forte do que QE. As sondas de cadeia dupla requerem o uso de ESE devido à distribuição não equimolar de fluoróforos doadores e aceptores. Para sondas que diminuem em FRET ao ligar o analito, como ICUE1, a eficiência do FRET pode ser "invertida" para apresentar uma mudança de sinalização positiva ao ligar o analito como fazemos aqui, com ESE = 1 - cSE/Aem ou EQE = QE/(Aem x QS).
A análise da PAF é sensível à correção adequada dos índices de FRET e à estimativa de Ei. Pode ser estimado com a mesma amostra de calibração usada para QS e um ensaio de eficiência FRET de endpoint convencional como Ei = 1-(QE/Dem) (imagem QE seguida de fotobranqueamento do aceptor e uma imagem Dem)28, mas deve-se tomar cuidado para minimizar o branqueamento acidental do doador. Descrevemos uma versão modificada em que a estimativa de Dem com base em Aem ajustada para QS é substituída, ou seja, Ei = 1 - (QE/(Aem x QS)). Alternativamente, Ei = cSE/Aem pode ser usado. A estimativa de Ei em células vivas requer que todas as sondas sejam conduzidas ao FRET completo. Isso é difícil de conseguir na prática para sondas, como ICUE1, que diminuem no FRET ao ligar o analito. Um cálculo in vitro de Ei usando lisados celulares e analito purificado é o melhor, mas fora do escopo deste trabalho. Aqui, recomendamos o uso de 2′,5′-didesoxiadenosina para diminuir o cAMP nas células. No entanto, um PAF relativo pode ser calculado usando uma estimativa de Ei derivada do nível basal de sinalização. Por esses motivos, os estudos geralmente relatam a razão FRET (como feito aqui) ou um FAP relativo com base na calibração do endpoint, onde a linha de base de sinalização antes da adição do agonista é o limite inferior e o sinal após a adição de um segundo agonista que satura a sinalização é o limite superior. A forscolina é frequentemente usada como um agonista de controle para saturar o sinal de cAMP. Alternativamente, um análogo de cAMP pode ser usado, como 8-Bromoadenosina 3',5'-monofosfato cíclico. Recomenda-se o uso de controles positivos na conclusão dos estudos para identificar possíveis alterações na via de sinalização entre os tratamentos experimentais.
O cálculo da resposta média de sinalização por célula requer a consideração de vários fatores. Primeiro, a razão FRET média deve ser calculada como a média das proporções em cada pixel dentro de uma célula, ou seja, (∑(QE⁄cAem))/(número de pixels), em vez da proporção da média QE e Aem em uma célula, ou seja, (∑QE)⁄(∑cAem). Embora este último não exija um mascaramento cuidadoso, pois o ruído de fundo é baixo, ele subestima severamente a verdadeira taxa média de FRET. No entanto, as proporções de pixels exigem cálculo de ponto flutuante e mascaramento binário cuidadoso da área da célula para definir as ROIs e evitar a inclusão de proporções espúrias geradas a partir do ruído de fundo fora da célula. Toda a área celular deve ser quantificada para evitar viés nos resultados da forma celular. O mascaramento pode precisar ser redefinido ao longo do tempo, dependendo das mudanças na forma da célula e da migração. Como alternativa, ROIs maiores que a célula podem ser usadas se os critérios de exclusão forem definidos para remover proporções de pixels de sinais QE e Aem que ficam bem abaixo dos níveis celulares e estão próximos dos níveis de fundo. Os métodos de análise descritos detalham as etapas básicas usadas neste trabalho para análise de FRET sem software/plugins especializados. Os fabricantes de microscópios e outros fornecedores vendem módulos adicionais para seu software de microscópio, que suportam análise raciométrica automatizada e FRET. Da mesma forma, o software ImageJ de domínio público possui vários plugins disponíveis para análise de partículas e FRET, como o RiFRET. Em segundo lugar, a razão FRET média baseada em pixels subestima a verdadeira proporção média da estrutura celular 3D porque uma imagem 2D é usada. Os sinais 2D representam e calculam a média ao longo do eixo z. O cálculo da distribuição espacial 3D das razões FRET em células vivas não é possível sem imagens 3D de alta velocidade (por exemplo, usando microscopia confocal de disco giratório). Este é um problema para culturas 2D e 3D, mas tem um efeito maior em 3D, pois mais da estrutura celular existe fora do plano. Isso é de grande preocupação para sondas que se localizam em estruturas celulares, como a sonda de membrana plasmática EPAC1 PM-ICUE. Ver Spiering et al. 2013 para sugestões para corrigir os efeitos da espessura celular nos cálculos de proporção24. A análise da distribuição de Aem pode ser usada para detectar se a sonda se acumula em regiões da célula e no plano de imagem ajustado. Isso também ajudará a interpretar a distribuição espacial das razões FRET e a eliminar resultados espúrios, por exemplo, identificando a saturação da sonda (ou seja, uma região Aem baixa terá baixa concentração de sonda e pode exibir saturação da sonda e alta razão FRET). Em terceiro lugar, diferentes níveis basais de FRET podem indicar uma diferença na eficiência da transfecção, expressão da sonda ou sinalização basal entre os grupos experimentais. A "Análise Relativa" (Etapa 10.1.1) ajuda a remover o desvio na razão FRET ao longo do tempo, se presente. Facilita a comparação da magnitude relativa das respostas entre as amostras, mas impede a comparação com o curso temporal da resposta para a amostra de referência (o gráfico de controle é uma linha plana). A "Análise Absoluta" (Etapa 10.1.2) facilita a comparação da taxa de resposta entre as amostras, mas dificulta a comparação da magnitude da resposta porque cada linha é dimensionada por uma constante diferente. Os estudos geralmente usam uma regressão linear na linha de base para corrigir o desvio na razão FRET ao longo do tempo.
O método 3D FRET descrito é uma maneira útil e prática de fabricar e realizar imagens de lapso de tempo de hidrogéis 3D carregados de células, que podem ser aplicados a outras sondas e modalidades de imagem. Outros sistemas FRET além de sondas binárias de cadeia única exigirão uma correção mais complexa de sinais baseados em intensidade, conforme discutido acima. Como alternativa, a imagem de fluorescência durante o tempo de vida do FRET (FLIM-FRET) pode ser usada para calcular a eficiência do FRET por meio de uma mudança no tempo de vida de emissão do doador da sonda. Ao contrário do FRET baseado em intensidade, o FLIM-FRET é insensível ao ruído de fundo, sangramento espectral, eficiência quântica e sensibilidade espectral do detector2. No entanto, os sistemas FLIM são caros, complexos e incomuns, e funcionam melhor com fluoróforos com decaimento de expoente único e sem escoamento FLIM 49. O método descrito também pode ser usado com plataformas de microscópio mais avançadas (por exemplo, FRET-TIRF, anisotropia de fluorescência e correlação espectral FRET). A aplicação deste método a imagens 3D com microscopia confocal e multifotônica de alta velocidade facilitará a análise da distribuição subcelular da resposta de sinalização e aumentará a precisão da análise de sinalização. Este método FRET 3D permitirá estudos avançados de biologia celular em microambientes celulares 3D simulados. Como tal, pode ser prontamente aplicado às necessidades de farmacologia e medicina regenerativa, incluindo o estudo da sinalização intercelular e a triagem da resposta a medicamentos em microtecidos à base de hidrogel projetados.

A sinalização celular é complexa e consequente para vários campos, incluindo farmacologia, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Ferramentas investigativas úteis são necessárias para aprofundar nossa compreensão da biologia celular e desenvolver materiais ideais para a regeneração de tecidos. A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta essencial que permite a análise da ativação do receptor, conformação molecular e interações supramoleculares (por exemplo, complexação de proteína/DNA) em células vivas. FRET é um tipo de transferência de energia não radiativa entre fluoróforos1. Tem uma eficiência inversamente proporcional à sexta potência da distância entre um fluoróforo doador e um fluoróforo aceptor. Assim, ele pode fornecer informações sobre a distância espacial entre duas moléculas diferentes ou entre regiões de uma molécula na escala nanométrica (normalmente 1 - 10 nm)2. Os fluoróforos doadores e aceptores podem ser de diferentes tipos de moléculas (hetero-FRET), nos quais o doador tem a maior emissão de energia (menor comprimento de onda), ou do mesmo tipo (homo-FRET). A imagem FRET pode ser realizada em células fixas ou vivas, mas, em geral, as células fixas são usadas para imagens de interações moleculares em alta resolução espacial quando os sistemas confocais de alta velocidade não estão disponíveis. As células vivas são usadas para estudar interações e processos que são inibidos ou alterados pela fixação, como a resposta de sinalização intracelular em tempo real3.
Estudos de células vivas que empregam imagens FRET usam culturas celulares bidimensionais (2D) em parte devido à simplicidade e menor fundo (sem emissão de células fora do plano). No entanto, as culturas 2D também alteram vários processos celulares em comparação com o microambiente fisiológico e a cultura tridimensional (3D)4,5. Por exemplo, as interações célula a célula nativa e célula a matriz extracelular são drasticamente alteradas na cultura 2D, levando a mudanças facilmente observadas na morfologia e polaridade celular6. Os microdomínios da membrana (por exemplo, cavéolas e jangadas lipídicas) e a sinalização do receptor são fortemente regulados pelo ambiente de cultura, em parte porque se ligam aos componentes do citoesqueleto7,8 e a forma da célula e a estrutura do citoesqueleto são fortemente reguladas pelo ambiente de cultura espacial9. A mecanotransdução não é apenas influenciada pela matriz 3D, mas pelas condições de carga secundária mais complexas geradas em ambientes 3D em comparação com culturas 2D10. Finalmente, a permeabilidade das matrizes 3D é menor que a do meio de cultura, em geral com diminuição da difusão e aumento da ligação das moléculas de sinalização celular em comparação com as culturas 2D. Com as culturas 3D, é possível criar e observar um microambiente mais semelhante ao fisiológico no que diz respeito a pistas adesivas, químicas e mecânicas. As interações célula a célula podem ser promovidas e as propriedades adesivas podem ser controladas com a estrutura, composição e arquitetura (padronização) do material 3D11-13. As propriedades mecânicas do material também podem ser adaptadas pela composição e estrutura14,15. A cultura de células em hidrogéis, portanto, permite estudos de FRET em células primárias que, de outra forma, se desdiferenciariam ou mudariam de fenótipo usando técnicas convencionais, por exemplo, células da cartilagem articular. Assim, é necessário um método para permitir ensaios FRET em culturas 3D vivas.
Os andaimes de hidrogel são ideais para estudos baseados em FRET 3D porque podem ser feitos opticamente transparentes e adaptados para controlar o microambiente e fornecer pistas celulares. Hidrogéis feitos de polímeros naturais têm sido usados em cultura de células há décadas, incluindo gelatina e fibrina16. Maior controle sobre o microambiente celular pode ser alcançado com a modificação química desses polímeros e com o uso de polímeros sintéticos17,18. A rigidez mecânica e a permeabilidade do hidrogel podem ser controladas alterando sua composição polimérica e tamanho da malha (densidade do polímero e da reticulação)19,20. Além disso, os hidrogéis podem se tornar bioativos por meio da incorporação de fatores de crescimento e ligantes celulares. Devido a essas possibilidades, o desenvolvimento de hidrogéis para aplicações de biossensoriamento, administração de medicamentos e engenharia de tecidos é uma área de pesquisa muito ativa21. A impressão 3D de hidrogéis também está em desenvolvimento para a fabricação de microtecidos e órgãos15. Assim, a imagem FRET de células em hidrogéis não é apenas útil como um meio de aproximar o comportamento celular fisiológico, mas também como uma ferramenta para estudar e otimizar o crescimento de tecidos projetados.
As sondas FRET raciométricas binárias são muito úteis no estudo da sinalização celular e podem ser utilizadas em culturas de hidrogel. Para obter uma lista parcial de sondas fluorescentes e FRET publicadas, consulte o site do Cell Migration Consortium22. O tipo de sonda mais comum contém dois fluoróforos diferentes que estão associados ou ligados por um elemento de reconhecimento (região) sensível ao analito. Essas regiões sofrem uma mudança, associação ou dissociação conformacional após a detecção do analito (por exemplo, ligação de um íon ou molécula, clivagem enzimática da região) que altera a distância entre os fluoróforos e, portanto, a magnitude do FRET (maior ou menor) 23 . Um tipo de sonda menos comum, mas útil, depende de uma mudança sensível ao analito na sobreposição espectral dos dois fluoróforos, o que altera a magnitude do FRET. As sondas raciométricas de "cadeia única" utilizam um par de fluoróforos ligados em uma única molécula. As sondas de "cadeia dupla" utilizam pares de fluoróforos em moléculas separadas, mas sua expressão pode ser acoplada sob o mesmode expressão 24. Ao contrário dos estudos com expressão de fluoróforo único (por exemplo, proteínas de fusão fluorescentes), os estudos com sondas FRET raciométricas não requerem transfecção dupla para controlar a eficiência da transfecção ou a viabilidade celular. As sondas FRET raciométricas são relativamente insensíveis à eficiência da transfecção quando expressas acima de um limite mínimo (insensível à concentração) 23 , 25 . Eles são insensíveis às flutuações da fonte de excitação e outros fatores do ambiente intracelular (por exemplo, pH, íons), desde que ambos os fluoróforos sejam responsivos de forma semelhante. Além disso, sua resposta não está sujeita a atraso transcricional, ao contrário das construções promotoras-repórter fluorescentes e bioluminescentes26,27.
As sondas FRET raciométricas são fácil e frequentemente empregadas em sistemas convencionais de microscópio de epifluorescência de campo amplo. Os microscópios de campo amplo são preferidos aos sistemas confocais de varredura de linha para imagens de células vivas devido a preocupações com o custo do sistema, branqueamento de fluoróforos e captura de alterações de sinal com resolução temporal suficiente. Além disso, a análise de célula única em uma grande população de células é possível com uma platina motorizada e captura de imagem em vários campos de visão. A microscopia de campo amplo requer análise baseada em intensidade dos sinais da sonda hetero-FRET. Embora a análise de intensidade não exija hardware complexo como outros métodos FRET, é necessário mais trabalho pós-aquisição para corrigir os efeitos dos comportamentos dos fluoróforos e das configurações do sistema de microscópio / imagem28. A intensidade de emissão capturada de um fluoróforo é uma função da energia de excitação, do rendimento quântico do fluoróforo e da sensibilidade e linearidade espectral combinada do filtro e da câmera/detector2. Estes podem ser diferentes para o doador e o aceitador e exigirão calibração para análise quantitativa. Além disso, a imagem da emissão do aceptor é influenciada pela sobreposição espectral dos fluoróforos (excitação do aceptor pela luz de excitação do doador e sangria da emissão do doador nos espectros de emissão do receptor)2. As sondas de "cadeia única" são normalizadas internamente porque seus fluoróforos são equimolares em nanoescala, enquanto os fluoróforos das sondas de "cadeia dupla" podem existir em diferentes estequiometrias em uma célula25,28. Se os fluoróforos das sondas de "cadeia única" tiverem brilho semelhante (função do coeficiente de extinção e do rendimento quântico), os efeitos da sensibilidade não linear do detector são pequenos e apenas a correção para a fluorescência de fundo e o rendimento quântico acoplado / sensibilidade do detector é necessária23. Assim, as sondas FRET raciométricas de "cadeia única" são mais facilmente implementadas em microscopia de campo amplo24.
Este artigo descreve uma técnica simples para realizar imagens FRET de células vivas em culturas de hidrogel 3D usando um microscópio epifluorescente convencional de campo amplo. Pode ser facilmente adotado por laboratórios que já realizam experimentos de FRET em 2D, bem como laboratórios interessados em sinalização intercelular em microtecidos. Aqui, demonstramos o método com medição baseada em imagem FRET dos níveis de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) em condrócitos vivos em hidrogéis de fotoreticulação (gel PC, dimetacrilato de polietilenoglicol) e termorresponsivos (gel TR, Matrigel). Uma sonda FRET raciométrica é utilizada com base em EPAC1 (ICUE1) para detectar os níveis de cAMP em resposta à forscolina, um agonista químico da adenilil ciclase que catalisa a conversão de ATP em cAMP. O cAMP é um dos principais segundos mensageiros que medeiam a sinalização do receptor acoplado à proteína G e ativa vários fatores, incluindo proteínas de troca a jusante diretamente ativadas pelo cAMP (EPACs). Os fluoróforos se separam após a ligação do cAMP ao domínio EPAC, resultando em uma diminuição no FRET. Aqui é descrita a preparação dos materiais de hidrogel, a transfecção celular com a sonda ICUE1 e a incorporação das células em hidrogéis 3D. O procedimento do experimento 3D FRET e a análise de imagem necessária para avaliar a atividade da sonda por célula são explicados. Também discutimos as limitações inerentes à análise FRET em 2D e 3D usando microscopia de campo amplo. A técnica aqui apresentada é uma melhoria em relação aos métodos 2D existentes, pois permite a análise em um contexto mais fisiológico e requer menos correção e calibração da imagem. Grande utilidade reside no fato de que muitos materiais transparentes podem ser usados enquanto as preferências de células e transfecção podem ser mantidas.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Sylgard 184]</td><td>Fisher Scientific (Adesivos Ellsworth)</td><td>NC0162601</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Dimetacrilato de Polietilenoglicol (PEGDM)</td><td>Preparado de acordo com Lin-Gibson com PEG da Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>3- (Trimetoxissilil)metacrilato de propila</td><td>Reagentes Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td></td></tr><tr><td>3- glicidoxipropiltrimetoxissilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Dimetil Fenilfosfonita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes 2,4,6-trimetilbenzoíla Cloreto</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>2-Butanona</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Brometo de Lítio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>190764 Reagentes</td></tr><tr><td>Sigmacote (reagente siliconizante)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Tolueno&nbsp;</td><td>Reagentes Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tamponados com Fosfato Salino (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Opti-MEM Soro Reduzido Médio, sem vermelho de fenol (meio sem fenol e soro)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>FuGENE HD Reagente de Transfecção (reagente de transfecção)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Cellstripper (célula solução de dissociação)</td> <td>Reagentes Corning</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>Redução do Fator de Crescimento Matrigel, Livre de Fenol</td><td>Reagentes 356231 Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta (10,200,1,000 &mu; l)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Luvas de exame sem pó</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Punção de biópsia (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro pré-revestidas (epóxisilano)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Frascos estéreis (15 ml, 50 ml cônicos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Prato de cultura de células (6- bem)</td> <td>Falcon</td><td>351146</td><td>Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>Microscópio epifluorescente com platina motorizada</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE invertido)</td><td>Equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Suporte de amostra ajustável para palco XY</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>60X (1.3 NA) objetivo (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td> <td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Fonte de luz CFP/YFP e suportes de filtro de excitação/emissão (fonte de luz e roda Lambda, sistema de filtro de emissão Lambda)</td><td>Nikon (revendedor Sutter Instrument)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Equipamento de laboratório não descartável Conjunto de</td></tr><tr><td>filtros CYF/YFP</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Câmera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu revendedor)</td><td>77054076</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 software de microscópio</td>)<td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Prism (software de planilha e gráfico)</td> <td>GraphPad Software, Inc</td><td>Versão 6 Equipamento</td><td>de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 UV Sistema de Lâmpada de Cura a Ponto com filtro de 365nm ou outra fonte de luz (&lambda; = 365 ou 405)</td> <td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Auxiliar de pipeta&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>DP-100</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Câmara de dessecador a vácuo/desgaseificador&nbsp;</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Capuz para Cultura de Tecidos&nbsp;</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Capuz de Fumaça Química&nbsp;</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Copo</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório não descartável</td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td><td>Qualquer</td><td></td><td>equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr></tbody></table>

fret imaging no hidrogéis tridimensionais

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

A imagem da transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para examinar a biologia celular em tempo real. Estudos que utilizam FRET geralmente empregam cultura bidimensional (2D), que não imita o microambiente celular tridimensional (3D). Um método para realizar imagens FRET de emissão extinta usando microscopia convencional de epifluorescência de campo amplo de células dentro de um ambiente de hidrogel 3D é apresentado. Aqui é descrito um método de análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação da sonda. A medição dos níveis intracelulares de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é demonstrada em condrócitos sob estimulação de forscolina usando uma sonda para ativação de EPAC1 (ICUE1) e a capacidade de detectar diferenças na sinalização de cAMP dependendo do tipo de material de hidrogel, aqui um hidrogel de fotoreticulação (PC-gel, polietilenoglicol dimetacrilato) e um hidrogel termorresponsivo (TR-gel). Comparado com os métodos 2D FRET, esse método requer pouco trabalho adicional. Os laboratórios que já utilizam imagens FRET em 2D podem facilmente adotar esse método para realizar estudos celulares em um microambiente 3D. Pode ainda ser aplicado à triagem de medicamentos de alto rendimento em microtecidos 3D projetados. Além disso, é compatível com outras formas de imagem FRET, como medição de anisotropia e imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM), e com plataformas avançadas de microscopia usando iluminação confocal, pulsada ou modulada.

Todos os precursores de hidrogel, células e moldes de vazamento foram preparados conforme descrito anteriormente. As soluções precursoras contendo células foram vazadas em moldes de PDMS e, em seguida, centrifugadas antes da gelificação/fotocruzamento para imobilizar as células próximas à lamínula e facilitar a análise de imagem por FRET (Figura 1). Os hidrogéis com lamínulas aderidas foram colocados em poços de imagem de PDMS preparados para aquisição microscópica (Figura 2). As configurações ópticas e os parâmetros de aquisição de imagem foram então definidos conforme mostrado na Figura 3A. A captura dos quatro canais de imagem relacionados ao FRET para pares de fluoróforos CFP-YFP é demonstrada (veja em &#34;Conf. Ópt.&#34; na Figura 3), conforme necessário para sondas não binárias. No entanto, neste trabalho, apenas duas imagens são necessárias para a sonda binária de cadeia única ICUE1, QE = &#34;CFP CFP&#34; e Aem = &#34;YFP YFP&#34; (excitação emissão). Múltiplos campos de visão (posições xy) foram selecionados nos quais várias células estavam localizadas dentro da área de iluminação homogênea (Figura 3B). Após a aquisição com lapso de tempo, os dados de sinal da sonda foram exportados. As ROI para correção de fundo dos sinais dos canais e para análise celular foram definidas usando imagens de Aem com limiar definido a partir do início dos experimentos (Figura 4). As células foram selecionadas entre o grupo como aquelas que expressavam quantidade suficiente (nem muito fraca), mas não excessiva (muito intensa) da sonda (Figura 4B). As razões de FRET QE e SE por pixel em cada aquisição foram calculadas por divisão em ponto flutuante dos canais de imagem com fundo subtraído. A razão média de FRET por célula (ou seja, por ROI) foi calculada, normalizada em relação ao sinal basal anterior à estimulação (ou seja, uma regressão na linha de base subtraída de todos os pontos temporais) e representada graficamente com barras de erro como erro padrão da média (EPM). Tanto as razões de FRET baseadas em QE quanto em cSE detectaram o aumento da atividade de cAMP em condrócitos sob estimulação com forskolina (100 nM, Figura 5). A razão de FRET QE foi mais sensível à correção de fundo do que a razão de FRET cSE, pois o sinal QE era mais baixo devido ao nível basal reduzido de atividade de cAMP em condrócitos incorporados nos hidrogéis. Ambos os tipos de hidrogel (TR-gel e PC-gel) mostraram aumento na razão de FRET ao longo do tempo (Figura 6), indicando uma resposta aumentada de sinalização de cAMP à adição de forskolina. Conforme indicado pela razão de FRET QE, condrócitos em hidrogéis de PC-gel apresentam uma alteração maior no cAMP (mostrada) e um nível basal mais elevado de cAMP (EQE = 0,19 no PC-gel vs. EQE = 0,09 no TR-gel, não mostrado na figura com subtração da linha de base).
<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 
Figura 1: Distribuição Celular em Hidrogel Fotocruzado (PC-gel) 
A: O precursor do hidrogel carregado com células foi centrifugado para maximizar o número de células em um plano focal próximo à lamínula. B: Isso aumenta o número de células no campo de visão (FOV) e minimiza o sinal de fundo proveniente de células fora do plano focal. (Barra de escala = 200 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 
Figura 2: Hidrogel em recipiente de PDMS 
O hidrogel foi colocado dentro de um poço alto de PDMS (10x o volume do hidrogel) com base de lamínula para imageamento microscópico e estimulação de analitos. Os hidrogéis de PC-gel são transparentes e aderidos à lamínula, permanecendo fixos durante todo o ensaio. O poço de PDMS pode ser fabricado maior para conter 10x mais meio do que o volume do hidrogel, utilizando um furador de biópsia mais largo, além de uma lâmina de PDMS mais espessa. (Barra de escala = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 
Figura 3: Configuração de Aquisição para Imagem de FRET 
A: A aquisição foi configurada para captura de imagem a cada 7 segundos em múltiplas localizações. Para o cálculo da razão FRET QE, apenas dois canais de imagem são necessários para a sonda ICUE1 utilizada aqui (sonda de cadeia única binária), QE = &#34;CFP CFP&#34; e Aem = &#34;YFP YFP&#34; (excitação emissão) na coluna &#34;Conf. Óptica&#34; na aba&#160;λ do software do microscópio. B: Os campos de visão (&#34;XY&#34; posições) foram selecionados de modo que várias células estivessem dentro da área de iluminação homogênea. O gráfico abaixo da imagem mostra a intensidade de iluminação ao longo da linha indicada pela seta azul que atravessa o centro do campo de visão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 
Figura 4: Seleção de ROIs para Análise de Imagem FRET 
A: Uma região de interesse (ROI) livre de células foi selecionada para correção do sinal de fundo em cada canal. Uma imagem de um hidrogel sem células pode ser usada alternativamente para subtração de fundo caso a densidade celular ou a migração sejam altas, ou se uma máscara de sombreamento não for utilizada quando as células não estiverem em um campo de iluminação homogêneo. B: As ROIs celulares foram selecionadas utilizando limiarização da imagem e máscara binária do canal Aem. Selecionar uma ROI maior do que as células afetará negativamente o cálculo da razão média de FRET por célula, devido à inclusão de razões extracelulares geradas pelo ruído de fundo. Não se recomenda o cálculo da razão celular de FRET usando a média de cada canal por célula, pois isso subestima a razão. (Barra de escala = 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 
Figura 5: Comparação das Razões FRET em Hidrogel Termorresponsivo (TR-gel) 
As razões FRET baseadas em QE e SE detectam o aumento da atividade de cAMP em condrócitos sob estimulação com forskolina. A forskolina é um agonista da adenilato ciclase que induz a produção de cAMP. O FRET diminui quando a sonda ICUE1 se liga ao cAMP, e, portanto, a razão FRET de QE (EQE&#160;= sQE/(sAem x QS)) aumenta. Em contrapartida, a razão FRET de SE diminui e, por isso, é representada como ESE&#160;= 1 - cSE/sAem. Em condrócitos incorporados em hidrogel, a razão FRET de QE é mais sensível à correção de fundo do que a razão FRET de SE, porque o sinal de QE é baixo devido à baixa atividade basal de cAMP. Barras de erro = erro padrão da média (SEM), n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 
Figura 6: Comparação da Razão FRET em Diferentes Hidrogéis 
Os condrócitos em ambos os tipos de hidrogel responderam à estimulação com forskolina com um aumento na atividade de cAMP, conforme demonstrado pelo aumento da razão FRET QE ao longo do tempo. O tipo de hidrogel influencia a resposta celular por meio de diversos efeitos, incluindo diferenças na permeabilidade à forskolina e na atividade basal de cAMP celular (EQE = 0,19 no gel-PC vs. EQE = 0,09 no gel-TR, não mostrado). Barras de erro = erro padrão da média (SEM), n para gel-TR = 25, n para gel-PC = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para estudos de biologia celular em tempo real. Aqui é apresentado um método para imagens de células FRET em microambientes fisiológicos de hidrogel tridimensional (3D) usando microscopia de epifluorescência convencional. Uma análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação é descrita.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

O objetivo geral deste método experimental é permitir o estudo em tempo real da sinalização intracelular por meio da imagem de FRET de células incorporadas em hidrogéis tridimensionais que mimetizam tecidos naturais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia do desenvolvimento, farmacologia e medicina regenerativa, como o desenvolvimento de biomateriais ideais e a triagem de alta produtividade de fármacos em microtecidos tridimensionais projetados. A principal vantagem desta técnica é que o FRET pode ser utilizado em um grande número de células em diversos tipos de hidrogel, empregando sistemas convencionais de microscopia de campo amplo.Após fabricar moldes para a moldagem de hidrogéis e suspender células cultivadas em solução de hidrogel, de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione, em uma cabine de cultura de tecidos, o precursor contendo células aos moldes de moldagem utilizando técnica estéril. Antes da reticulação, centrifugue as células suspensas no precursor de hidrogel para otimizar a imagem, confinando as células a um único plano focal e minimizando o sinal fora do plano. Em seguida, para reticular os hidrogéis de PC, utilize uma fonte de luz UVA por um tempo de exposição equivalente a 3,2 joules por centímetro quadrado por milímetro de espessura, para irradiar o precursor contendo células.Alternativamente, utilize uma lâmpada dental manual menos cara. Evite expor excessivamente o hidrogel, pois isso reduzirá a viabilidade celular. Os hidrogéis reticulados fisicamente são colocados a 37 graus Celsius.Após a reticulação, remova o molde de vazamento do hidrogel de PDMS e substitua-o pelo recipiente de PDMS previamente preparado. Use uma espátula estéril para pressionar o PDMS contra o vidro, a fim de fixá-lo. Adicione ao poço formado no recipiente de PDMS com lamínula um meio sem soro livre de fenol ou um meio quimicamente definido, mantendo o hidrogel imerso.Incube o recipiente a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após o recipiente de PDMS com o hidrogel ter sido fixado na platina do microscópio e o óleo ter sido aplicado na objetiva, utilize luz transmitida para localizar pelo menos 15 células para aquisição de imagens e verifique a transfeção por meio de imagem de fluorescência. No software do microscópio, configure as configurações da câmera para os canais de imagem FRET escolhendo algumas células próximas ao centro do campo de visão e otimize o tempo de exposição e o ganho para cada canal de imagem conforme descrito no protocolo textual.Escolha células que estejam próximas ao centro do hidrogel, dentro do campo de iluminação relativamente plano, que não sejam nem muito brilhantes nem muito fracas, e com uma razão de FRET entre 0,0 e 1,0. Em seguida, selecione múltiplos campos de visão para adquirir imagens de pelo menos 15 células transfectadas. Desligue a luz ao finalizar para limitar a exposição.Para configurar a taxa de captura para a aquisição de imagens em lapso de tempo, insira a periodicidade das capturas. Utilize uma taxa rápida para a captura do sinal de referência, como a cada cinco segundos por campo de visão, e uma taxa mais lenta para a cinética de sinalização subsequente de longo prazo. Selecione Executar agora para iniciar a aquisição de imagens e capturar imagens durante cinco minutos, a fim de estabelecer uma linha de base para a resposta da sonda no campo de visão designado.Após os cinco minutos de aquisição de imagens, adicione com pipeta o agonista ou antagonista desejado, misture por pipetagem e continue a obtenção de imagens. Após realizar a calibração de FRET de acordo com o protocolo descrito, no software do microscópio selecione a seta no ícone da região de interesse de fundo e escolha Desenhar Região de Interesse Elíptica de Fundo. Desenhe e designe uma região de interesse, ou ROI, por campo de visão próximo às células para definir o nível de fundo.Garanta que a opção Manter Atualização do Deslocamento de Fundo esteja selecionada, então ative a visualização da região de interesse do fundo clicando no ícone Região de Interesse do Fundo. Alternativamente, selecione o ícone de região de interesse e defina as propriedades da região de interesse como Usar como Região de Interesse de Fundo e Regiões de interesse são diferentes em cada Ponto Múltiplo. Usando o ícone de fundo da região de interesse, selecione Subtrair Fundo Utilizando Região de Interesse.No menu suspenso, em Subtrair Região de Interesse de Fundo, selecione Toda Imagem e em Aplicar A, selecione Todos os Quadros. Para cada campo de visão, para definir uma região de interesse ao redor da célula utilizando o canal de emissão do aceptor e uma máscara binária, use o menu Binário, Definir Limiar e selecione Aplicar ao Quadro Atual. Em seguida, ajuste o limiar inferior para selecionar as células.Em seguida, utilize a função Binário Fechar para preencher os buracos na máscara binária, se necessário. Depois, use o ícone Região de Interesse para selecionar Copiar Binário para Região de Interesse, a fim de salvar a máscara binária como regiões de interesse. Acrescente as regiões de interesse para os campos subsequentes de visão ao conjunto existente de regiões de interesse.Exclua quaisquer regiões de interesse espúrias. Em seguida, clique com o botão direito nas Regiões de Interesse e verifique se suas propriedades estão definidas como Usar como Região de Interesse Padrão e Regiões de Interesse diferentes em cada Ponto Múltiplo. As regiões de interesse celulares podem ser desenhadas manualmente, mas é necessário ter cuidado para remover valores espúrios.O protocolo contém procedimentos para células que estão fora do campo de iluminação plano e para microscópios que não possuem campo plano. A centrifugação dos precursores do hidrogel antes da gelificação maximizou o número de células em um único plano focal próximo à lamínula. Isso minimizou o ruído de fundo e aumentou a produtividade do imageamento.Neste experimento de FRET, para o cálculo da razão FRET da emissão quenchada, ou QE, apenas duas imagens foram necessárias para a sonda binária de cadeia única ICUE1, incluindo QE igual a CFP para excitação e emissão, e emissão do aceptor igual a YFP para excitação e emissão. Vários campos de visão foram selecionados nos quais várias células estavam localizados na área de iluminação homogênea, conforme mostrado aqui. As ROI para correção de fundo dos sinais dos canais e para análise celular foram definidas utilizando imagens de emissão do aceptor com limiar definido no início dos experimentos.Além disso, conforme mostrado aqui, foram selecionadas células que expressavam sonda suficiente. As razões FRET por pixel baseadas na eficiência quântica (QE) e na emissão sensibilizada, bem como a razão média de FRET por célula, foram calculadas. O inverso da razão de emissão sensibilizada foi calculado e ambas as razões foram normalizadas.Sob a estimulação com forskolina, as razões FRET baseadas em QE e SE detectam o aumento da atividade de AMP cíclico em condrócitos. Tanto os géis fisicamente reticulados quanto os quimicamente reticulados mostraram um aumento na razão FRET de QE ao longo do tempo, indicando uma resposta aumentada de sinalização de AMP cíclico à adição de forskolina. Este procedimento pode ser usado com outras técnicas de microscopia, como FRAP, FLIM FRET e medidas de anisotropia, para responder perguntas como: quais são as diferenças na permeabilidade e na sinalização celular entre diferentes tipos de microtecidos?Como a reticulação é interrompida próximo ao PDMS, é importante lembrar de projetar as moldes para os hidrogéis foto-reticuláveis ligeiramente maiores em diâmetro do que os próprios hidrogéis.

fret-imaging-in-three-dimensional-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Foram utilizadas técnicas de microscopia e processamento de imagem com lapso de tempo para observar e analisar a compactação de gel mediada por fibroblasto e o realinhamento da fibra fibrina em um bioreator ambientalmente controlado durante um período de 48 horas.

Observando e quantificando compactação de gel de fibrina mediada por fibroblasto

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

Aqui, um protocolo é apresentado para encapsular e cultivo de células em hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) acrescida com um fluorogenic matriz metaloproteinase (MMP)-peptídeo degradável. Celular MMP e atividade metabólica são medidos diretamente a partir das culturas de hidrogel usando um leitor de microplacas padrão.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Este protocolo fornece instruções para implementar a litografia multifóton para fabricar matrizes tridimensionais de marcadores de referência fluorescente incorporados em hidrogéis de poli (etileno glicol) para uso como microscopia de força de tração, livre de referências Plataformas. Usando estas instruções, a medida da tensão material 3D e o cálculo de trações celulares são simplificados para promover medidas da força da tração da elevado-produção.

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.

Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

A litografia quase UV e a microscopia de força de tração são combinadas para medir forças celulares em hidrogéis micropatterados. A liberação induzida por luz direcionada de células únicas permite um alto número de medições na mesma amostra.

Controle da adesão celular usando técnicas de padronização de hidrogel para aplicações em microscopia de força de tração

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Aprenda imagem FRET em hidrogéis tridimensionais para estudar sinalização intracelular em tempo real usando microscopia de epifluorescência convencional. Este método permite análise de alta vazão em múltiplas células.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

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