FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

O objetivo geral deste método experimental é permitir o estudo em tempo real da sinalização intracelular usando imagens FRET de células incorporadas em hidrogéis tridimensionais que imitam tecidos naturais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, farmacologia e medicina regenerativa, como o desenvolvimento de biomateriais ideais e triagem de medicamentos de alto rendimento em microtecidos 3D projetados. A principal vantagem desta técnica é que o FRET pode ser usado em um grande número de células em vários tipos de hidrogel usando sistemas convencionais de microscópio de campo amplo.

Depois de fabricar moldes para fundição de hidrogel e suspender as células cultivadas em solução de hidrogel, de acordo com o protocolo de texto, em uma capa de cultura de tecidos, adicione a célula contendo precursor aos moldes de fundição usando técnica estéril. Antes da reticulação, centralize as células suspensas no precursor de hidrogel para otimizar a imagem, confinando as células a um único plano focal e minimizando o sinal fora do plano. Em seguida, para reticular hidrogéis de PC, use uma fonte de luz UVA por um tempo de exposição igual a 3,2 joules por centímetro quadrado por milímetro de espessura para irradiar a célula contendo o precursor.

Como alternativa, use uma lâmpada odontológica portátil mais barata. Evite a superexposição do hidrogel, pois isso diminuirá a viabilidade celular. Os hidrogéis de reticulação física são colocados a 37 graus Celsius.

Após a reticulação, remova o molde de fundição de hidrogel PDMS e substitua-o pelo prato PDMS previamente preparado. Use uma espátula estéril para pressionar o PDMS no vidro para aderi-lo. Adicione meio sem fenol sem soro ou um meio quimicamente definido ao poço criado no prato PDMS com uma lamínula para manter o hidrogel imerso.

Incube o prato a 37 graus Celsius por 30 minutos. Uma vez que a placa PDMS com o hidrogel tenha sido fixada no estágio do microscópio e o óleo tenha sido aplicado à objetiva, use a luz transmitida para encontrar pelo menos 15 células para imagem e verifique a transfecção com imagem de fluorescência. No software do microscópio, defina as configurações da câmera para os canais de imagem FRET escolhendo entre algumas células próximas ao centro do campo de visão e otimize a exposição e o ganho por canal de imagem de acordo com o protocolo de texto.

Escolha células próximas ao centro do hidrogel, dentro do campo de iluminação relativamente plano, que não sejam nem muito brilhantes nem muito fracas e com uma relação FRET entre 00 e 1,0. Em seguida, selecione vários campos de visão para adquirir imagens para pelo menos 15 células transfectadas. Desligue a luz quando terminar para limitar a exposição.

Para configurar a taxa de captura para aquisição de imagens com lapso de tempo, insira a periodicidade das capturas. Use uma taxa rápida para a captura do sinal de linha de base, como a cada cinco segundos por campo de visão, e uma taxa mais lenta para a cinética de sinalização de longo prazo subsequente. Selecione Executar agora para iniciar a aquisição de imagens e capturar imagens por cinco minutos para estabelecer uma linha de base para a resposta da sonda no campo de exibição designado.

Após os cinco minutos de aquisição da imagem, pipetar o agonista ou antagonista desejado, misturar por pipetagem e continuar a imagem. Depois de realizar a calibração FRET de acordo com o protocolo de texto, no software do microscópio, selecione a seta no ícone da região de interesse de fundo e escolha Desenhar região de interesse de fundo elíptico. Desenhe e designe uma região de interesse, ou ROI, por campo de visão próximo às células para definir o nível de plano de fundo.

Certifique-se de que Manter atualização do deslocamento do plano de fundo esteja selecionado e, em seguida, ative a visualização da região de interesse do plano de fundo clicando no ícone Região de interesse do plano de fundo. Como alternativa, escolha o ícone da região de interesse e defina as propriedades da região de interesse como Usar como região de interesse em segundo plano e as Regiões de interesse são diferentes em cada ponto múltiplo. Usando o ícone de plano de fundo da região de interesse, selecione Subtrair plano de fundo usando a região de interesse.

Na janela pop-up, em Subtrair região de interesse do plano de fundo, selecione Todas as imagens e, em Aplicar a, selecione Todos os quadros. Para cada campo de visão, para definir uma região de interesse ao redor da célula usando o canal de emissão do aceitador e uma máscara binária, use o menu Binário, Definir limite e selecione Aplicar ao quadro atual. Em seguida, ajuste o limite inferior para selecionar as células.

Em seguida, use a função Fechamento binário para preencher os buracos na máscara binária, se necessário. Em seguida, use o ícone Região de interesse para selecionar Copiar binário para região de interesse para salvar a máscara binária como regiões de interesse. Anexe as regiões de interesse para campos de visão subsequentes ao pool existente de regiões de interesse.

Exclua todas as regiões de interesse espúrias. Em seguida, clique com o botão direito do mouse nas Regiões de Interesse e verifique se suas propriedades são Usar como Região de Interesse Padrão e Regiões de Interesse são diferentes em cada Multiponto. A região celular de interesses pode ser desenhada à mão, mas deve-se tomar cuidado para remover valores espúrios.

O protocolo contém procedimentos para células que estão fora do campo de iluminação plano e para microscópios que não possuem campo plano. A centrifugação dos precursores de hidrogel antes da gelificação maximizou o número de células em um plano focal próximo à lamínula. Isso minimizou o ruído de fundo e aumentou o rendimento da imagem.

Neste experimento FRET, para o cálculo da emissão extinta, ou QE, razão FRET, apenas duas imagens foram necessárias para a sonda ICUE1 binária de cadeia única, incluindo QE igual a CFP CFP para excitação e emissão, e emissão aceptor igual a YFP YFP para excitação e emissão. Vários campos de visão foram selecionados nos quais várias células residiam dentro da área de iluminação homogênea, conforme mostrado aqui. As ROIs para correção de fundo dos sinais do canal e para análise de células foram designadas usando imagens de emissão de aceptor limiares desde o início dos experimentos.

Além disso, como mostrado aqui, foram selecionadas células que expressavam sonda suficiente. Foram calculadas as razões QE e FRET de emissão sensibilizada por pixel e a razão FRET média por célula. O inverso da razão de AE foi calculado e ambas as razões foram normalizadas.

Sob a estimulação da forscolina, as relações Fret baseadas em QE e SE detectam o aumento da atividade do AMP cíclico nos condrócitos. Tanto os géis fisicamente reticulados quanto quimicamente reticulados mostraram um aumento na razão QE FRET ao longo do tempo, indicando um aumento da resposta de sinalização de AMP cíclico à adição de forscolina. Este procedimento pode ser usado com outras técnicas de microscopia, como FRAP, flim fret e medição de traste e anisotropia, para responder a perguntas como, quais são as diferenças na permeabilidade e singularização celular entre diferentes tipos de microtecidos.

Como a reticulação é temperada perto do PDMS, é importante lembrar de projetar os moldes para os hidrogéis de fotoreticulação um pouco maiores em diâmetro do que os próprios hidrogéis.