Name: Um regime de fenotipagem de camundongos geneticamente modificados usados para estudar genes implicados nas doenças humanas do envelhecimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a realizar fenotipagem comportamental e celular em camundongos geneticamente modificados para estudar genes relacionados à doença de Parkinson. Este método avalia força muscular e atividade neurológica de forma acessível.

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Financiamento para esta investigação veio Fundação Médica Rosebay e Fundo de Investigação do Dean Yale Medical School (JH). Agradecemos ao Dr. Claire Koenig para obter ajuda com experimentos comportamentais. Genetically Engineered mouse linhas foram geradas pelo Ozgene (Perth, Austrália).

Ética declaração: Estudos envolvendo animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Yale. 1. Teste comportamental de camundongos geneticamente modificados Nota: Todos os ratinhos deve ser submetido ao mesmo regime de testes para limitar as diferenças de habituação ao manuseamento. Os ensaios devem ser realizados à mesma hora do dia de cada vez. <ol><li> Neonatal Hind Teste Limb Nota: O teste da pata traseira é realizado diariamente desde o dia pós-natal (P) 4 a P10 para avaliar a força muscular dos membros posteriores proximal, fraqueza e fadiga. <ol><li> ratinhos de transporte para a área de teste e deixa-se repousar durante 30 minutos antes do teste. </li><li> Prepare aparelho de teste por a limpeza de um tubo de 50 ml com 70% de etanol, empurrando dois (P4-P8) ou um (P9-P10) bolas de algodão para o fundo do TUbe e fixação na posição vertical. </li><li> Remova um filhote de cachorro da gaiola e registro do peso. Mantenha filhote na realização de bandeja na almofada de calor, sempre que não testar. </li><li> Suavemente suspender os membros posteriores do recém-nascido por cima da borda do tubo cónica, de tal modo que ele esteja voltado para baixo para as bolas de algodão. Contar o número de tentativas de puxar feitas e latência medida caia usando um cronômetro. </li><li> Repita mais uma vez, em seguida, rotular o filhote com marcador. Em seguida, identificar filhotes P6 pelo recorte dedo do pé. Esfregue suavemente filhotes com roupa de cama da gaiola antes de substituir. </li><li> Wipe tubo cónico com 70% de etanol. </li><li> Repita o teste na próxima filhote até que todo o lixo foi testado. </li><li> Dispor de bola de algodão e tubo cônico. Limpar todo o equipamento com etanol 70%. </li></ol></li><li> Teste Observação Weanling Nota: O teste de observação recém-desmamados é administrado diariamente a partir de P19 a P21 para marcar os níveis de movimento e atividade geral. <ol><li> camundongos de transporte para a área de teste de umND deixa-se repousar durante 30 minutos antes do teste. </li><li> Prepare caixa de teste de Plexiglas com uma grelha 6x6 de 2 polegada quadrada na base com a limpeza com etanol 70%. Defina-se equipamento de vídeo para o lado de tal modo que toda a caixa está no campo de visão. Mantenha a configurar e arredores o mesmo a cada dia para evitar a introdução de novidade. </li><li> Remova um recém-desmamados da gaiola e coloque em um copo da terra arrendada limpo. peso Record. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo filmando o cartão de identificação de teste, com o número de identificação do mouse, a idade ea data do teste. Transferir mouse de prender o copo até a praça central. Tempo de três minutos, a contagem do número de linhas atravessadas por ambas as patas dianteiras do rato durante o ensaio. </li><li> Retorno do mouse para uma gravação de vídeo gaiola e final limpo. </li><li> Limpar o aparelho de ensaio com 70% de etanol. </li><li> Repita até que todo o lixo é testado, em seguida, retornar todos os filhotes para a gaiola casa. </li><li> Limpar todo o equipamento de testes com etanol 70%. </li><li&gt; Usando os vídeos, quantificar o número de criação de eventos através da contagem após a observação visual, onde um rato fica com ambas as patas dianteiras claras de apoio e preparação de eventos, em que ambas as patas dianteiras estão envolvidos na limpeza. </li></ol></li><li> Arame Teste de força de preensão Nota: O teste de força de preensão é realizado em dias alternados entre P22 e P26, para avaliar a força neuromuscular. <ol><li> camundongos de transporte para a área de teste e deixe descansar na gaiola durante 30 min antes do teste. </li><li> Prepare aparelho pela limpeza de uma grade caixa e malha de Plexiglass com etanol 70%. Coloque envoltório de espuma na parte inferior da caixa e cobrir com papel. </li><li> camundongos separados em grupos de três, colocando em copos de exploração individual. </li><li> Coloque primeiro rato para o centro da malha de arame e lentamente inverter 10-20 cm acima da superfície macia na parte inferior da caixa de plexiglass. Medir a latência a cair utilizando um cronómetro. Encerrar o teste após 60 segundos se passaram se o rato não fazcair. </li><li> Retorno do mouse para o copo segurando, limpe malha com 70% de etanol e substituir o papel sobre o plástico bolha. Realizar o teste sobre as restantes dois ratinhos do grupo antes de voltar para o primeiro. Repetir até que cada ratinho foi testado um total de três vezes. </li><li> Retorne o grupo a uma gaiola limpa e continuar com os grupos restantes. Se houver menos de três ratos em qualquer grupo, verifique se a 5 min de intervalo de recuperação inter-julgamento é permitido. </li><li> Retornar todos os ratos para a gaiola, descarte de papel e equipamentos de teste limpo com etanol 70%. </li></ol></li></ol> 2. O exame da estrutura retiniana <ol><li> Anestesiar os animais em P30-35 por injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Avaliar profundidade da anestesia por beliscar a pata e prosseguir apenas na ausência de uma resposta, de acordo com as diretrizes IACUC. Perfundir com PFA a 4% / PBS 48. </li><li> Para remover os olhos, limpar a pele no Si incisãote com 70% de etanol, antes de cortar através da pele na base do crânio. Retire a pele para expor o crânio e limpo, com 70% de etanol. Usando instrumentos limpos, cuidadosamente cortadas através do crânio para alcançar as órbitas oculares e expor os olhos. Sever do nervo óptico, remova cuidadosamente o olho da tomada e enxaguar em PBS. </li><li> Fix olhos em PFA a 4% / PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Coloque os olhos em uma pequena placa de Petri contendo PBS. Fazer uma pequena incisão no centro da córnea usando remoção de tesouras de costura. Remover a córnea cortando a borda entre a córnea e esclera. Use fórceps para remover a íris. Finalmente, retire as camadas RPE, deixando intacta a retina e a lente no lugar. Nota: O 4% PFA / PBS fixação irá causar descolamento de EPR permitindo a EPR a ser facilmente descascada do lado de fora da retina. </li><li> Re-correcção em PFA a 4% / sacarose a 30% / PBS durante 15 min à temperatura ambiente antes de voltar a olho para uma placa de Petri contendo PBS. Retire o lens usando uma pinça, levando o corpo vítreo, juntamente com ele. </li><li> Cryoprotect em 30% sacarose durante a noite a 4 ° C. </li><li> olhos revestimento em composto Optimum Corte Temperatura (OCT) e transferir para um molde de incorporação contendo fresco outubro. Orientar o olho de tal forma que o plano sagital é paralelo com a face de corte, utilizando o menor número de movimentos possível e evitar a introdução de bolhas de ar. congelamento flash imergindo o molde num banho de gelo seco / etanol. blocos de armazenar a -80 ° C. </li><li> Usando um criostato, cortar 20 um secções sagitais e recolher em lâminas previamente limpas. </li><li> Seções mancha com hematoxilina e eosina de acordo com protocolos padrão 49. Imagem usando um microscópio de luz equipado para microscopia de campo claro. </li></ol> 3. histoquímico de coloração <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Eutanásia animais em P30-35 sobredosagem usando isoflurano (30% em propilenoglicol), através de inalação gota aberta. Avaliar a eutanásia pela cessaçãoda respiração, batimentos cardíacos e a falta de resposta a beliscar a pata. Confirmar a morte por deslocamento cervical e remoção de órgãos, em linha com as diretrizes IACUC. </li><li> Para remover o cérebro, limpar a pele no local da incisão com 70% de etanol, antes de cortar através da pele na base do crânio. Retire a pele para expor o crânio e limpo, com 70% de etanol. Usando instrumentos limpos, cuidadosamente cortadas através do crânio e remover para expor o cérebro. Retirar as membranas, e retire cuidadosamente o cérebro a partir da cavidade do crânio. Enxágüe em PBS. </li><li> Brasão do cérebro em outubro e transferir para um molde de incorporação contendo fresco outubro Orientar o cérebro de tal modo que o plano sagital é paralelo com a face de corte, utilizando o menor número de movimentos possível e evitar a introdução de bolhas de ar. congelamento flash imergindo o molde num banho de gelo seco / etanol e armazenar a -80 ° C. </li><li> Usando um criostato, corte 10 mm sagitais e recolher em lâminas previamente limpas. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH Diaforase Coloração <ol><li> Preparar tampão Tris 0,05 M, pH 7,6 por dissolução de 5,72 g de Tris-HCl e 1,66 g de base Tris em 1 litro de água desionizada. Armazenar a 4 ° C por até seis semanas. </li><li> Preparar a solução de NADH (NADH 2,25 mM em tampão Tris 0,05 M). Alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar uma solução de NBT (2,5 mM de nitro-azul de tetrazólio em tampão Tris 0,05 M). Armazenar a 4 ° C por até seis semanas em uma garrafa de vidro. </li><li> Combine volumes iguais de solução de NADH e solução de NBT para fazer solução de coloração e adicionar 1 ml a cada slide. Incubar a 37 ° C numa câmara de humidif içado, durante 30 min. </li><li> Solução de coloração Aspirar e lavar três vezes com dH2O </li><li> Lavar três vezes cada um em concentrações ascendentes e descendentes de acetona / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes em dH 2 O e montar secções com meio aquoso. Imagem usando um microscópio de luz equipado para f brilhantemicroscopia ield. coloração azul corresponde à actividade enzimática. </li></ol></li><li> Succinato desidrogenase histoquímico de coloração <ol><li> Prepare a 0,2 M de fosfato de sódio monobásico / dH 2 O e fosfato dibásico de sódio 0,2 M / dH 2 O. </li><li> Adicione tampão de fosfato 0,2 M, pH 7,6 através da combinação de 3 partes de fosfato monobásico de fosfato dibásico de sódio 20 partes. </li><li> Preparar a solução de coloração (succinato de sódio 0,1 M, 1,25 M de NBT em tampão fosfato 0,2 M) e adicionar 1 ml para cada lâmina. Incubar a 37 ° C numa câmara de humidif içado, durante 60 min. </li><li> Solução de coloração Aspirar e lavar três vezes em dH2O </li><li> Lavar três vezes cada um em concentrações ascendentes e descendentes de acetona / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes em dH 2 O e montar secções com meio aquoso. Imagem usando um microscópio de luz equipado para microscopia de campo claro. coloração azul corresponde a PTatividade zymatic. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

tratamentos robustos são necessários para limitar o impacto das condições debilitantes relacionadas com o envelhecimento humano, mas eles são ainda imperceptíveis para muitas condições. Para identificar potenciais alvos terapêuticos e desenvolver estratégias de intervenção, as causas e patologia das doenças associadas com o envelhecimento deve primeiro ser compreendido. Nem todos os camundongos geneticamente modificados imediatamente apresentam fenótipos claros que estão relacionados com a doença de interesse, mesmo que...

doenças associadas à idade estão se tornando cada vez mais prevalente na sociedade moderna. Como a ciência médica melhora e expectativa de vida aumenta, a população continua a idade e o peso dessas doenças cresce. Os tratamentos eficazes são necessárias para diminuir o impacto de condições debilitantes, mas permanecem ainda desconhecidos em muitos casos. Somente através da compreensão das causas e patologia das doenças associadas com o envelhecimento pode cientistas começar a identificar potenciais alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para a intervenção. condições relacionadas com a idade comuns incluem desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD) e degeneração macular relacionada com a idade (AMD). DP é o distúrbio de movimento mais comum causada por neurodegeneração em seres humanos. A maioria dos pacientes com DP apresentam sintomas como tremor de repouso, bradicinesia e rigidez depois de 50 anos de idade. O início precoce também foi observado em aproximadamente 10% dos casos. AMD é a principal causa de cegueira emos idosos, danificando progressivamente fotorreceptores e o epitélio pigmentar da retina (EPR) no olho. A visão central, mas é prejudicada a visão periférica é geralmente inalteradas. Existem duas formas de DMRI. Na forma &quot;seca&quot;, depósitos de proteínas extracelulares conhecidos como forma de drusas entre o EPR e a membrana de Bruch (BM), levando à atrofia geográfica e embaçamento da visão central. Os mais graves &quot;molhado&quot; forma de resultados de neovascularização coróide através BM nas camadas epiteliais pigmentares e fotorreceptoras e pode levar a hamorrhaging abaixo da retina que provoca danos permanentes ao tecido da retina. Genome wide associação estudos identificaram previamente loci que estão associados com o aumento da susceptibilidade a esta doença e identificou duas regiões de interesse: Factor H do complemento (CFH) no cromossoma 1 e a 10q26 local, onde a maculopatia susceptibilidade relacionada com a idade de 2 (ARMS2) e de alta temperatura fator exigência A1 (HtrA1) genes estão localizados 1-5 </sup&gt;. As combinações destes alelos aumentar a probabilidade de DMRI de uma forma dependente da dose e SNPs específicos pode ser preferencialmente associada com quer as formas húmida ou seca da AMD 3-6. CFH actua como um regulador negativo da via alternativa (AP) do sistema do complemento através da inibição da activação de C3. Um polimorfismo de um único nucleótido (SNP) tem sido associada a um risco aumentado de DMRI, fazendo com que a troca de tirosina 402 no exão 9 com histidina devido a uma substituição T para C 1. Em AMD acredita-se que o AP é desregulada por causa de uma perda de função do CFH mas se o SNP desempenha um papel causal está claro. Uma hipótese é que a histidina carregada positivamente é pensado para anular a capacidade de CFH para se ligar a proteínas que interagem com a proteína C-reactiva e sulfato de heparina 1,7. Estudos in vitro de CFH Y402H fornecer resultados contraditórios sobre diferenças funcionais entre as variantes, e em vivo o trabalho em &lt;em&gt; CFH - / - ratos que expressam humanizado CFH está em curso 8. ARMS2 está localizado a montante do HtrA1 no genoma de primata, embora o gene está ausente em ratinhos. HtrA1 é uma protease da serina, mas ARMS2 é mal caracterizado. O desequilíbrio de ligação entre os SNPs no locus AMD-associada tornou difícil determinar as contribuições para o risco de mutações individuais dos genes nesta região, mas trabalho recente sugeriu que é sobre-expressão de HtrA1 em vez de ARMS2 que conduz a neovascularização e depósitos de proteínas subretinal 9-11. No entanto, a grande proximidade dos genes em esse locus pode permitir interacções que não pode ser estudado utilizando transgenes inseridos aleatoriamente. Além da DMRI, a família de proteases de serina HtrA tem sido associada a muitas doenças humanas. Todas as proteínas HtrA contêm um domínio de serina-protease seguido por, pelo menos, um domínio C-terminal de ZDP. HtrA1, HtrA3 e HtrA4 compartilhar o grcomes homologia, que consiste de um domínio de péptido de sinal, ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina, um inibidor de protease de domínio Kazal, o domínio de protease de serina e um domínio PDZ. HtrA2 tem um terminal N diferente, constituída por uma sequência de localização mitocondrial, domínio transmembranar e domínio de ligação de inibidor de apoptose, seguido pelos domínios de protease e PDZ 12-16. HtrA1 dos mamíferos é regulado por remodelação induzida por substrato no local activo do seu domínio de protease 17-20, e HtrA2 pode também ser modulada pela interacção entre a protease de serina e domínios PDZ que suprime a actividade de protease 21. Curiosamente, o domínio PDZ não aparecer para conferir regulação semelhante ao HtrA3 16. As proteases HtrA também pode ser regulada por factores extrínsecos: foi demonstrado recentemente que existe uma interacção entre o regulador e HtrA1 protoporfirinas 22 e HtrA2 pode ser regulado pela fosforilação após a activação da MAP-cinase p38via de um modo dependente-PINK1 23. A supressão de membros individuais da família HtrA em ratinhos tem sido documentada, no entanto efeitos mecanísticos na maior parte não são claras, em parte devido à falta de fenótipos visíveis. HtrA1 desempenha uma função importante no controlo de qualidade de proteínas e a sua desregulação ou mutação tem sido associada a muitas doenças humanas diferentes, incluindo artrite, cancro e um aumento do risco da AMD 3,4,24-32. A perda da função HtrA2 em tecidos neurais tem sido associada com fenótipos PD em humanos e ratos, enquanto que a sua perda a partir de tecidos não neurais resultados em envelhecimento acelerado 33-37. Desregulação HtrA3 tem sido associada a doenças, incluindo a pré-eclampsia e de certos tipos de cancro 38,39. -Regulação de HtrA4 tem sido observado nas placentas de pacientes com pré-eclâmpsia, mas camundongos knockout não apresentam um fenótipo ostensiva 40,41. A falta de fenótipos observados em alguns ratinhos knockout tem sidopostulada como sendo um resultado de compensação entre o membro da família HtrA: pensa-se que ambos HtrA4 HtrA1 e interagir com a família de TGF-B de proteínas, que permite a compensação por HtrA1 mediante eliminação de HtrA4 41. Do mesmo modo, pensa-se que uma vez que HtrA1 HtrA3 e têm um elevado grau de homologia de domínios que possam ter funções complementares 42. No entanto, tem sido sugerido que as proteínas HtrA podem ter papéis parcialmente antagonistas, competindo para regular alvos comuns 43. Para investigar mais estes fatores de risco três linhas de rato knock-in humanizados foram gerados. Em CFH TM1 (CFH * 9) jhoh e CFH tm2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 do gene CFH é substituído por exon 9 do homólogo humano. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codifica a não-doença associada tirosina resíduo na posição 402, enquanto CFH tm2 (CFH * 9) jhoh carrega o Y402H, SNP associado ao risco. DentroARMS2 tm1jhoh a sequência ARMS2 humano foi alvejado a uma região a montante do HtrA1. Uma sequência de paragem flanqueado-loxP colocado a montante da sequência do gene, mas a jusante do promotor UbiC incluídos foi excisado por cruzamento de ratinhos OzCre, que expressam a recombinase Cre sob o controle do promotor Rosa26, como previamente descrito 34. Além desses knock-in linhas, foram gerados alelos knockout condicional para CFH e HtrA1 (CFH tm1jhoh e tm1jhoh HtrA1), bem como os outros membros conhecidos da família HtrA: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) e HtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). Os nocautes germinativas foram criados pelo cruzamento de ratos OzCre aos animais projetados para flanquear exons específicos com locais loxP, de tal forma que a exclusão provoca uma mudança de quadro e / ou deleção do domínio activo (CFH; exão 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exões 2-4, HtrA3; exão 3, HtrA4; exons 4-6) 34,41. Uma deleção neural de HtrA2, eliminados utilizando recombinase Cre sob o controle do promotor de nestina (HtrA2 Flox; Tg (Nes-CRE) 1Kln / J), também foi descrito 34. Apenas os ratos que faltam HtrA2, sistemicamente ou em tecidos neurais, exibido fenótipos claros, apresentando fenótipos parkinsonianos. Uma vez que alguns destes genes de interesse são postulou a ser localizada para a mitocôndria 11,44-47, e supressão de HtrA2 gerado fenótipos parkinsonianos, um regime de fenotipagem com foco mitocondrial e neurológico é descrito aqui e resultados representativos dos testes de interesse são fornecidos . A fim de examinar ratos geneticamente modificados produzidos para investigar humano, doença relacionada com a idade completa e sistematicamente a uma programação de fenotipagem inicial foi estabelecido, que consiste de uma série de testes relacionados com os dois principaisdoenças de interesse: AMD e Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>bolas de algodão</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tapete térmico</td><td>Sunbeam</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de retenção (bandeja de cubos de gelo)</td> <td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronômetro eletrônico</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de plexiglass</td><td>construída em oficina</td><td></td><td>de 12" por 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Camcorder</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Copos Transparentes</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 polegada malha de arame</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (online) / 554219 (na loja)</td><td>12" por 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Plástico bolha</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de amostra reta</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação de ponta fina</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído a 16%</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão fosfato solução salina pH 7,4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>lâminas superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de hematoxilina</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Solução de mancha de eosina Y</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida adenina dinucleotídeo, sal dissódico reduzido hidratado</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de azul de nitrotetrazólio</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio dibásico hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount meio de montagem aquoso</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripé de câmera de vídeo</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura Ótima de Corte (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Criostato Seccionamento&nbsp; Máquina</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Descontinuado, mas substituído por CM1950</td></tr></tbody></table>

um regime de fenotipagem de camundongos geneticamente modificados usados ​​para estudar genes implicados nas doenças humanas do envelhecimento

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

As doenças relacionadas à idade estão se tornando cada vez mais prevalentes e o fardo continua a crescer à medida que nossa população envelhece. Tratamentos eficazes são necessários para diminuir o impacto de condições debilitantes, mas permanecem indescritíveis em muitos casos. Somente entendendo as causas e a patologia das doenças associadas ao envelhecimento, os cientistas podem começar a identificar potenciais alvos terapêuticos e desenvolver estratégias de intervenção. As condições mais comuns relacionadas à idade são distúrbios neurodegenerativos, como doença de Parkinson e cegueira. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é a principal causa de cegueira em idosos. Estudos de associação genômica ampla identificaram anteriormente loci que estão associados ao aumento da suscetibilidade a esta doença e identificaram duas regiões de interesse: o fator H do complemento (CFH) e o locus 10q26, onde estão localizados os genes da suscetibilidade à maculopatia relacionada à idade 2 (ARMS2) e do fator de exigência de alta temperatura A1 (HtrA1). O CFH atua como um regulador negativo da via alternativa (PA) do sistema complemento, enquanto o HtrA1 é uma serina protease extracelular. O ARMS2 está localizado a montante de HtrA1 no genoma do primata, embora o gene esteja ausente em camundongos. Para estudar os efeitos desses genes, linhagens de camundongos knock-in humanizados de Cfh e ARMS2, nocautes de Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 e HtrA4, bem como uma deleção neural condicional de HtrA2 foram gerados. De todos os camundongos geneticamente modificados produzidos, apenas camundongos sem HtrA2, seja sistemicamente ou em tecidos neurais, exibiram fenótipos claros. Para examinar esses camundongos de forma completa e sistemática, foi estabelecido um cronograma inicial de fenotipagem, composto por uma série de testes relacionados a duas doenças principais de interesse: DMRI e Parkinson. Camundongos geneticamente modificados podem ser submetidos a experimentos apropriados para identificar fenótipos que podem estar relacionados às doenças associadas em humanos. Um regime de fenotipagem com foco mitocondrial é apresentado aqui juntamente com resultados representativos dos testes de interesse.

Esta seção descreve os exemplos de resultados obtidos usando estes métodos. No teste posterior de membros, o número de tentativas feitas puxar e a latência para cair são somados ao longo de dois testes consecutivos de cada dia. Este teste pode ser usado para comparar os grupos geneticamente diferentes para distinguir ratinhos com reduzida força neuromuscular HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) na Figura 1A -. B demonstrar qualquer alteração no n...

Uma abordagem de genética reversa para entender as famílias de genes associadas a doenças humanas é apresentada, usando camundongos como sistema modelo, e o cronograma de fenotipagem subsequente de camundongos é descrito. Como os camundongos defeituosos em um gene de interesse, HtrA2, manifestaram sintomas parkinsonianos, o regime de fenotipagem é focado na identificação de defeitos neurológicos.

Um regime de fenotipagem de camundongos geneticamente modificados usados ​​para estudar genes implicados nas doenças humanas do envelhecimento

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

O objetivo geral deste protocolo de testes é estabelecer uma série de testes simples que possam ser usados como um pipeline inicial de fenotipagem para orientar investigações detalhadas subsequentes sobre fenótipos comportamentais e a estrutura e função dos tecidos. Se os fenótipos comportamentais e celulares de doenças humanas são recapitulados no modelo murino. A principal vantagem desta técnica é que os testes podem ser realizados em laboratórios sem experiência prévia em tais experimentos, sem investimento significativo, e ainda assim orientar estudos mais detalhados.Realize o Teste de Membros Posteriores diariamente do quarto ao décimo dia pós-natal para avaliar a força, fraqueza e fadiga dos músculos proximais dos membros posteriores. Para iniciar, permita que os camundongos se aclimatizem à área de teste por 30 minutos. Enquanto isso, prepare um novo tubo cônico de 500 mililitros lavando-o com etanol 70% e, em seguida, empurrando uma ou duas bolas de algodão para o fundo do tubo.Fixe este tubo em posição vertical para o teste. Quando não estiverem sendo testados, mantenha os filhotes com a mãe para conservar sua temperatura. Após a aclimatação de meia hora, retire um filhote da gaiola e registre seu peso.Em seguida, suspenda suavemente o neonato pelas patas traseiras sobre a borda do tubo, de modo que o filhote fique voltado para o algodão. Conte então o número de tentativas de puxar realizadas pelo filhote e meça sua latência para cair. Após esperar 30 segundos, repita o teste.Após o segundo teste, identifique o filhote com uma caneta marcadora. Em seguida, esfregue suavemente o filhote com a cama do viveiro e devolva-o à mãe. Como filhotes mais velhos de P8 não podem ser marcados, identifique-os por meio de corte nas patas.Antes de passar para o próximo filhote, limpe o tubo de ensaio com etanol a 70%. Realize o Teste de Observação de Filhotes diariamente de P19 a P21 para avaliar o movimento e os níveis gerais de atividade. Comece deixando os camundongos se aclimatarem à área de teste por 30 minutos.Enquanto os filhotes se aclimatam, prepare a arena. Marque uma caixa de teste de plexiglás com uma grade de seis por seis quadrados de dois polegadas de lado. Antes de usar a caixa, limpe-a com etanol 70%.Em seguida, posicione uma câmera de vídeo de modo que uma visão lateral de toda a caixa preencha o campo de visão. Padronize a aparência do ambiente para evitar a introdução de novidades. Antes do teste, transfira o animal desmamado para um copo de contenção limpo e registre seu peso.Em seguida, inicie a gravação em vídeo. Primeiro, filme um cartão de identificação de teste com o número de identificação do camundongo, sua idade e a data atual. Depois, transfira o camundongo do copo de contenção para o quadrado central.Por três minutos, conte o número de linhas cruzadas por ambas as patas dianteiras. Após três minutos, devolva o camundongo a uma gaiola limpa e encerre a gravação em vídeo. Entre cada teste, limpe a caixa com etanol 70%.A partir dos vídeos, conte os eventos de empinamento, que ocorrem quando um camundongo se levanta com as duas patas dianteiras afastadas do apoio. Também conte os eventos de alisamento, que acontecem quando ambas as patas dianteiras estão envolvidas na limpeza. Realize o Teste de Força de Preensão em dias alternados entre P22 e P26 para avaliar a força neuromuscular.Como de costume, permita que os camundongos tenham 30 minutos para se adaptar à área de teste. O equipamento de teste é uma caixa de plexiglass com uma grade de malha. Limpe ambos com etanol 70%.Em seguida, forre a base da caixa com uma camada de plástico bolha para amortecimento e cubra o plástico bolha com papel para absorver excreções. Prossiga separando os camundongos de teste e colocando-os em copos individuais. Agora, posicione o primeiro camundongo no centro da malha de arame e inverta lentamente a malha a 10 a 20 centímetros acima da superfície macia da caixa.Meça a latência para a queda ou encerre o teste após 60 segundos, caso o camundongo não caia. Em seguida, retorne o primeiro camundongo ao copo de contenção. Entre os testes, limpe a malha com etanol a 70% e substitua o papel sobre a espuma de polietileno.Em seguida, realize o teste nos outros dois camundongos do grupo. Após cada camundongo ser testado uma vez, repita o processo mais duas vezes, totalizando três ensaios por camundongo. Se houver menos de três camundongos em um grupo, certifique-se de que haja um tempo de recuperação entre os ensaios de pelo menos cinco minutos.Para uma coloração de Diáforase de NADH, combine volumes iguais de solução de NADH recém-preparada e solução de NBT recém-preparada. Em seguida, adicione um mililitro da solução de coloração a cada lâmina e incube as lâminas em câmara umidificada a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para uma coloração de Succinato Desidrogenase, prepare uma solução contendo succinato de sódio 0,1 molar, NBT 1,25 molar e tampão fosfato 0,2 molar.Em seguida, adicione um mililitro a cada lâmina. Coloque as lâminas em uma câmara umidificada e incube-as a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação com qualquer corante, aspire a solução de coloração e lave as lâminas três vezes com água destilada.Em seguida, lave as lâminas em uma série de banhos de acetona com concentrações crescentes e decrescentes. Para cada concentração de acetona, realize três lavagens, sendo duas minutos por lavagem. Por fim, enxágue as lâminas três vezes em água destilada.Em seguida, monte as lâminas com um meio aquoso. Camundongos sem expressão de HTRA2 foram examinados utilizando a bateria descrita de testes e comparados com controles provenientes da mesma ninhada. Nenhuma alteração no número de puxões ou na latência para cair foi observada entre P4 e P6. Entre P7 e P10, observou-se uma redução na força neuromuscular.No teste de atividade, observou-se atividade reduzida em camundongos com deleção de HTRA2. Camundongos com deleção de HTRA2 também apresentaram redução na força no teste de preensão em malha de arame. A coloração com hematoxilina e eosina mostra que os camundongos com deleção de HTRA2 não apresentaram alterações aparentes na estrutura retiniana em comparação com os controles no dia P35.Por fim, foi utilizada a coloração histoquímica para atividade do complexo da cadeia de transporte de elétrons a fim de identificar alterações nas funções das enzimas respiratórias. Houve redução na coloração nos camundongos com deleção do HTRA2 em comparação aos controles. Isso foi observado no cerebelo e no estriado, mas não na córtex.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a atividade e a força neuromuscular de camundongos geneticamente modificados, bem como de como combinar esses estudos com eixos celulares. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Um regime de fenotipagem de camundongos geneticamente modificados usados ​​para estudar genes implicados nas doenças humanas do envelhecimento

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