Um regime de fenotipagem de camundongos geneticamente modificados usados para estudar genes implicados nas doenças humanas do envelhecimento
14 de julho de 2016
Uma abordagem de genética reversa para entender as famílias de genes associadas a doenças humanas é apresentada, usando camundongos como sistema modelo, e o cronograma de fenotipagem subsequente de camundongos é descrito. Como os camundongos defeituosos em um gene de interesse, HtrA2, manifestaram sintomas parkinsonianos, o regime de fenotipagem é focado na identificação de defeitos neurológicos.
O objetivo geral deste regime de teste é estabelecer uma série de testes simples que podem ser usados como um pipeline inicial de fenotipagem para direcionar investigações detalhadas subsequentes sobre fenótipos comportamentais e a estrutura e função dos tecidos. Se os fenótipos comportamentais e celulares das doenças humanas são recapitulados no modelo de camundongo. A principal vantagem dessa técnica é que os testes podem ser realizados em laboratórios sem experiência prévia em tais experimentos sem investimento significativo, mas ainda assim com estudos detalhados adicionais.
Realize o Teste do Membro Posterior diariamente do quarto ao 10º dia pós-natal para avaliar a força, fraqueza e fadiga muscular proximal dos membros posteriores. Para começar, deixe os ratos se aclimatarem à área de teste por 30 minutos. Enquanto isso, prepare um novo tubo cônico de 500 mililitros lavando-o com etanol a 70% e, em seguida, empurrando uma ou duas bolas de algodão no fundo do tubo.
Prenda este tubo na posição vertical para o teste. Quando não estiver sendo testado, mantenha os filhotes com a barragem para manter sua temperatura. Após a aclimatação de meia hora, remova um filhote da gaiola e registre seu peso.
Em seguida, suspenda suavemente o recém-nascido pelos membros posteriores sobre a borda do tubo, de modo que o filhote fique de frente para o algodão. Em seguida, conte o número de tentativas de pull feitas pelo filhote e meça sua latência para cair. Depois de esperar 30 segundos, repita o teste.
Após o segundo teste, rotule o filhote com um marcador. Em seguida, esfregue o filhote suavemente com a roupa de cama da gaiola doméstica e devolva-o à barragem. Como os filhotes P8 mais velhos não podem ser marcados, identifique-os com um corte no dedo do pé.
Antes de prosseguir para o próximo filhote, limpe o tubo de ensaio com etanol 70%. Administre o Teste de Observação do Desmame diariamente de P19 a P21 para pontuar os níveis de movimento e atividade geral. Comece deixando os ratos se aclimatarem à área de teste por 30 minutos.
Enquanto os filhotes se aclimatam, prepare a arena. Marque uma caixa de teste de plexiglass com uma grade de seis por seis quadrados de duas polegadas. Antes de usar a caixa, limpe-a com etanol 70%.
Em seguida, posicione uma câmera de vídeo de forma que uma vista lateral de toda a caixa preencha o campo de visão. Padronize a aparência do ambiente para evitar a introdução de novidades. Antes do teste, transfira o desmame para um copo de retenção limpo e registre seu peso.
Então começou a gravação de vídeo. Primeiro, filme um cartão de identificação de teste com o número de identificação do mouse, sua idade e a data atual. Em seguida, transfira o mouse do copo de retenção para o quadrado central.
Por três minutos, conte o número de linhas cruzadas por ambas as patas dianteiras. Após três minutos, retorne o mouse a uma gaiola limpa e encerre a gravação do vídeo. Entre cada teste, limpe a caixa com etanol 70%.
A partir dos vídeos, conte os eventos de criação, que é quando um rato fica com as duas patas dianteiras livres de apoio. Conte também os eventos de higiene, que ocorrem quando ambas as patas dianteiras estão envolvidas na limpeza. Realize o Teste de Força de Preensão em dias alternados entre P22 e P26 para avaliar a força neuromuscular.
Como de costume, dê aos ratos 30 minutos para se adaptarem à área de teste. O aparelho de teste é uma caixa de plexiglass com uma grade de malha. Limpe ambos com 70% de etanol.
Em seguida, forre o fundo da caixa com uma camada de plástico bolha para preenchimento e cubra o plástico bolha com papel para absorver as excreções. Prossiga para separar os mouses de teste e carregue-os em copos individuais. Agora, coloque o primeiro mouse no centro da tela de arame e inverta lentamente a malha para 10 a 20 centímetros acima da superfície macia da caixa.
Meça a latência para cair ou termine o teste após 60 segundos, se o mouse não cair. Em seguida, retorne o primeiro mouse para o copo de retenção. Entre os testes, limpe a malha com etanol 70% e recoloque o papel sobre o plástico bolha.
Em seguida, realize o teste nos outros dois camundongos do grupo. Depois que cada mouse for testado uma vez, repita o processo mais duas vezes para três tentativas por mouse. Se houver menos de três camundongos em um grupo, certifique-se de que haja um tempo de recuperação entre tentativas de pelo menos cinco minutos.
Para uma coloração NADH Diaphorase, combine volumes iguais de solução NADH recém-feita e solução NBT recém-feita. Em seguida, adicione um mililitro de solução de coloração a cada lâmina e incube as lâminas em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para uma coloração de succinato hidrogenase, prepare uma solução de succinato de sódio 0,1 molar, NBT 1,25 molar e tampão fosfato 0,2 molar.
Em seguida, adicione um mililitro a cada lâmina. Embale as lâminas em uma câmara umidificada e incube as lâminas a 37 graus Celsius por uma hora. Depois de incubar com qualquer um dos corantes, aspire a solução de coloração e lave as lâminas três vezes com água destilada.
Em seguida, lave as lâminas através de uma série de banhos de acetona que aumentam e diminuem a concentração. Com cada concentração de acetona, execute três lavagens por dois minutos por lavagem. Por fim, enxágue as lâminas três vezes em água destilada.
Em seguida, monte as lâminas com um meio aquoso. Camundongos sem expressão de HTRA2 foram examinados usando a bateria de testes descrita e comparados com controles de companheiros de ninhada. Não houve alteração no número de puxões ou na latência para queda entre P4 e P6. Entre P7 e P10, observou-se redução da força neuromuscular.
No teste de atividade, houve redução da atividade dos camundongos knockout para HTRA2. Os camundongos knockout para HTRA2 também mostraram uma redução na força no teste de preensão da tela de arame. As colorações H e E mostram que os camundongos knockout para HTRA2 não tiveram alterações aparentes na estrutura da retina em comparação com os controles em P35.
Finalmente, a coloração histoquímica para a atividade do complexo da cadeia de transporte de elétrons foi usada para identificar alterações nas funções das enzimas respiratórias. Houve diminuição da coloração nos camundongos knockout para HTRA2 em comparação com os controles. Isso foi observado no cerebelo e no estriado, mas não no córtex.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a atividade e a força neuromuscular de camundongos geneticamente modificados, bem como combinar esses estudos com eixos celulares. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem de genética reversa para investigar famílias de genes associadas a doenças humanas utilizando um modelo murino. O foco está no gene HtrA2, que está associado a sintomas parkinsonianos, e é descrito um protocolo de fenotipagem para identificar defeitos neurológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Genética
- Modelos de Camundongo
Antecedentes
- Compreender as funções gênicas é essencial para associá-las a doenças humanas.
- Modelos de camundongo são frequentemente utilizados para estudar distúrbios genéticos.
- O HtrA2 está implicado na doença de Parkinson.
- A fenotipagem auxilia na identificação de defeitos neurológicos específicos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um pipeline de fenotipagem para avaliações iniciais de fenótipos comportamentais e celulares.
- Determinar se modelos de camundongos refletem com precisão os fenótipos da doença humana.
- Facilitar investigações mais detalhadas sobre os efeitos de mutações genéticas.
Métodos Utilizados
- Realizar o Teste de Membros Posteriores para avaliar a força muscular e a fadiga.
- Teste diário do quarto ao décimo dia pós-natal.
- Adaptar os camundongos à área de teste antes das avaliações.
- Preparar o equipamento de teste em condições estéreis.
Resultados Principais
- Estabelecimento de um regime simples de testes para fenotipagem.
- Identificação de defeitos comportamentais e neurológicos em camundongos deficientes em HtrA2.
- Demonstração da viabilidade dos testes em laboratórios iniciantes.
- Compreensão da relação entre mutações genéticas e sintomas da doença.
Conclusões
- O pipeline de fenotipagem é eficaz para avaliações iniciais.
- Modelos de camundongos podem recapitular aspectos de doenças humanas.
- Essa abordagem pode orientar pesquisas futuras sobre distúrbios genéticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de um protocolo padronizado de fenotipagem permite a detecção precoce de fenótipos comportamentais e celulares em modelos de camundongos geneticamente modificados, apoiando a validação de alvos para doenças relacionadas à idade, como a DMAE e o Parkinson. Essa abordagem reduz a ambiguidade mecanicista ao associar modificações genéticas a resultados funcionais observáveis, orientando decisões de avanço ou interrupção em programas pré-clínicos. A simplicidade do regime permite sua ampla adoção entre equipes de descoberta, aumentando a reprodutibilidade e o alinhamento multifuncional nos esforços de desvio de risco de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a análise da força neuromuscular e dos níveis de atividade em camundongos deficientes em HtrA2.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de triagem comportamental sistemática, sem necessidade de expertise especializada.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar fenótipos que podem refletir mecanismos de doenças humanas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensaios subsequentes ao estabelecer métricas de referência de comportamento e função tecidual.
- Valor Operacional: Promove a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de protocolos definidos de aclimatação, testagem e sanitização.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma entre laboratórios devido aos requisitos mínimos de equipamentos e execução simples.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Relaciona modificações genéticas a fenótipos relevantes para doenças nos sistemas neural e muscular, apoiando o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Valor Operacional: Garante a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, fornecendo leituras quantificáveis e repetíveis.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao destacar déficits na função motora e na atividade mitocondrial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O regime de fenotipagem integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, permitindo a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição da força das patas traseiras, latência para queda e comportamentos de empinamento/limpeza como indicadores da função neurológica.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de saídas padronizadas e quantitativas, como contagem de trações, medidas de latência e pontuação de atividade.
- Análises: Gera conjuntos de dados comparáveis entre genótipos e pontos temporais, permitindo a avaliação estatística de déficits neuromusculares e comportamentais.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica ao identificar disfunção mitocondrial em regiões cerebrais relevantes para a patologia de Parkinson.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável para avaliar múltiplos modelos geneticamente modificados em diversas áreas de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na associação entre gene e fenótipo.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre diferentes locais e equipes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção, a eficiência do capital e reduz os riscos biológicos em estágios avançados nos programas de alvo.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e as decisões de avanço ajustadas ao risco com base em triagens fenotípicas precoces.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação de camundongos, testes neonatais e técnicas básicas de coloração histológica.
- Depende de equipamentos laboratoriais padrão, incluindo tubos cônicos, arenas de plexiglass, sistemas de gravação de vídeo e incubadoras para coloração histoquímica.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos períodos de aclimatação, cronometragem dos testes e protocolos de sanitização para garantir a comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o regime a diferentes sistemas modelo, idades ou origens genéticas.
- Limita-se a fenótipos comportamentais e celulares observáveis; pode não captar processos cognitivos complexos ou degenerativos de início tardio sem ensaios complementares.
