Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão Drosophila Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é registrar as respostas elétricas intracelulares dos fotorreceptores de Drosophila e interneurônios visuais a estímulos luminosos controlados. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurocodificação, como como um estímulo luminoso irá codificá-lo em uma de suas respostas, ou como suas informações visuais e fotorreceptores e interneurônios extraem estímulos luminosos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece gravações duradouras e de alta qualidade do estudo, com poucos danos ao meio intracelular e à amostragem de informações.

A característica de demonstração que isso pode afetar é crítica, pois suas várias etapas são difíceis de aprender a executar corretamente sem vê-las. Puxe um microeletrodo de referência de borossilicato filamentado ou de tubo de vidro de quartzo usando um extrator de pipeta padrão. Tente obter uma redução curta e gradual.

As configurações exatas variam entre os instrumentos. O tamanho do poro na ponta não é crucial porque será quebrado para os experimentos. Em seguida, puxe um eletrodo de gravação do mesmo tubo de vidro e tente obter uma conicidade gradual fina de 10 a 15 milímetros de comprimento.

Em um microscópio de luz, monte o eletrodo em um lado de vidro com adesivo múltiplo e use uma objetiva de ar 40x para inspecionar sua ponta. Um bom eletrodo afunila suavemente para uma ponta invisivelmente pequena, em torno da qual padrões de interferência paralelos contínuos mais escuros e mais claros podem ser vistos. Pouco antes do experimento, preencha o eletrodo de referência com anéis de mosca, usando uma seringa de cinco mililitros conectada a um filtro de partículas, com uma ponta de plástico fina.

Para experimentos com fotorreceptores, carregue o eletrodo de registro com cloreto de potássio 3 molar até que uma gotícula se forme em sua extremidade maior. Isso minimizará o ruído da junção do líquido durante a gravação. Para trabalhar com LMCs histaminérgicos, encha os eletrodos de registro com acetato de potássio 3 molar, cloreto de potássio 0,5 milimolar para minimizar o efeito na bateria de cloreto da célula.

Comece carregando um frasco de mosca fresca com moscas de cinco a 10 dias. As moscas mais jovens são mais frágeis, mas podem ser registradas. Selecione a primeira mosca para eletrofisiologia.

Fêmeas grandes são mais fáceis de trabalhar. Quando estiver no tubo de captura, aproveite sua tendência inerente de subir na ponta da pipeta e tampe a ponta menor. Em seguida, conecte uma seringa de 100 mililitros com uma mangueira de plástico flexível à ponta da pipeta, que é ampliada apenas para deixar uma Drosophila passar e conecte a outra extremidade a uma ponta de pipeta grande presa ao porta-moscas.

Em seguida, esprema um pequeno volume de ar da seringa para ejetar a mosca no porta-moscas. Olhe através do estereomicroscópio e administre suavemente mais ar até que a cabeça da mosca esteja saliente da extremidade cônica do porta-moscas. Certifique-se de que a mosca esteja firmemente presa pelo tórax.

Em seguida, prenda a mosca com cera de abelha. Use a temperatura mais baixa do aquecedor de cera para derreter a cera de forma limpa, que parecerá transparente. Se estiver muito quente, a cera queimará.

Imobilize a cabeça da mosca aplicando um pouco de cera de abelha na tromba e no canto do olho direito, evitando a córnea. Fixe esses dois pontos no porta-moscas. Conclua esta etapa rapidamente para evitar queimar a mosca.

Em seguida, coloque óculos de proteção e fabrique uma microfaca. Prenda uma lâmina de barbear de aço não inoxidável com dois suportes de lâmina planos e quebre uma pequena tira de sua borda afiada. Idealmente, produza uma borda afiada que se assemelhe a uma torre.

Agora, com cuidado e grande atenção aos detalhes, use a microfaca para abrir alguns omatídeos do olho esquerdo da mosca, como quatro a cinco omatídeos da cutícula dorsal logo acima do equador do olho. Isso fornecerá a passagem para o microeletrodo de gravação. Isso é bastante desafiador, requer uma faca bem feita e deve ser aprendido com a prática.

Em seguida, remova suavemente o pequeno pedaço de córnea da abertura, expondo a retina por baixo. Agora, usando o cabelo fino do aplicador de vaselina, cubra rapidamente o buraco com uma pequena gota de vaselina. A geléia tem o benefício adicional de reduzir a capacitância intramural da pipeta.

Evite manchar os olhos, pois isso desfoca a ótica. Ao operar o microeletrodo ampmais vivo, sempre seja aterrado tocando na superfície metálica da gaiola de Faraday ou mesa antivibração para evitar cargas estáticas. Prenda a mosca montada ao poste da plataforma de preparação da mosca.

Gire o porta-moscas de modo que o olho esquerdo da mosca fique voltado diretamente para o investigador. Em seguida, use um micromanipulador de curso pequeno para inserir o eletrodo de referência rombo suavemente através dos ocelos da mosca na cápsula da cabeça. Certifique-se de que a mosca ainda pareça saudável e mova suas antenas.

A preparação deve ser excelente para merecer registro. Agora dirija o microeletrodo de gravação afiado no olho esquerdo através da abertura revestida de gelatina. Ao entrar no tecido, a localização da ponta do eletrodo deve ser aparente por seu padrão de refletância.

A ponta frágil do eletrodo deve ser guiada perfeitamente ou quebrará, o que é muito desafiador. Dependendo do tipo de célula que está sendo registrada, a cabeça da mosca deve ser orientada de forma ligeiramente diferente. Com os eletrodos no lugar, ligue o microeletrodo amplificador.

Em seguida, desligue a fonte de luz fria, desconecte-a da rede elétrica e conecte-a ao aterramento central para minimizar o ruído elétrico induzido pelo loop de aterramento. Em seguida, ajuste as guias de luz gooseneck para que o sistema de braço Carden possa ser movido livremente ao redor da mosca. Em seguida, desligue as luzes da sala para colocar a preparação da mosca em relativa escuridão.

Agora meça a resistência do eletrodo de gravação no olho. Deve estar entre 100 e 260 megaohms. Às vezes, a ponta é bloqueada e pode ser limpa usando as funções de zumbido capacitivo e pulso de corrente do amplificador.

Se isso não ajudar, use um novo eletrodo. Em seguida, defina o amplificador para corrente clamp ou ponte e zere a tensão entre os eletrodos. Depois que a mosca estiver adaptada ao escuro por alguns minutos, insira a ponta do eletrodo de gravação no olho em etapas de 0.1 a um mícron usando um passo piezoelétrico ou usando uma rotação suave do botão de resolução fina.

Em cada etapa, estimule o olho com um flash de luz de um a 10 milissegundos. Cada flash de luz causará uma breve queda na tensão ou no ERG. Quando a ponta do eletrodo entra na lâmina, fechando nos LMCs, o ERG se inverte.

Em seguida, prossiga com as medições. Devido à não invasividade, o desempenho do sinal de células individuais pode ser estudado em seu estado quase natural. A resposta de voltagem de um fotorreceptor R1-R6 à luz fraca e brilhante foi medida a 20 graus Celsius.

Em seguida, um fotorreceptor R1-R6 foi comparado com um LMC a 25 graus Celsius. Cada um foi medido em uma mosca diferente, pois as gravações intracelulares por dois microeletrodos afiados na mesma mosca são muito difíceis de serem viáveis. A repetibilidade das respostas torna-se óbvia quando os dados são sobrepostos.

As relações sinal-ruído no domínio da frequência foram obtidas por quatro anos, transformando os blocos de dados de sinal e ruído em espectro de potência e, em seguida, dividindo o espectro médio de potência do sinal pelo espectro médio de potência de ruído correspondente. O resultado pode ser extremamente sensível aos sinais nas melhores preparações. A técnica pode ser usada para registrar muitas espécies.

As moscas da cenócia receberam a mesma estimulação de luz naturalista e repetitiva a 19 graus Celsius. Os dados foram obtidos pré e pós-sinapticamente da mesma mosca, avançando o eletrodo de registro. A dinâmica mais rápida do registro é consistente com a natureza predatória desta espécie.

Uma vez dominada, essa técnica permite gravações sempre longas e de alta qualidade, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante perceber, quero dizer, é como aprender a tocar piano. Quanto mais você praticar, melhores resultados obterá.

Após esse procedimento, outros métodos, como intervenções farmacológicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o papel dos neuromoduladores na formação das respostas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiofísica explorarem como otimizar a informação, captura e transferência de luz, além das reações bioquímicas cáusticas na maquinaria de fototransdução e nas seguintes ciências biológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar a Drosophila para experimentos intracelulares e como despertar as respostas neurológicas de seus fotorreceptores e interneurônios.