A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide
23 de junho de 2016
Apresentamos uma abordagem para visualizar grandes moléculas de DNA coradas com peptídeo de ligação ao DNA de proteína fluorescente (FP-DBP) amarradas na superfície de polietilenoglicol (PEG) e vidro revestido de avidina e esticadas com fluxos de cisalhamento microfluídicos.
O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de análise de DNA conveniente para um microscópio epifluorescente, para manipular DNA de molécula única em superfícies de vidro modificadas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de visualização do DNA. Ao examinar o DNA próprio, bem como proteínas de ligação ao DNA e outras pequenas moléculas.
A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de observar e analisar o DNA em movimento com facilidade. Para começar, coloque as lamínulas de vidro em um rack de PTFE e prenda-as no lugar, usando um pedaço de fita de vedação de rosca de PTFE. Depois de enrolar as lamínulas, deixe um pedaço de fita de cinco centímetros de comprimento para ser usado para manusear o rack durante o procedimento de limpeza.
Em uma capela de exaustão, combine 350 mililitros de ácido sulfúrico e 150 mililitros de peróxido de hidrogênio em um copo de vidro de um litro para fazer uma solução de gravação de piranha. Em seguida, coloque a prateleira de lamínulas na solução. Após duas horas, esvaziar o copo e lavar bem as lamínulas com água desionizada.
Continue enxaguando as lamínulas até que o PH da água no béquer atinja um PH neutro. Em seguida, sonicar as prateleiras de lamínulas num copo contendo água durante 30 minutos, para limpar e derivar os substratos de vidro. Esvazie a água do béquer, pouco antes da aminossilanização. Para começar, prepare a solução de aminossilanização, adicionando dois mililitros de alcoxissilano e 10 mililitros de ácido acético glacial a 200 mililitros de álcool metílico em um recipiente limpo de polipropileno.
Em seguida, coloque as lamínulas limpas na solução. Em seguida, coloque as lamínulas limpas na solução preparada e agite-as em temperatura ambiente e 100 rpm por 30 minutos. Em seguida, sonicar o recipiente com as lamínulas derivatizadas durante 15 minutos a 75 watts.
Em seguida, agite-os novamente em temperatura ambiente e 100 rpm por pelo menos 30 minutos. Uma vez terminado, esvaziar a solução do copo e lavar cuidadosamente as lamínulas. Uma vez com álcool metílico e duas vezes com álcool etílico.
Após o enxágue final, armazene as lamínulas em álcool etílico e use-as dentro de duas semanas. Primeiro, faça 10 mililitros de uma solução de bicarbonato de sódio de 0,1 molares e filtre-a através de um filtro de seringa de 0,22 mícron. Em seguida, dissolva dois miligramas de biotina PEG succinimidil carbonato e 80 miligramas de PEG succinimidil valerato em 350 micro litros da solução filtrada de bicarbonato de sódio.
Proteja a solução da luz usando um tubo de proteção contra luz. Vortex o tubo vigorosamente, por 10 segundos e, em seguida, centrifugue-o a 10.000 x g por um minuto para remover quaisquer bolhas. Em seguida, lave uma lâmina de vidro com acetona seguida de álcool etílico.
Depois de enxaguado, deixe a lâmina secar completamente ao ar. Coloque uma gota de 50 microlitros da solução de PEG na lâmina de vidro limpa. Abaixe lentamente uma lamínula com amino silanizado na gota em um pequeno ângulo, para não gerar bolhas de ar sob a lamínula.
Em seguida, coloque as lâminas em uma câmara nivelada, escura e umidificada por pelo menos três horas a durante a noite, em temperatura ambiente. Quando terminar, sele a solução residual de PEG no tubo de proteção contra luz e mantenha-a a quatro graus Celsius. Após a incubação, enxágue bem as lamínulas PEGuladas com água deionizada e guarde-as em local escuro e seco até que sejam usadas.
Para criar a câmara de fluxo, coloque tiras de fita adesiva de dupla face em um suporte de acrílico, de modo que fique alinhado perpendicularmente aos orifícios de entrada e saída e não perturbe nenhum dos orifícios do canal. Em seguida, esfregue a fita, usando uma ponta de pipeta, para selar os canais. Em seguida, coloque uma lamínula PEGilatada, com o lado PEGulado voltado para baixo, na parte superior da fita para fazer câmaras de fluxo.
Para evitar que qualquer solução vaze, pressione a parte superior de uma lamínula sobre a área onde a fita dupla-face é colocada. Em seguida, adicione uma cola epóxi de secagem rápida nas bordas das câmaras, para prendê-la no lugar. Em seguida, conecte um pedaço de tubo de 2,5 centímetros de comprimento a uma seringa à prova de gás e sele a junta com cola epóxi.
Em seguida, conecte um tubo longo e flexível ao tubo que sai da seringa. E, novamente, sele a junta com cola epóxi. Encha o tubo que está ligado à seringa com água deionizada, certificando-se de que não haja bolhas de ar.
Em seguida, insira a tubulação no orifício da câmara de fluxo que é selada com cola epóxi. E coloque uma ponta de pipeta de 200 microlitros no outro orifício, para ser usada como reservatório. Defina a vazão de uma bomba de seringa para 50 microlitros por minuto.
Em seguida, coloque 20 microlitros de uma solução de proteína avidina na câmara e mantenha-a lá por 10 minutos. Em seguida, coloque 20 microlitros de oligonucleotídeos oligodesoxi biotinilados em uma seringa. Flua para a câmara e mantenha-o lá por 10 minutos.
Se uma transferase terminal for usada, pule o carregamento de oligonucleotídeos desoxi. Em seguida, coloque 20 microlitros de uma solução de DNA em uma seringa, flua-a para a câmara a uma taxa de 10 microlitros por minuto e mantenha-a lá por 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, lave a câmara de fluxo com 40 microlitros de tampão 1X TE a 50 microlitros por minuto.
Uma vez lavado, carregue a câmara com 40 microlitros do mesmo FP-DBP a uma concentração de 80 nano-molar, no 1X TE.To ver toda a faixa de estiramento das moléculas de DNA, aplique diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA usados. Observe o DNA sob uma lente objetiva de 60X, usando um microscópio fluorescente. Aqui está um vídeo de microscópio fluorescente mostrando moléculas de DNA lambda de bacteriófagos, amarradas à superfície, sendo esticadas pelo fluxo após a ligação com oligonucleotídeos complementares biotinilados.
Sob fluxo, as moléculas de DNA totalmente alongadas medem 16,5 mícrons de comprimento. Em contraste, as málculas de DNA T4 do bacteriófago, alongadas para um comprimento de 56,4 mícrons, sob fluxo. Esse alongamento é reversível e o DNA pode ser estendido e relaxado várias vezes.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o FP-DBP em análises de DNA maiores, bem como demonstrar o alongamento e o relaxamento do polímero de DNA.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para visualização de moléculas grandes de DNA marcadas com peptídeo de ligação ao DNA de proteína fluorescente (FP-DBP). A técnica envolve a fixação dessas moléculas em uma superfície de vidro revestida de polietileno glicol (PEG) e avidina e sua estiragem usando fluxos de cisalhamento microfluídicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Visualização de DNA
- Microscopia fluorescente
- Manipulação de molécula única
Contexto
- O estudo concentra-se na análise de DNA e proteínas de ligação ao DNA.
- Tem como objetivo melhorar a conveniência dos sistemas de análise de DNA.
- Este método permite a observação de DNA em movimento.
- É projetado para uso com microscópios epifluorescentes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema para manipulação de DNA de molécula única.
- Melhorar a visualização de DNA e proteínas associadas.
- Facilitar a análise da dinâmica do DNA.
Métodos Utilizados
- Preparação de lamínulas de vidro em um suporte de PTFE.
- Fixação das lamínulas com fita de vedação de rosca PTFE.
- Procedimento de limpeza para as superfícies de vidro modificadas.
- Utilização de fluxos de cisalhamento microfluídicos para estirar o DNA.
Principais Resultados
- Fixação bem-sucedida de moléculas grandes de DNA em superfícies modificadas.
- Visualização eficaz da dinâmica do DNA usando coloração FP-DBP.
- Capacidade aprimorada de analisar DNA em movimento em tempo real.
- Demonstração do potencial do método na pesquisa de DNA.
Conclusões
- A técnica oferece uma nova abordagem para a visualização de DNA.
- Proporciona insights sobre as interações do DNA com proteínas de ligação.
- Este método pode avançar a pesquisa no campo da biologia molecular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA-protein binding events for mechanistic clarification.
- Supports functional validation of DNA-binding targets in a controlled environment.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular interactions relevant to disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for preparing validated DNA substrates for high-content assays.
- Enables quantitative measurement of DNA stretching and relaxation under defined conditions.
- Supports standardization and scalability for compound screening targeting DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling DNA-protein dynamics at the single-molecule level.
- Offers continuity from discovery through preclinical validation for DNA-targeting modalities.
- Reduces biological ambiguity in early-stage risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing DNA-protein interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, surface-tethered DNA substrates with quantitative readouts.
- Analytics: Provides real-time measurement of DNA elongation and relaxation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when DNA-protein interactions are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse DNA-binding protein studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by clarifying early-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DNA-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, microfluidics, and fluorescence microscopy.
- Demands access to epifluorescent microscopes and microfluidic flow control systems.
- Necessitates cross-team standardization of surface preparation and DNA labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different DNA lengths or binding protein classes.
- Surface passivation and non-specific binding reduction are critical for reliable outputs.
