A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema conveniente de análise de DNA para um microscópio epifluorescente, capaz de manipular moléculas individuais de DNA em superfícies de vidro modificadas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da visualização de DNA, ao examinar o próprio DNA, bem como proteínas que se ligam ao DNA e outras moléculas pequenas.

A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de observar e analisar o DNA em movimento com facilidade. Para começar, coloque lamínulas de vidro em uma grade de PTFE e fixe-as no lugar, usando um pedaço de fita veda-rosca de PTFE. Após envolver as lamínulas, deixe um pedaço de fita com cinco centímetros de comprimento para ser usado no manuseio da grade durante o procedimento de limpeza.

Em uma capela de exaustão, combine 350 mililitros de ácido sulfúrico e 150 mililitros de peróxido de hidrogênio em um béquer de vidro de um litro para preparar uma solução de ataque piranha. Em seguida, coloque a grade de lamínulas na solução. Após duas horas, esvazie o béquer e enxágue bem as lamínulas com água desionizada.

Continue enxaguando as lamínulas até que o pH da água no béquer atinja um pH neutro. Em seguida, sonique as grades de lamínulas em um béquer contendo água durante 30 minutos, para limpar e derivatizar os substratos de vidro. Esvazie a água do béquer imediatamente antes da aminossilanização. Para começar, prepare a solução de aminossilanização adicionando dois mililitros de alcoxisilano e 10 mililitros de ácido acético glacial a 200 mililitros de álcool metílico em um recipiente limpo de polipropileno.

Em seguida, coloque as lamínulas limpas na solução. Depois, coloque as lamínulas limpas na solução preparada e agite-as à temperatura ambiente e 100 rpm por 30 minutos. A seguir, sonique o recipiente com as lamínulas derivatizadas por 15 minutos a 75 watts.

Em seguida, agite novamente em temperatura ambiente e 100 rpm por pelo menos 30 minutos. Após a conclusão, descarte a solução do béquer e lave as lamínulas três vezes, cuidadosamente: uma vez com álcool metílico e duas vezes com álcool etílico.

Após a lavagem final, armazene as lamínulas em álcool etílico e utilize-as dentro de duas semanas. Primeiro, prepare 10 mililitros de uma solução de bicarbonato de sódio 0,1 molares e filtre-a através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons. Em seguida, dissolva dois miligramas de carbonato de succinimidila de biotina PEG e 80 miligramas de valerato de succinimidila de PEG em 350 micro litros da solução filtrada de bicarbonato de sódio.

Proteja a solução da luz utilizando um tubo de proteção contra a luz. Agite o tubo vigorosamente por 10 segundos e, em seguida, centrifugue a 10.000 x g durante um minuto para remover quaisquer bolhas. Em seguida, enxágue uma lâmina de vidro com acetona, seguido de álcool etílico.

Após a lavagem, deixe a lâmina secar completamente ao ar. Coloque uma gota de 50 microlitros da solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Abaixe lentamente uma lamínula amino silanizada sobre a gota em um ângulo ligeiro, de modo a não gerar bolhas de ar sob a lamínula.

Em seguida, coloque as lâminas em uma câmara nivelada, escura e umidificada por pelo menos três horas até a noite seguinte, à temperatura ambiente. Quando terminado, feche o tubo de proteção contra a luz com a solução de PEG residual e mantenha-o a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as lamínulas PEGiladas abundantemente com água desionizada e, em seguida, armazene-as em local escuro e seco até o momento do uso.

Para criar a câmara de fluxo, coloque tiras de fita adesiva dupla face em um suporte de acrílico, alinhando-as perpendicularmente aos orifícios de entrada e saída, de modo que não perturbem nenhum dos orifícios do canal. Em seguida, pressione a fita com a ponta de uma pipeta para selar os canais. Depois, coloque um lamínula PEGilado, com o lado PEGilado voltado para baixo, sobre a fita para formar as câmaras de fluxo.

Para evitar vazamentos de solução, pressione a parte superior de um lamínula sobre a área onde a fita adesiva dupla face está colocada. Em seguida, adicione uma cola epóxi de secagem rápida às bordas das câmaras para fixá-las no lugar. Depois, conecte um pedaço de tubo com 2,5 centímetros de comprimento a uma seringa hermética e selo a junção com cola epóxi.

Em seguida, conecte um tubo longo e flexível ao tubo proveniente da seringa. E novamente, vedar a junção com cola epóxi. Encha o tubo ligado à seringa com água desionizada, certificando-se de que não haja bolhas de ar.

Em seguida, insira o tubo no orifício da câmara de fluxo que está selado com cola epóxi. E coloque uma ponteira de pipeta de 200 microlitros no outro orifício, para ser usada como reservatório. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para 50 microlitros por minuto.

Em seguida, introduza 20 microlitros de uma solução de proteína avidina na câmara e mantenha-a por 10 minutos. Depois, carregue 20 microlitros de oligodesoxinucleotídeos biotinilados em uma seringa. Introduza na câmara e mantenha por 10 minutos.

Se uma transferase terminal for usada, pule a adição de oligodesoxinucleotídeos. Em seguida, carregue 20 microlitros de uma solução de DNA em uma seringa, introduza-a na câmara de fluxo a uma taxa de 10 microlitros por minuto e mantenha-a por 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, lave a câmara de fluxo com 40 microlitros de tampão TE 1X a 50 microlitros por minuto.

Após a lavagem, carregue a câmara com 40 microlitros do mesmo FP-DBP numa concentração de 80 nano-molar, em 1X TE. Para observar a faixa completa de alongamento das moléculas de DNA, aplique diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA utilizados. Observe o DNA sob uma objetiva de 60X, utilizando um microscópio fluorescente. Abaixo há um vídeo de microscopia fluorescente mostrando moléculas de DNA de bacteriófago lambda, ligadas à superfície, sendo alongadas pelo fluxo após ligação com oligonucleotídeos complementares biotinilados.

Sob fluxo, as moléculas de DNA totalmente alongadas medem 16,5 mícrons de comprimento. Em contraste, as moléculas de DNA do bacteriófago T4 se alongam até um comprimento de 56,4 mícrons sob fluxo. Esse alongamento é reversível, e o DNA pode ser estendido e relaxado múltiplas vezes.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o FP-DBP em análises de DNA maiores, bem como demonstrar o alongamento e a relaxação do polímero de DNA.