Name: A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a visualizar moléculas grandes de DNA usando peptídeo de ligação a DNA com proteína fluorescente em superfícies de vidro modificadas com PEG e avidina. Este método permite estirar DNA com fluxos de cisalhamento microfluídicos.

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Este trabalho foi apoiado pela Bolsa de Pesquisa da Universidade Sogang de 201410036.

1. DNA Biotinilaï¿½o <ol><li> A biotinilação de DNA de extremos cerses usando transferase terminal (TdT) Nota: O uso de T4 DNA (166 kpb), que é um DNA de extremos cerses. <ol><li> Adicionar 5 uL de 2,5 mM de CoCl2, 5 ul de 10 × tampão de reacção, 0,5 ul de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 ul de transferase terminal (10 unidades) e 0,5 ul de ADN de T4 (0,5 ug / uL) à mistura de reacção. Adicione a um volume final de 50 ul pela adição de 38,5 ul de água. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 1 h. Nota: o tempo de reacção prolongado pode produzir ADN de dupla presa, ou seja, é possível que biotinas são marcados em ambas as extremidades. </li><li> Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, pH 8. </li><li> Manter o tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> A biotinilação de ADN ended pegajoso utilizando ADN ligase Nota: O uso λ ADN (48,5 kpb), que é um ADN pegajosa-fim. &lt;ol&gt; <li> Adicionar 1 ul de DNA-ligase de T4, 5 uL de tampão de ligação 10 ×, 1 ul de 25 ng / ul de ADN de fago λ, e adicionar 43 ul de água para fazer um volume final de 50 ul. </li><li> Manter o tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. funcionalizados A derivação de superfície Nota:. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN na superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1 Este processo de PEGilação é importante para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente o ruído aleatório criado por ligação de moléculas indesejáveis ​​sobre a superfície. <ol><li> Limpeza Piranha Nota: As soluções Piranha reagir violentamente com materiais orgânicos, pelo que deve ser manuseado com cuidado, seguindo as orientações de segurança adequadas. <ol><li> Lugar lamelas em um rack de politetrafluoretileno (PTFE), e mantê-los by PTFE veda-rosca longitudinalmente, metade na borda das superfícies e metade na prateleira. Após acondicionamento, deixar uma parte longa (~ 5 cm) de fita adesiva para lidar com a grade durante o procedimento de limpeza. </li><li> Encher um copo de vidro de 1 L com 350 ml de H 2 SO 4 e 150 ml de H 2 O 2 para fazer a solução piranha numa hotte. Coloque o rack em solução piranha, durante 2 horas. </li><li> solução vazia piranha da taça, e lamelas enxaguar abundantemente com água deionizada até que o pH da água no copo atinge neutro. Utilizar as tiras de papel de pH. </li><li> Sonicar os suportes de lamelas na água proveta contendo, durante 30 min. água vazia do copo imediatamente antes amino silanização. Use 75 W de potência sonicação de limpar e derivar os substratos de vidro. </li></ol></li><li> Aminosilanization na superfície de vidro <ol><li> Adicionar 2 ml de N - [3- (trimetoxissilil) propil] etilenodiamina e 10 ml de ácido acético glacial em 200 mlde álcool metílico em um recipiente de polipropileno limpo para preparar a solução aminosilanization. </li><li> Coloque lamelas limpas no recipiente de polipropileno. Agite-los a 100 rpm e a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Sonicar a proveta com lamelas derivatizadas durante 15 minutos a 75 W. agitá-los a 100 rpm e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min. </li><li> Esvaziar a solução a partir do recipiente, e enxaguar lamelas cuidadosamente, uma vez com álcool metílico, e duas vezes com álcool etílico. lamelas de loja em álcool etílico e usá-los dentro de duas semanas. </li></ol></li><li> PEGilação da lamela <ol><li> Adicione 10 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO3). Filtra-se a solução com um filtro de seringa de 0,22? M. </li><li> Dissolve-se 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidil (biotina-PEG-SC) e 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) em 350 ul de NaHCO3. Use um tubo de proteção contra a luz. </li><li> Vortex do tubo vigorosamente durante 10 segundo, e centrifuga-se que a 10.000 × g durante 1 min para remover bolhas. </li><li> Lavar uma lâmina de vidro com acetona, seguido por lavagem com álcool etílico. Permitir o slide secar ao ar completamente. </li><li> Colocar uma gota (50 uL) de solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Cubra a gota suavemente com um amino silanizada lamela, sem gerar bolhas. </li><li> Colocar as lâminas para 3 horas durante a noite em um escuro, bem nivelado câmara húmida à temperatura ambiente. Use um suporte de ponta de pipeta vazia como a câmara, com água na parte inferior. Selar solução de PEG residual no tubo e mantê-lo a 4 ° C. </li><li> Lavar as lamelas PEGylated cuidadosamente com água deionizada. Armazená-lo em um lugar escuro e seco até o uso. </li></ol></li></ol> 3. Montagem de uma câmara de fluxo <ol><li> Fabricar um suporte de acrílico perfurados, como na Figura 2. Assegure-se que o diâmetro do tubo de inserção é 0,762 milímetros, e designa um orifício de entrada é um e o outro éuma saída (Figura 2). </li><li> Coloque tiras adesivas de dupla face de fita (largura 5-6 mm) sobre um suporte acrílico (Figura 2), alinhando perpendicularmente a um orifício de entrada e de saída, não perturbando quaisquer furos de canal. Use estas tiras de fita como paredes multi-canal para fazer câmaras. Esfregue a fita usando uma ponta de pipeta. </li><li> Coloque uma lamela PEGylated na parte superior para fazer câmaras de fluxo, com o lado da PEGylated bruços. </li><li> Para evitar qualquer solução de vazamento, pressione o topo de uma lamela sobre a área onde fitas de dupla face são colocados. Adicionar cola epoxi de secagem rápida, para fechar as extremidades da câmara na parte superior e na parte inferior (cor amarela na Figura 2). </li><li> Conectar uma peça curta (2,5 cm) de tubo (diâmetro externo, OD, 0,042 &quot;) para uma seringa estanque de gás e vedar a junta com cola epóxi. </li><li> Conecte um longo tubo flexível (OD: 0,03 &quot;) para a tubulação ligada à seringa e selar a junção com cola epóxi. </li><li> Encha o tubing ligada à seringa com água DI. Certifique-se de que não há bolha de ar. </li><li> Insira a tubulação no orifício da câmara de fluxo selada com cola epóxi. </li><li> Coloque uma ponta amarela (200 ul ponta) do outro furo como um reservatório. </li></ol> 4. Amostra Carregando no fluxo Câmara Nota: neutravidina pode ser substituído por outras proteínas avidina, tais como estreptavidina. Todas as reacções podem ser realizadas à temperatura ambiente, a menos que seja mencionado. Tome solução da amostra em uma ponta amarela, e instalar a ponta com a solução para o buraco do suporte de acrílico (Figura 2b). <ol><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de seringa a 50 ul / min. Carga 20 ul de proteína de avidina (25 ug / ml em solução T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e mantê-lo durante 10 min. </li><li> Carga 20 l de oligodesoxinucleï¿½idos biotinilados (100 mm em 1 × TE), e mantê-lo por 10 min. Se transferase terminal é utilizado, pule o carregamentode oligodesoxinucleï¿½idos. </li><li> Carga de 20 uL de solução de ADN a partir do Passo 1 para a câmara de fluxo a uma taxa de fluxo de 10 uL / ​​min, e mantê-lo durante 30 min. </li><li> Lava-se a câmara de fluxo com 1 x TE, e carregar 40 ul de FP-DBP de 10 (~ 80 nM). </li><li> Observar ADN sob um microscópio de fluorescência com o fluxo contínuo de moléculas de coloração em 1 × TE numa lente objectiva 60X. Use 488 nm laser em estado sólido para excitação do FP (eGFP) -DBP. Para a completa extensão de moléculas de DNA, aplicar diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA usadas. Por exemplo, aplicam-se 50? L / min durante 48,5 kpb de ADN λ, e 100 ul / min durante 166 kpb de ADN de T4. <ol><li> Para reciclagem do titular do acrílico, mergulhe câmaras de fluxo montados em uma solução de detergente doméstico 12. Retirar fitas ou epóxi com uma lâmina de barbear e esfregar com as mãos para levá-los completamente desligado. Desobstruir furos com agulhas de seringa. Mantenha os titulares em água deionizada até à sua utilização. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui nós apresentamos uma plataforma para visualização de moléculas de DNA longos biotinilados para a ancoragem em superfícies. Nós relatamos uma abordagem para moléculas de DNA amarrados em uma superfície revestida de proteína avidina com albumina sérica bovina biotinilado. 6 Na abordagem anterior, verificou-se uma questão crucial de DNA photo-clivagem causada por corantes bis-intercalação que mancham moléculas de DNA amarrados na superfície. Como estes fluoróforos continuamente animado têm uma elevada proba...

Visualização de moléculas de DNA grandes amarrados em superfícies de vidro ou talão tem sido utilizado para investigar as interações DNA-proteína, dinâmica de proteínas em substrato de ADN, 1,2 e física de polímeros. 3,4 Uma plataforma de moléculas de DNA grandes single-tethered tem um pouco distinta vantagens em comparação com outros métodos de imobilização de DNA. 5 primeiro, uma grande molécula de ADN amarrado na superfície tem uma conformação em espiral aleatória natural sem um fluxo de cisalhamento, o que é criticamente importante para uma proteína de ligação de ADN de reconhecer o seu local de ligação. Em segundo lugar, é muito fácil de alterar o ambiente químico em torno de moléculas de DNA para uma série de reacções enzimáticas em uma câmara de fluxo. Em terceiro lugar, um fluxo de cisalhamento de microfluidos induz ADN molecular do alongamento até 100% do comprimento do contorno completo, o que é muito difícil de conseguir utilizando o alongamento do ADN as abordagens alternativas, tais como a superfície de imobilização 6 e confinamento nanochannel. 7 Um totalmente stretchemolécula de DNA d também fornece informação de posição que pode ser útil para monitorizar os movimentos enzimáticas no mapa genómico. No entanto, a abordagem DNA tethering tem uma lacuna crítica em que a tintura a intercalação, tal como YOYO-1 geralmente provoca moléculas de DNA amarrados para ser facilmente quebrado pela luz de excitação de fluorescência. De um modo geral, moléculas de DNA grandes têm de ser marcadas com um corante fluorescente para a visualização sob um microscópio fluorescente. Para este efeito, YOYO-1 ou outros corantes da série TOTO são usadas principalmente porque estes corantes fluoresce apenas quando intercalar de ADN de cadeia dupla. 8 No entanto, é bem conhecido que a bis-intercalantes corante faz com que o ADN induzida pela luz foto-clivagem porque da intercalação de fluoróforos. 9 Além disso, as moléculas de ADN fluorescentes coradas amarrados na superfície são mais frágeis uma vez que os fluxos de cisalhamento pode exercer forças de quebra no movendo-se livremente moléculas de ADN. Por isso, desenvolvemos FP-DBP como um romance Dcorante proteína NA-coloração para imagiologia de grandes moléculas de ADN na superfície amarrados. A vantagem da utilização de FP-PAD é que ela não provoca foto-clivagem das moléculas de ADN ao qual se liga. 10 Além disso, FP-PAD não aumenta o comprimento do contorno do DNA, enquanto que corantes bis-intercalantes aumentar o comprimento do contorno por cerca de 33%. Este método de vídeo introduz a abordagem experimental para prender moléculas de DNA grandes a uma superfície PEG-biotina. A Figura 1 ilustra as diferentes abordagens de amarrar DNA com extremidades sem corte e extremidades pegajosas. Assim, este método de coloração pode ser aplicado a qualquer tipo de molécula de ADN. A figura 2 mostra uma representação esquemática da montagem de câmara de fluxo que pode ser controlada por uma bomba de seringa para gerar fluxos de cisalhamento para esticar moléculas de ADN, bem como a carga química e enzima soluções. a Figura 3 demonstra micrografias das moléculas de ADN esticadas inteiramente amarrados no PEGylatsuperfície ed 11 e corados com FP-PAD.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Biotinilação de DNA</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Biotinilação de DNA de extremidade romba usando Terminal Transferase (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Fornecido com tampão de reação 10x, cloreto de cobalto 2.5 mM</td></tr><tr><td>Biotina-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotina-ddNTP também está disponível</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) Biotinilação de DNA de extremidade pegajosa Usando DNA Ligase</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Fornecido com tampão de reação 10x</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Também disponível em New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>2. Derivatização de superfície funcionalizada</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Limpeza de piranha</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm,</td></tr><tr>rack <td></td><td></td> de<td>teflon</td> de espessura nº 1 <td>Fabricação personalizada</td></tr><tr><td>Fita de vedação de rosca PTFE</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&trade; fita</td></tr><tr><td>de ácido sulfúrico</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4,</td></tr><tr><td>peróxido de hidrogênio</td> de 95% de pureza <td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35% na água</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Limpador ultrassônico de mesa</td></tr><td colspan="4">2.2) Aminosilanização na superfície do vidroN-[3-(Trimetoxissilil)propil] etilenodiamina Sigma-Aldrich 104884 Ácido acético glacial Duksan Chemicals 414 99% de pureza do álcool metílico Jin Chemical Co., Ltd.<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>M300318</td> Recipiente de polipropileno de <td>99,9%</td></tr> pureza <tr><td></td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300202</td><td>99,9% de pureza</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) PEGilação da lamínula</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td> Filtro de seringa <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotina-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td> lâminas de microscópio de <td>pureza de 99%</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&nbsp; mm</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>3. Montagem de uma Câmara de Fluxo</forte></td></tr><tr><td>Suporte Acrílico</td><td></td><td></td><td>Fabricação</td></tr><tr><td>Personalizada Fita Dupla Face</td><td>3M</td><td></td><td>Tipo transparente</td></tr><tr><td>Epoxy de secagem rápida Tubulação</td> de polietileno <td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>À prova de gás 250 &micro; l Seringa</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Seringa</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>4. Carregamento de Amostras na Câmara de Fluxo</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris Microscópio</td> Base <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Base Trizma</td></tr><tr><td></td><td>Câmera Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Q Imaging</td><td>Laser de estado sólido Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>(488&nbsp; nm)</td> <td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a visualização de tethered-grande superfície moléculas de adn com um adn de proteína fluorescente binding peptide

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Grandes moléculas de DNA amarradas na superfície do vidro funcionalizado têm sido utilizadas na física e bioquímica de polímeros, particularmente para investigar interações entre o DNA e suas proteínas de ligação. Aqui, relatamos um método que usa microscopia fluorescente para visualizar grandes moléculas de DNA amarradas na superfície. Primeiro, as lamínulas de vidro são biotiniladas e passivadas por revestimento com polietilenoglicol biotinilado, que se liga especificamente ao DNA biotinilado por meio de ligantes de proteínas avidinas e reduz significativamente a ligação indesejável de interações não específicas de proteínas ou moléculas de DNA na superfície. Em segundo lugar, as moléculas de DNA são biotiniladas por dois métodos diferentes, dependendo de seus terminais. O DNA de extremidade romba é marcado com dUTP biotinilado em seu terminal hidroxila 3 ', por transferase terminal, enquanto o DNA de extremidade pegajosa é hibridizado com oligonucleotídeos complementares biotinilados por DNA ligase. Finalmente, um fluxo de cisalhamento microfluídico faz com que moléculas de DNA individuais se estendam até seus comprimentos de contorno completos após serem coradas com peptídeo de ligação à proteína fluorescente ao DNA (FP-DBP).

A Figura 1 mostra dois métodos de ADN de ancoragem diferentes dependendo das estruturas terminais da molécula de DNA. A Figura 1a ilustra a forma como as moléculas de ADN casquilhos pegajosos são hibridados com os oligonucleótidos biotinilados complementares, que são imobilizadas na superfície de PEG a revestida com avidina. A Figura 1B mostra a adição de biotinilado ou ddNTP de dNTP para o grupo hidroxilo 3 &#39;de um ADN de extremos ce...

Apresentamos uma abordagem para visualizar grandes moléculas de DNA coradas com peptídeo de ligação ao DNA de proteína fluorescente (FP-DBP) amarradas na superfície de polietilenoglicol (PEG) e vidro revestido de avidina e esticadas com fluxos de cisalhamento microfluídicos.

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema conveniente de análise de DNA para um microscópio epifluorescente, capaz de manipular moléculas individuais de DNA em superfícies de vidro modificadas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da visualização de DNA, ao examinar o próprio DNA, bem como proteínas que se ligam ao DNA e outras moléculas pequenas.A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de observar e analisar o DNA em movimento com facilidade. Para começar, coloque lamínulas de vidro em uma grade de PTFE e fixe-as no lugar, usando um pedaço de fita veda-rosca de PTFE. Após envolver as lamínulas, deixe um pedaço de fita com cinco centímetros de comprimento para ser usado no manuseio da grade durante o procedimento de limpeza.Em uma capela de exaustão, combine 350 mililitros de ácido sulfúrico e 150 mililitros de peróxido de hidrogênio em um béquer de vidro de um litro para preparar uma solução de ataque piranha. Em seguida, coloque a grade de lamínulas na solução. Após duas horas, esvazie o béquer e enxágue bem as lamínulas com água desionizada.Continue enxaguando as lamínulas até que o pH da água no béquer atinja um pH neutro. Em seguida, sonique as grades de lamínulas em um béquer contendo água durante 30 minutos, para limpar e derivatizar os substratos de vidro. Esvazie a água do béquer imediatamente antes da aminossilanização. Para começar, prepare a solução de aminossilanização adicionando dois mililitros de alcoxisilano e 10 mililitros de ácido acético glacial a 200 mililitros de álcool metílico em um recipiente limpo de polipropileno.Em seguida, coloque as lamínulas limpas na solução. Depois, coloque as lamínulas limpas na solução preparada e agite-as à temperatura ambiente e 100 rpm por 30 minutos. A seguir, sonique o recipiente com as lamínulas derivatizadas por 15 minutos a 75 watts.Em seguida, agite novamente em temperatura ambiente e 100 rpm por pelo menos 30 minutos. Após a conclusão, descarte a solução do béquer e lave as lamínulas três vezes, cuidadosamente: uma vez com álcool metílico e duas vezes com álcool etílico.Após a lavagem final, armazene as lamínulas em álcool etílico e utilize-as dentro de duas semanas. Primeiro, prepare 10 mililitros de uma solução de bicarbonato de sódio 0,1 molares e filtre-a através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons. Em seguida, dissolva dois miligramas de carbonato de succinimidila de biotina PEG e 80 miligramas de valerato de succinimidila de PEG em 350 micro litros da solução filtrada de bicarbonato de sódio.Proteja a solução da luz utilizando um tubo de proteção contra a luz. Agite o tubo vigorosamente por 10 segundos e, em seguida, centrifugue a 10.000 x g durante um minuto para remover quaisquer bolhas. Em seguida, enxágue uma lâmina de vidro com acetona, seguido de álcool etílico.Após a lavagem, deixe a lâmina secar completamente ao ar. Coloque uma gota de 50 microlitros da solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Abaixe lentamente uma lamínula amino silanizada sobre a gota em um ângulo ligeiro, de modo a não gerar bolhas de ar sob a lamínula.Em seguida, coloque as lâminas em uma câmara nivelada, escura e umidificada por pelo menos três horas até a noite seguinte, à temperatura ambiente. Quando terminado, feche o tubo de proteção contra a luz com a solução de PEG residual e mantenha-o a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as lamínulas PEGiladas abundantemente com água desionizada e, em seguida, armazene-as em local escuro e seco até o momento do uso.Para criar a câmara de fluxo, coloque tiras de fita adesiva dupla face em um suporte de acrílico, alinhando-as perpendicularmente aos orifícios de entrada e saída, de modo que não perturbem nenhum dos orifícios do canal. Em seguida, pressione a fita com a ponta de uma pipeta para selar os canais. Depois, coloque um lamínula PEGilado, com o lado PEGilado voltado para baixo, sobre a fita para formar as câmaras de fluxo.Para evitar vazamentos de solução, pressione a parte superior de um lamínula sobre a área onde a fita adesiva dupla face está colocada. Em seguida, adicione uma cola epóxi de secagem rápida às bordas das câmaras para fixá-las no lugar. Depois, conecte um pedaço de tubo com 2,5 centímetros de comprimento a uma seringa hermética e selo a junção com cola epóxi.Em seguida, conecte um tubo longo e flexível ao tubo proveniente da seringa. E novamente, vedar a junção com cola epóxi. Encha o tubo ligado à seringa com água desionizada, certificando-se de que não haja bolhas de ar.Em seguida, insira o tubo no orifício da câmara de fluxo que está selado com cola epóxi. E coloque uma ponteira de pipeta de 200 microlitros no outro orifício, para ser usada como reservatório. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para 50 microlitros por minuto.Em seguida, introduza 20 microlitros de uma solução de proteína avidina na câmara e mantenha-a por 10 minutos. Depois, carregue 20 microlitros de oligodesoxinucleotídeos biotinilados em uma seringa. Introduza na câmara e mantenha por 10 minutos.Se uma transferase terminal for usada, pule a adição de oligodesoxinucleotídeos. Em seguida, carregue 20 microlitros de uma solução de DNA em uma seringa, introduza-a na câmara de fluxo a uma taxa de 10 microlitros por minuto e mantenha-a por 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, lave a câmara de fluxo com 40 microlitros de tampão TE 1X a 50 microlitros por minuto.Após a lavagem, carregue a câmara com 40 microlitros do mesmo FP-DBP numa concentração de 80 nano-molar, em 1X TE. Para observar a faixa completa de alongamento das moléculas de DNA, aplique diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA utilizados. Observe o DNA sob uma objetiva de 60X, utilizando um microscópio fluorescente. Abaixo há um vídeo de microscopia fluorescente mostrando moléculas de DNA de bacteriófago lambda, ligadas à superfície, sendo alongadas pelo fluxo após ligação com oligonucleotídeos complementares biotinilados.Sob fluxo, as moléculas de DNA totalmente alongadas medem 16,5 mícrons de comprimento. Em contraste, as moléculas de DNA do bacteriófago T4 se alongam até um comprimento de 56,4 mícrons sob fluxo. Esse alongamento é reversível, e o DNA pode ser estendido e relaxado múltiplas vezes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o FP-DBP em análises de DNA maiores, bem como demonstrar o alongamento e a relaxação do polímero de DNA.

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JoVE Journal

Biology

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