Name: Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão Drosophila Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a registrar respostas elétricas intracelulares de fotorreceptores e interneurônios visuais de Drosophila a estímulos luminosos controlados. Esta técnica eletrofisiológica minimiza danos celulares e permite gravações de alta qualidade.

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Os autores agradecem a Mick Swann, Chris Askham e Martin Gautrey por suas importantes contribuições no projeto e construção de muitos componentes elétricos e mecânicos das plataformas. A pesquisa atual de MJ é apoiada pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC Grant: BB / M009564 / 1), o State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning open research fund (China), High-End Foreign Expert Grant (China), Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (Finlândia) e a bolsa Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

Os autores não têm nada a revelar

Apresentamos as principais etapas básicas de como usar microeletrodos convencionais afiados para registrar as respostas intracelulares dos fotorreceptores R1-R6 e LMCs em olhos de moscas intactos. Este método foi otimizado, juntamente com ferramentas de hardware e software sob medida, nos últimos 18 anos para fornecer gravações de alta qualidade e longa duração para responder a uma ampla gama de questões experimentais. Ao investir tempo e recursos para construir configurações experimentais robustas e precisas e produzir microeletrodos com propriedades elétricas favoráveis, gravações de alta qualidade podem se tornar a norma em qualquer laboratório que trabalhe com neurofisiologia visual de Drosophila . Embora sistemas de gravação e estimulação de luz bem projetados sejam importantes para a execução rápida de diferentes paradigmas experimentais, existem três etapas processuais que são ainda mais críticas para obter gravações bem-sucedidas: (i) fazer a preparação da mosca com o mínimo de danos aos olhos, (ii) puxar microeletrodos com as propriedades elétricas corretas e (iii) conduzir o eletrodo de gravação para o olho sem quebrar sua ponta. Em última análise, para registrar dados significativos, o investigador precisa entender a base física da eletrofisiologia e como fabricar microeletrodos adequados para os tipos de células visadas.
Portanto, as limitações dessa técnica são definidas principalmente pela paciência, experiência e capacidade técnica do investigador. Como essa técnica pode levar muito tempo para ser dominada por pequenas células de Drosophila , é aconselhável que os eletrofisiologistas em treinamento pratiquem primeiro com olhos de insetos maiores, como a mosca varejeira36 ou o gafanhoto35, usando o mesmo equipamento. Uma vez que a realização de registros intracelulares de alta qualidade dos fotorreceptores e interneurônios maiores se torne rotina, é hora de passar para o olho da Drosophila . Outra limitação da técnica diz respeito à identificação celular. As células penetradas de Drosophila podem ser carregadas eletroforeticamente com corantes, incluindo amarelo de Lúcifer ou neurobiotina. No entanto, devido ao pequeno tamanho da ponta dos microeletrodos, a eletroforese funciona com menos eficiência do que com eletrodos de menor resistência, como eletrodos de remendo. Além disso, os microeletrodos preenchidos com corante caracteristicamente têm propriedades elétricas menos favoráveis, tornando muito mais difícil registrar respostas de alta qualidade com eles de fotorreceptores de Drosophila e LMCs.
Um problema técnico que ocorre às vezes é o sinal de entrada instável ou a completa falta dele. Isso geralmente está associado ao sinal de tensão estar constantemente à deriva ou mais alto/mais baixo do que o alcance de gravação do amplificador. Na maioria das ocasiões, esse comportamento é causado pelo bloqueio do eletrodo de gravação (ou sua ponta é muito fina - com resistência muito alta ou capacitância intramural - para conduzir adequadamente mudanças rápidas de sinal). Embora se possa tentar desbloquear a ponta zumbindo a capacitância do eletrodo, o que às vezes funciona, muitas vezes a situação é melhor resolvida simplesmente trocando o eletrodo de gravação. Isso pode exigir ajustes de parâmetros no instrumento extrator de microeletrodos para diminuir a resistência da ponta dos novos eletrodos. A ponta do eletrodo também pode ficar bloqueada em preparações, para as quais demorou muito para cobrir o orifício da córnea com vaselina. O contato prolongado com o ar pode secar o tecido retiniano recém-exposto, transformando sua camada superficial em uma substância semelhante a cola. Se for esse o caso, o investigador normalmente vê uma bolha vermelha de tecido presa no eletrodo de gravação ao puxá-lo para fora do olho. A única solução aqui é fazer uma nova preparação. A vaselina pode proporcionar muitos benefícios para os registros eletrofisiológicos: (i) evita a coagulação da hemolinfa que poderia romper a ponta do eletrodo; (ii) reveste a ponta do eletrodo reduzindo sua capacitância intramural, o que diminui a constante de tempo do eletrodo e, portanto, tem o potencial de melhorar a resolução temporal dos sinais neurais registrados40,41; (iii) mantém a ponta do eletrodo limpa, facilitando as penetrações; e após a penetração, (iv) pode até ajudar a selar a ponta do eletrodo na membrana celular42. 
O sinal pode ainda ser instável ou perdido quando o fio de cloreto de prata do porta-eletrodo é quebrado ou descloridado; nesse caso, basta substituir ou reclorar o fio antigo. O sinal ausente também pode resultar de um (ou ambos) dos porta-eletrodos não estarem conectados com segurança aos seus conectores. No entanto, é extremamente incomum que um equipamento esteja com defeito. Se o sinal for indetectável e todas as outras possibilidades tiverem sido esgotadas, testar se cada parte do aparelho de registo, incluindo o headstage, amplificador, filtros passa-baixo e conversores AD/DA, estão correctamente ligados e a funcionar normalmente. Uma maneira de conseguir isso é substituir cada instrumento por outro de um equipamento que funcione normalmente. Como alternativa, use um gerador de sinal para verificar o desempenho dos componentes eletrônicos um por um.
Mas talvez o problema técnico mais comum enfrentado pelo eletrofisiologista seja o de registrar ruído. Em termos gerais, o ruído de gravação é a atividade elétrica observada além da resposta neuronal direta a um determinado estímulo. Como a preparação da mosca, quando feita corretamente, é muito estável, o ruído observado (além da variável natural das respostas) geralmente resulta de loops de aterramento no equipamento de gravação ou é captado de dispositivos elétricos próximos. Esse ruído é tipicamente um zumbido principal de 50/60 Hz e seus harmônicos; mas às vezes composto de formas de onda mais complexas. Para descobrir a origem do ruído, remova o suporte de preparação da mosca da configuração, conecte os eletrodos de gravação e referência através de uma gota de Ringer de mosca (ou coloque-os em um pequeno banho de solução de Ringer; consulte a etapa 1.2.6) e grave o sinal no modo CC ou ponte. Se o ruído for observável no sinal gravado, isso provavelmente significa que o ruído é externo à preparação da mosca.
Outro bom teste para identificar a origem do ruído é substituir os porta-eletrodos por um modelo de célula elétrica conectada ao amplificador. Em uma configuração idealmente configurada e aterrada, o sinal gravado agora deve estar praticamente livre de ruído, mostrando apenas o ruído de bits estocástico do conversor AD (na melhor das hipóteses, nem isso!). Se o ruído ainda estiver presente, verifique novamente se todos os equipamentos da plataforma estão devidamente aterrados. Uma abordagem conveniente para detectar loops de aterramento é: (i) desconectar todos os fios de aterramento de todas as peças dentro da plataforma; ii) assegurar que, depois de o fazer, todas as partes sejam efectivamente isoladas do solo, por meio de um ohmímetro; (iii) conectar as partes, uma a uma, diretamente ao aterramento central, não através de qualquer outra parte da plataforma. Tente também alterar as configurações do equipamento. Por exemplo, às vezes, mover o computador e o monitor para mais longe do equipamento pode reduzir o ruído; No entanto, em outras ocasiões, mover o computador dentro do rack do equipamento reduz o ruído. Também vale a pena desconectar o equipamento próximo para ver se o ruído é reduzido ou proteger componentes adicionais. Além disso, tente desconectar ou substituir diferentes componentes do equipamento de gravação, especialmente cabos BNC (que podem ter conexões de aterramento defeituosas). Se apenas ruído de bit for observado ao usar o modelo de célula, a fonte de ruído inicial são os eletrodos ou a própria preparação da mosca. Por exemplo, pode ser que o eletrodo de referência esteja inadvertidamente tocando um nervo motor ou fibras musculares ativas dentro da cápsula da cabeça (ou perturbando os músculos de vôo no tórax - se colocado lá). Geralmente é mais simples preparar uma nova mosca para gravação, tomando cuidado para minimizar os danos à mosca. Mas se o ruído persistir e for de banda larga, é provável que os eletrodos estejam abaixo do ideal para os experimentos; muito afiado / fino (portanto, muito barulhento) ou apenas errado para o propósito; Vimos até eletrodos de quartzo agindo como antenas - captando sinais de transmissão fracos! Embora a iteração das configurações de parâmetros do instrumento extrator para gerar os microeletrodos certos para gravações consistentes de alta qualidade de tipos específicos de células possa exigir muito esforço, vale a pena. Uma vez que os eletrodos de gravação estejam bem adaptados para os experimentos, eles podem fornecer gravações duradouras de excelente qualidade.
Técnicas de gravação de microeletrodos afiados podem ser aplicadas de forma semelhante para estudar o processamento de informações neurais em uma infinidade de preparações, incluindo diferentes camadas de processamento nos olhos e no cérebro do inseto43,44. Como as pontas dos microeletrodos podem ser muito finas, elas normalmente danificam menos as células estudadas do que a maioria das aplicações de patch-clamp. É importante ressaltar que os modernos amplificadores de microeletrodos de amostra e retenção permitem um bom controle das propriedades elétricas das pontas40,45-47. Assim, quando aplicada corretamente, essa técnica pode fornecer dados confiáveis de preparações in vivo3,5,7-10,44 ou in vitro48 com alta relação sinal-ruído com resolução inferior a milissegundos. Essa precisão seria impossível com as técnicas de imagem óptica atuais, que são mais barulhentas e lentas. Além disso, o método pode ser usado para caracterizar as propriedades da membrana elétrica de pequenas células em configurações de pinça de corrente e tensão5,29,33,36,40-42,49, fornecendo dados valiosos para abordagens de modelagem biofísica e empírica7,8,11,33,49-54 que ligam experimentos à teoria.

A mosca da fruta (Drosophila melanogaster) olho composto é um grande sistema modelo para investigar a organização funcional dos fotorreceptores e interneurônio matrizes para a amostragem de imagem neural e processamento, e para a visão animal. O sistema tem o esquema de ligações mais completa 1,2 e é amável a manipulações genéticas e monitoramento da atividade neural preciso (de alta relação sinal-ruído e hora resolução) 3-10. O olho Drosophila é modular, contendo ~ 750 estruturas cobertas de lente aparentemente regulares chamados ommatidia, que juntos fornecem a um campo visual panorâmico que cobre quase todas as direções ao redor de sua cabeça voar. Informação primária do olho amostragem unidades são seus fotorreceptores rabdoméricos 7,8,11. Cada omatídeo contém oito células fotorreceptoras (R1-R8), que compartilham a mesma lente faceta, mas estão alinhados com sete direções diferentes. Embora os fotorreceptores exteriores R1-R6 ARe mais sensível à luz azul-verde, sensibilidades espectrais das células internas R7 e R8, que se encontram em cima uns dos outros e apontam para a mesma direcção, apresentam três subtipos distintos: pálido, amarelo e a área de rebordo dorsal (DRA) 12- 15. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Figura 1. Organização Funcional do Olho Drosophila. (A) Os dois primeiros gânglios óptico, retina e lâmina, são destacadas em cinza no interior do olho da mosca. Fotorreceptores da retina R1-R6 e lâmina grandes células monopolar (LMCs: L1-L3) são facilmente acessíveis in vivo para gravações microeletrodos afiada convencionais. O eletrodo esquemática destaca o caminho normal para gravar a partir de R1-R6 na retina. Um caminho para gravar a partir de LMCs na lâmina é deslocar paralelamente o eletrodo para a esquerda. (B) lâmina é uma matriz de órgão retinotopicallyized cartuchos, cada um dos quais é embalado com neurónios que processa informação a partir de uma pequena área específica no espaço visual. Devido à superposição neural, seis fotorreceptores de diferentes ommatidia vizinhos enviam seus axónios (R1-R6) para o mesmo cartucho de lâmina, formando sinapses de saída histaminï¿½gicos para L1-L3 e uma célula amacrine (Am). (C) A difusão de informação entre os terminais de axónios neuronais R1-R6 e os interneurónios visuais (incluindo L4, L5, Lawf, C2, C3 e T1), no interior de um cartucho de lâmina é complexa. (D) R1-R6 axônios fotorreceptoras receber feedbacks sinápticos de células monopolares L2 e L4. (B) e (C) modificado a partir de Rivera-alba et al 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> O olho Drosophila é do tipo neural superposição 16. Isto significa tchapéu de sinais neurais de oito fotorreceptores pertencentes a sete ommatidia vizinha, que olham para o mesmo ponto no espaço, são agrupados em um cartucho de neural nos próximos dois neuropils: a lâmina e medula. Enquanto os seis fotorreceptores exteriores projecto R1-R6 seus terminais de axónios para colunas neurais na lâmina (Figura 1), as células R7 e R8 ignorar essa camada e fazer contactos sinápticos com a sua coluna correspondente medula 17-19. Estas fiações exactas produzir o substrato neural para o mapeamento de mosca retinotópica visão inicial, após o que cada lâmina (Figuras 1A-C) e medula coluna (cartucho) representa um único ponto no espaço. Entradas directas de fotorreceptores R1-R6 são recebidos pelos grandes células monopolar (LMCs: L1, L2 e L3) ea célula amácrina (AM) na lâmina 1,2,20. Destes, L1 e L2 são as maiores células, mediadores principais vias de informação (Figura 1D), WHIch respondem a on e bordas Off-movimento, e, assim, formar a base computacional do detector de movimento 21,22. Experimentos comportamentais sugere que pelo contraste intermediária, as duas vias facilitar a percepção do movimento de sentidos opostos: back-to-frente em L1 e para frente e para trás em células L2 23,24. Conectividade implica ainda que os neurônios L4 pode desempenhar papel fundamental na comunicação lateral entre cartuchos vizinhos 25,26. sinapses recíprocas foram encontradas entre as células L2 e L4 localizados na mesma e dois cartuchos adjacentes. Jusante, cada célula L2 e seus três células L4 associados projetam seus axônios para um objectivo comum, o neurônio Tm2 na medula, onde se acredita entradas de cartuchos vizinhos para ser integrado para o processamento do movimento 27 de front-to-back. Embora os neurônios L1 receber entrada a partir do mesmo cartucho L2s via ambas as junções comunicantes e sinapses, eles não estão diretamente ligados à cartuchos de lâmina L4s e, portanto adjacentes. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Comentários Synaptic para axónios fotorreceptoras R1-R6 são fornecidas apenas pelos neurónios pertencentes aos circuitos / L4 L2 mas não a via de 1,2 L1 (Figura 1D). Enquanto as conexões do mesmo cartucho são seletivamente de L2 a R1 e R2 e de L4 a R5, todos os fotorreceptores R1-R6 receber feedback sináptica de L4 de um ou de ambos os cartuchos vizinhos. Além disso, existem fortes ligações sinápticas de AM para R1, R2, R4 e R5, e células gliais, também estão sinapticamente ligado à rede e pode, assim, participar na neural de processamento de imagem 6. Finalmente, axonais-gap junctions, ligando vizinha R1-R6 e entre R6 e R7 / R8 fotorreceptores na lâmina, contribuir para a representação da informação assimétrica e o processamento em cada cartucho 14,20,28. Gravações de tensão intracelulares de fotorreceptores individuais e interneurônios visuais em Drosophila quase intacto fornecer alta r sinal-ruídodados ATIO com resolução sub-milissegundo 3,5,7-10,29, que é necessário para dar sentido às computações neurais rápidas entre os neurônios conectados. Este nível de precisão é impossível por técnicas de imagem ópticos atuais, que são significativamente mais ruidoso e tipicamente operam em 10-100 resolução ms. Além disso, porque os eletrodos têm muito pequenas e afiadas pontas, o método não é restrito aos corpos celulares, mas pode fornecer gravações diretas de estruturas neurais ativas pequenas; tais como árvores dendríticas os LMCs &#39;ou axônios fotorreceptoras, que não podem ser acessados ​​por muito maiores pontas dos eletrodos de patch-clamp. É importante ressaltar que o método também é estruturalmente menos invasivo e prejudicial do que a maioria das aplicações de patch-clamp, e assim afectam menos intracelular meio e informações de amostragem das células estudadas. Assim, as técnicas de microeletrodos afiada convencionais têm contribuído, e continuar a contribuir, descobertas fundamentais e uma visão original em infor neuralprocessamento de infor- na escala de tempo apropriado; melhorar o nosso entendimento mecanicista de visão 3-10. Este artigo explica como em gravações intracelulares vivo a partir de Drosophila fotorreceptores e LMCs R1-R6 são realizados no laboratório Juusola. Este protocolo irá descrever como construir uma plataforma de eletrofisiologia adequada, preparar a mosca, e realizar as gravações. Alguns dados representativo é apresentado, e alguns problemas comuns e as possíveis soluções são discutidas que podem ser encontrados quando utilizando este método.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Zoom Estéreo para fazer a preparação da mosca</td><td>Oculares Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H/22</td><td>Capaz de ampliação de ~150X com longa distância de trabalho; suporte de montagem de mesa de aço pesado sob medida</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio na configuração intracelular</td><td>&middot; &nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; oculares: WHN30x-H/22</td><td>As oculares de 30X são necessárias para ver bem os reflexos da ponta do eletrodo ao conduzi-lo através do pequeno orifício da córnea para o olho</td></tr><tr><td>Microscópio Nikon</td><td>SMZ645; oculares: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibração</td><td>Melles Griot</td><td>Com furos métricos M6 na placa</td> <td>de ensaioNossos equipamentos sob medida têm um grande orifício perfurado através da placa de ensaio grossa que permite a entrada do poste da plataforma de preparação de moscas (abriga um dissipador de calor de cobre com eletrônicos) por baixo dos</td></tr> Micromanipuladores <tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>Em nossas configurações intracelulares, diferentes sistemas de micromanipuladores são usados para conduzir os eletrodos de gravação de modelagem no olho da mosca. Todos os manipuladores listados estão fornecendo com sucesso gravações estáveis e duradouras de fotorreceptores de Drosophila e LMCs.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley eixo xyz com controle</td><td></td><td></td>manual fino</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex eixo triplo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml; rzh&auml; usuário</td><td>M&auml; rzh&auml; usuário DC-3K com passo piezo de eixo x adicional e controlador</td><td></td><td></td>MS 314</tr><tr><td>Suportes magnéticos</td><td>Qualquer base magnética com interruptor liga/desliga servirá</td><td></td><td>Por exemplo, para gerenciar cabos dentro da gaiola de Faraday</td></tr><tr><td>Suportes de Eletrodos</td><td>Aparelho Harvard</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Fio de Prata</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0,3 - 0,5 mm de diâmetro; precisa ser cloridizado para os porta-elétrodos</td></tr><tr><td>Fonte de Luz de Fibra Óptica</td><td>Muitos diferentes, incluindo Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pacotes de Fibra Óptica</td><td>Tecnologia</td><td></td> UltraFine <td>Para fornecer o estímulo de luz LED ao sistema de braço Cardan. Usamos guias de luz líquida e de quartzo (variam de UV a IR)</td></tr> <tr><td>Tubo</td> de Cateter de Mosca Thorn Labs <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P80-50P 50ml Cent. Tubo PP., Pacote de 100 Pcs</td><td>Corte o fundo cônico de um tubo de centrífuga de plástico de 50 ml e cole uma ponta de pipeta de 1 ml nele.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Aquisição Digital</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de microeletrodo de corrente/braçadeira de tensão de eletrodo único</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Excelente desempenho!</td></tr><tr><td>Padrão de estágio principal</td><td>(+/- 150 nA)</td>Para fontes de luz LED <td>npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>e drivers</td><td>2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)</td><td></td><td>Muitos de nossos sistemas de estímulo são construídos internamente&nbsp;</td></tr>Software <tr><td>de Aquisição e Análise auto-projetado e construído</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Muitas empresas para escolher entre</td><td></td><td>Biosyst; sistema baseado em Matlab escrito sob medida para trabalho experimental e teórico no laboratório Juusola</td></tr><tr><td>Computador pessoal ou Mac</td><td></td><td></td><td>Garantir que PC ou Mac seja compatível com o sistema de aquisição de dados e software</td></tr><tr><td>Sistema de braço cardan&nbsp;</td><td>Auto-projetado e construído</td><td></td><td>Fornecendo posicionamento preciso x, y, z dos estímulos de luz</td></tr><tr><td>Sistema de controle de temperatura Peltier&nbsp;</td>Gaiola de Faraday <td>auto-projetada e construída</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Blindagem auto-construída</td><td></td><td>contra ruído eletromagnético</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de borossilicato filamentado</td><td>Diâmetro externo: 1 mm</td><td></td>Diâmetro interno: 0,5 - 0,7 mm Capilares de vidro de quartzo filamentado Diâmetro externo: 1 mm Diâmetro interno: 0,5 -<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td> Extrator de Pipetas de 0,7 mm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modelo P-2000 laser Extrator de Micropipetas Flamejante/Marrom</td><td>Para eletrodos de referência de borosilicato, use o programa predefinido #11 (eletrodos de patch): Calor = 350; Filamento = 4; Velocidade 36; Atraso = 200).1.2.1). Para eletrodos de gravação de borosilicato, use o programa predefinido #12 (isso normalmente puxa bons sharps convencionais&nbsp; para gravações de fotorreceptores): Calor = 355; Filamento = 4; Velocidade 50; Atraso = 225; Puxe = 150. Para gravações LMC, que requerem eletrodos com pontas mais finas, esses valores precisam ser ajustados. Para puxar capilares de quartzo, o manual P-2000 sugere programas para microeletrodos de ponta fina. Esses programas' Os parâmetros predefinidos servem como pontos de partida úteis para modificações sistemáticas para gerar eletrodos com bom sucesso de penetração e baixo ruído de gravação.</td></tr><tr><td>Solução de Ringer Extracelular para o</td><td>eletrodo de referência Produtos químicos da Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacarose</td><td>Veja a receita na seção do protocolo</td></tr><tr><td>3 M Solução KCl para preencher o microeletrodo de registro filamentado</td><td>Sais da Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina Vaselina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td><td></td>de barbear de aço não inoxidável</tr><tr><td>Porta-lâminas/quebrador</td><td>Ferramentas de Ciência Fina Por Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternativamente, use argila de moldagem</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools Por Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (pontas superfinas)</td></tr></tbody></table>

método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; drosophila</em&gt; fotorreceptores e interneurônios à luz estímulos<em&gt; in vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

As respostas de voltagem de fotorreceptores de insetos e interneurônios visuais podem ser registradas com precisão com microeletrodos pontiagudos convencionais. O método descrito aqui permite ao investigador medir respostas intracelulares de alta qualidade de longa duração (de minutos a horas) de fotorreceptores R1-R6 de Drosophila e grandes células monopolares (LMCs) a estímulos luminosos. Como o sistema de gravação tem baixo ruído, ele pode ser usado para estudar a variabilidade entre células individuais no olho da mosca e como suas saídas refletem as propriedades físicas do ambiente visual. Descrevemos todas as etapas principais na execução dessa técnica. As etapas básicas na construção de uma configuração eletrofisiológica apropriada para registro, como projeto e seleção do equipamento experimental, são descritas. Também explicamos como se preparar para a gravação fazendo a gravação apropriada (nítida) e os eletrodos de referência (rombos). São fornecidos detalhes sobre como consertar uma mosca intacta em um porta-moscas sob medida, preparar uma pequena janela em seu olho e inserir um eletrodo de gravação através deste orifício com danos mínimos. Explicamos como localizar o centro do campo receptivo de uma célula, adaptar a célula estudada ao escuro ou à luz e registrar suas respostas de voltagem a estímulos dinâmicos de luz. Finalmente, descrevemos os critérios para gravações normais estáveis, mostramos as respostas de voltagem características de alta qualidade de células individuais a diferentes estímulos luminosos e definimos brevemente como quantificar seu desempenho de sinalização. Muitos aspectos do método são tecnicamente desafiadores e exigem prática e paciência para dominar. Mas, uma vez aprendido e otimizado para os objetivos experimentais do investigador, ele fornece dados neurofisiológicos in vivo excelentes.

O método de gravação de microeletrodos afiada, tal como adaptado aqui para o olho Drosophila, pode ser usado para quantificar de forma fiável de amostragem neural de informação e processamento nas células da retina e lâmina, e comunicação entre eles 4,5,7,8,10,33. Ao usá-lo para estudar a codificação em diferentes estoques de tipo selvagem, mutantes ou linhagens de moscas geneticamente modificadas, o método tem provado o seu valor; não só para quantificar os efeitos de uma mutação, temperatura, dieta ou de expressão seleccionado 3,4,6,9,10,14,30,34, mas também em revelar razões mecanística para comportamentos visuais alteradas 14,34. O método também é facilmente aplicável a outras preparações de insetos 35,36, capacitando estudos visão neuroetológica. Em seguida nós mostrar alguns exemplos de suas aplicações bem sucedidas. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Figura 7. TensãoRespostas de uma mosca da fruta R1-R6 fotorreceptores a um pulso de luz a 20 e 25 ° C. Uma vez que as penetrações microeléctrodo afiadas são, frequentemente, muito estável, é possível gravar as respostas tensão da mesma fotorreceptores R1-R6 a um dado estímulo a luz diferentes temperaturas ambiente pelo aquecimento ou arrefecimento da mosca. Em nossos set-ups, fly-titular da é colocada em um sistema de controle de temperatura de circuito fechado baseada Peltier-element-. Isso nos permite alterar a temperatura da cabeça da mosca em segundos. Temperatura mais elevada acelera as respostas de tensão e caracteristicamente reduz o potencial de repouso de fotorreceptores R1-R6 (como indicado pelas setas vermelhas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Estudando o efeito da temperatura na saída de fotorreceptores <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Com um bem concebido e sistema de gravação isolada de vibrações, o método pode ser utilizado para medir o efeito da temperatura na saída de uma célula neural indivíduo por aquecimento ou arrefecimento da mosca. O exemplo dado mostra as respostas de tensão a um pulso de 10 ms de comprimento brilhante, registrados no mesmo fotorreceptor R1-R6 em 20 e 25 o C (Figura 7). Quantificada antes de 4,9, o aquecimento reduz potencial de repouso de um fotorreceptor na escuridão, e acelera as respostas de tensão. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Figura 8. Desempenho sinalizando uma Fruit Fly R1-R6 fotorreceptores melhora com a intensidade de luz (A) a saída de fotorreceptores para escurecer (abaixo) e brilhantes. (Acima; 10.000 vezes uma luz mais brilhante) repetiu naturalista séries temporais de intensidade de luz registado pela mesma microeletrodosna mesma célula a 20 ° C. As respostas ao estímulo luminoso são maiores, porque integram mais amostras, respostas elementares (solavancos) para fótons individuais 4,5,7,8. (B) 20 respostas tensão de um segundo de duração consecutivos são sobrepostos. As respostas individuais (cinza claro) foram tomadas após as tendências adaptativas (seta em A) tinha diminuído (caixa pontilhada em A). Os meios de resposta correspondente (os sinais) são os vestígios mais escuras. A diferença entre o sinal e as respostas individuais é o ruído. (C) As células &#39;desempenho sinalização foi quantificada pelas gravações de&#39; relações sinal-ruído (SNR) usando os métodos padrão 4,5,7,8. Saída de fotorreceptores tem cerca de 64 Hz mais ampla gama de sinalização de confiança no estímulo luminoso ( &#39;≥1 brilhante, até 84 Hz do que no dim (SNR SNR)&#39; Dim ≥1, até 20 Hz), com signal-to-noise ratio melhorando consideravelmente; de SNR Dim MAX = 87 a SNR brilhante MAX = 1.868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Estudar Adaptação e codificação neural por repetitivo Estimulação O noninvasiveness do método, causando relativamente pouco dano nas estruturas da retina e da lâmina, faz com que seja ideal para estudar o desempenho de sinalização de células individuais a diferentes estímulos luminosos no seu próximo estado fisiológico natural in vivo. A Figura 8 mostra respostas de tensão de um R1- R6 fotorreceptor a um repetido naturalista série estímulo luminoso tempo de intensidade fraca e brilhante a 20 ° C, enquanto que a Figura 9 </strong&gt; mostra as respostas de outro fotorreceptor R1-R6 e uma LMC a um estímulo naturalista diferente a 25 o C. As gravações pré e pós-sinápticos foram realizadas separadamente a partir de duas moscas diferentes, porque as gravações intracelulares simultâneos entre dois microeletrodos afiada na mesma mosca, um na retina e o outro na lâmina, são muito difíceis de ser viável 30. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> Figura 9. Respostas tensão de uma mosca de fruto R1-R6 fotorreceptores e LMC à Estimulação naturalista repetida a 25 o C. (A) R1-R6 (cinza) e LMC (preto) Saídas gravada por diferentes microeletrodos de diferentes moscas. (B) 20 totalmente pré-luz adaptado consecutivo (acima) e pós-sinápticos (abaixo) as respostas ao mesmo padrão de estímulo naturalista com respostas individuais, mostrado em cinzento claro de umd os correspondentes meios de resposta (os sinais) como os traços mais escuros. A diferença entre o sinal e as respostas individuais é o ruído. (C) As células &#39;desempenho sinalização foi quantificada pelas gravações de&#39; relações sinal-ruído (SNR). Saída LMC tem cerca de 10 Hz mais ampla gama de sinalização confiável (SNR &#39;LMC ≥1, até 104 Hz) do que a produção R1-R6 (SNR&#39; R ≥1, até 94 Hz). Ambos os rácios de sinal-para-ruído são elevados (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), e como o ruído de gravação era baixa, as suas diferenças refletem diferenças de codificação reais entre as células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.</a> Após o início do estímulo, as gravações típicoly mostrar rápida adaptação tendências que em grande parte desaparecem dentro de 5-6 seg. A partir de então, as células produzem respostas altamente consistentes para cada apresentação longa estímulo 1 segundo (cada caixa pontilhada inclui 20 destes). A reprodutibilidade das medidas torna-se óbvio quando estes são sobrepostos (Figura 8B e Figura 9B). As respostas individuais são os traços cinzas finas, e sua significa o traço mais escura mais grosso. A resposta média é tomada como o sinal neuronal, ao passo que o ruído neural é a diferença entre a média e cada resposta individual 4,5,9,37,38. As respectivas relações sinal-para-ruído no domínio da frequência (Figura 8C e Figura 9C) foram obtidos por Fourier-transformar os fragmentos de dados de sinal e de ruído na espectros de potência, e dividindo-se o espectro de potência do sinal significativo com o correspondente espectro de potência média de ruído 4, 5,9,37,38. Caracteristicamente, as proporções máximas de sinal-para-ruído óf as saídas neurais registados para estimulação naturalista são elevadas (100 - 1000), e nas preparações mais estáveis ​​com muito baixo ruído de gravação pode atingir valores &gt;&gt; 1000 (por exemplo, Figura 8C.). Observe também que o aquecimento expande as células &quot;largura de banda de confiança sinalização 4 (SNR &#39;brilhante ≥ 1); por exemplo, a diferença relativa entre os dois R1-R6s nas Figuras 8 e 9, respectivamente, é de 10 Hz (84 a 20 o C e 94 Hz a 25 o C). Pode-se estimar a taxa de mais de cada célula de transferência de informação a partir da sua relação sinal-ruído através da utilização da equação de Shannon 32, ou através do cálculo da diferença entre as taxas de entropia entropia e de ruído das respostas através do método de extrapolação triplo 39. Mais detalhes sobre as informações de análises teóricas, e seu uso e limitaçõess especificamente com este método são apresentados nas publicações anteriores 7,8,39. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> Figura 10. Respostas tensão de uma mosca assassina R1-R6 fotorreceptores e LMC à Estimulação naturalista repetida a 19 o C. (A) R1-R6 (cinza) e LMC (preto) envia registado pela mesma microeletrodos da mesma mosca; primeira pós-sinapticamente e, posteriormente, pré-sináptico, como eletrodo foi avançado no olho. (B) 20 pré consecutiva (acima) e pós-sinápticos (abaixo) as respostas (traços cinza claro) para o mesmo padrão de estímulo naturalista foram capturados após a adaptação inicial (caixa pontilhada em A). Seus meios são os sinais (os traços mais escuros no topo), enquanto as suas respectivas diferenças para as respostas individuais dão o barulho. (C) O correspondente SignaRácios l-a-ruído (SNR) foram calculados como nas Figuras 8C e 9C. Saída LMC tem cerca de uma faixa de 100 Hz mais amplo de sinalização confiável (SNR &#39;LMC MAX ≥1, até 234 Hz) do que a produção R1-R6 (SNR&#39; R MAX ≥1, até 134 Hz). Ambos os rácios de sinal-para-ruído são elevados (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), e como o mesmo microeletrodos foi utilizado nas gravações, suas diferenças refletem diferenças reais nas saídas pré e pós-sinápticos neurais. Estes resultados implicam que o sistema de gravação tinha baixo nível de ruído, e sua influência sobre as análises foi marginal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Estudos Visão neuroetológica </p&gt; O método também pode ser utilizado para registar as respostas pré- e pós-sinápticos de tensão dos olhos compostos de diferentes espécies de insectos 7,8,35,36 (Figura 10), que permite estudos comparativos neuroetológica de processamento de informações visuais. Para o sistema de gravação apresentada, a única adaptação necessária é de preparação titulares novos, cada um com uma abertura de dimensões adequadas para as espécies estudadas. Estas gravações exemplares são provenientes de um assassino fêmea de mosca (Coenosia attenuata). Eles mostram respostas intracelulares de tensão de um fotorreceptor R1-R6 e LMC à estimulação repetitiva de luz idêntica, tal como se utiliza para os homólogos de Drosophila na Figura 9, mas a 19 o C. Neste caso, tanto o pré- e pós-sinápticos, os dados foram registados a partir do mesmo mosca; uma após a outra, com o mesmo eléctrodo de registo (cheia com 3 M KCl) primeiro avançando através da lâmina lateral, antes de entrarção da retina frontal. Em comparação com os dados de Drosophila a 25 ° C, os dados Coenosia - até à temperatura de refrigerador - mostra as respostas com dinâmica mais rápidos; expandir a gama de sinalização fiável (relação sinal-ruído &gt;&gt; 1) ao longo de uma gama de frequência mais ampla. Essas adaptações funcionais na codificação neural de estímulos naturalistas são consistentes com estilo de vida predatório &#39;s Coenosia 36, que exigem alta precisão informações espaço-temporal para alcançar rápidos comportamentos caça aérea.

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

O objetivo geral deste procedimento é registrar as respostas elétricas intracelulares dos fotorreceptores de Drosophila e interneurônios visuais a estímulos luminosos controlados. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurocodificação, como como um estímulo luminoso irá codificá-lo em uma de suas respostas, ou como suas informações visuais e fotorreceptores e interneurônios extraem estímulos luminosos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece gravações duradouras e de alta qualidade do estudo, com poucos danos ao meio intracelular e à amostragem de informações.A característica de demonstração que isso pode afetar é crítica, pois suas várias etapas são difíceis de aprender a executar corretamente sem vê-las. Puxe um microeletrodo de referência de borossilicato filamentado ou de tubo de vidro de quartzo usando um extrator de pipeta padrão. Tente obter uma redução curta e gradual.As configurações exatas variam entre os instrumentos. O tamanho do poro na ponta não é crucial porque será quebrado para os experimentos. Em seguida, puxe um eletrodo de gravação do mesmo tubo de vidro e tente obter uma conicidade gradual fina de 10 a 15 milímetros de comprimento.Em um microscópio de luz, monte o eletrodo em um lado de vidro com adesivo múltiplo e use uma objetiva de ar 40x para inspecionar sua ponta. Um bom eletrodo afunila suavemente para uma ponta invisivelmente pequena, em torno da qual padrões de interferência paralelos contínuos mais escuros e mais claros podem ser vistos. Pouco antes do experimento, preencha o eletrodo de referência com anéis de mosca, usando uma seringa de cinco mililitros conectada a um filtro de partículas, com uma ponta de plástico fina.Para experimentos com fotorreceptores, carregue o eletrodo de registro com cloreto de potássio 3 molar até que uma gotícula se forme em sua extremidade maior. Isso minimizará o ruído da junção do líquido durante a gravação. Para trabalhar com LMCs histaminérgicos, encha os eletrodos de registro com acetato de potássio 3 molar, cloreto de potássio 0,5 milimolar para minimizar o efeito na bateria de cloreto da célula.Comece carregando um frasco de mosca fresca com moscas de cinco a 10 dias. As moscas mais jovens são mais frágeis, mas podem ser registradas. Selecione a primeira mosca para eletrofisiologia.Fêmeas grandes são mais fáceis de trabalhar. Quando estiver no tubo de captura, aproveite sua tendência inerente de subir na ponta da pipeta e tampe a ponta menor. Em seguida, conecte uma seringa de 100 mililitros com uma mangueira de plástico flexível à ponta da pipeta, que é ampliada apenas para deixar uma Drosophila passar e conecte a outra extremidade a uma ponta de pipeta grande presa ao porta-moscas.Em seguida, esprema um pequeno volume de ar da seringa para ejetar a mosca no porta-moscas. Olhe através do estereomicroscópio e administre suavemente mais ar até que a cabeça da mosca esteja saliente da extremidade cônica do porta-moscas. Certifique-se de que a mosca esteja firmemente presa pelo tórax.Em seguida, prenda a mosca com cera de abelha. Use a temperatura mais baixa do aquecedor de cera para derreter a cera de forma limpa, que parecerá transparente. Se estiver muito quente, a cera queimará.Imobilize a cabeça da mosca aplicando um pouco de cera de abelha na tromba e no canto do olho direito, evitando a córnea. Fixe esses dois pontos no porta-moscas. Conclua esta etapa rapidamente para evitar queimar a mosca.Em seguida, coloque óculos de proteção e fabrique uma microfaca. Prenda uma lâmina de barbear de aço não inoxidável com dois suportes de lâmina planos e quebre uma pequena tira de sua borda afiada. Idealmente, produza uma borda afiada que se assemelhe a uma torre.Agora, com cuidado e grande atenção aos detalhes, use a microfaca para abrir alguns omatídeos do olho esquerdo da mosca, como quatro a cinco omatídeos da cutícula dorsal logo acima do equador do olho. Isso fornecerá a passagem para o microeletrodo de gravação. Isso é bastante desafiador, requer uma faca bem feita e deve ser aprendido com a prática.Em seguida, remova suavemente o pequeno pedaço de córnea da abertura, expondo a retina por baixo. Agora, usando o cabelo fino do aplicador de vaselina, cubra rapidamente o buraco com uma pequena gota de vaselina. A geléia tem o benefício adicional de reduzir a capacitância intramural da pipeta.Evite manchar os olhos, pois isso desfoca a ótica. Ao operar o microeletrodo ampmais vivo, sempre seja aterrado tocando na superfície metálica da gaiola de Faraday ou mesa antivibração para evitar cargas estáticas. Prenda a mosca montada ao poste da plataforma de preparação da mosca.Gire o porta-moscas de modo que o olho esquerdo da mosca fique voltado diretamente para o investigador. Em seguida, use um micromanipulador de curso pequeno para inserir o eletrodo de referência rombo suavemente através dos ocelos da mosca na cápsula da cabeça. Certifique-se de que a mosca ainda pareça saudável e mova suas antenas.A preparação deve ser excelente para merecer registro. Agora dirija o microeletrodo de gravação afiado no olho esquerdo através da abertura revestida de gelatina. Ao entrar no tecido, a localização da ponta do eletrodo deve ser aparente por seu padrão de refletância.A ponta frágil do eletrodo deve ser guiada perfeitamente ou quebrará, o que é muito desafiador. Dependendo do tipo de célula que está sendo registrada, a cabeça da mosca deve ser orientada de forma ligeiramente diferente. Com os eletrodos no lugar, ligue o microeletrodo amplificador.Em seguida, desligue a fonte de luz fria, desconecte-a da rede elétrica e conecte-a ao aterramento central para minimizar o ruído elétrico induzido pelo loop de aterramento. Em seguida, ajuste as guias de luz gooseneck para que o sistema de braço Carden possa ser movido livremente ao redor da mosca. Em seguida, desligue as luzes da sala para colocar a preparação da mosca em relativa escuridão.Agora meça a resistência do eletrodo de gravação no olho. Deve estar entre 100 e 260 megaohms. Às vezes, a ponta é bloqueada e pode ser limpa usando as funções de zumbido capacitivo e pulso de corrente do amplificador.Se isso não ajudar, use um novo eletrodo. Em seguida, defina o amplificador para corrente clamp ou ponte e zere a tensão entre os eletrodos. Depois que a mosca estiver adaptada ao escuro por alguns minutos, insira a ponta do eletrodo de gravação no olho em etapas de 0.1 a um mícron usando um passo piezoelétrico ou usando uma rotação suave do botão de resolução fina.Em cada etapa, estimule o olho com um flash de luz de um a 10 milissegundos. Cada flash de luz causará uma breve queda na tensão ou no ERG. Quando a ponta do eletrodo entra na lâmina, fechando nos LMCs, o ERG se inverte.Em seguida, prossiga com as medições. Devido à não invasividade, o desempenho do sinal de células individuais pode ser estudado em seu estado quase natural. A resposta de voltagem de um fotorreceptor R1-R6 à luz fraca e brilhante foi medida a 20 graus Celsius.Em seguida, um fotorreceptor R1-R6 foi comparado com um LMC a 25 graus Celsius. Cada um foi medido em uma mosca diferente, pois as gravações intracelulares por dois microeletrodos afiados na mesma mosca são muito difíceis de serem viáveis. A repetibilidade das respostas torna-se óbvia quando os dados são sobrepostos.As relações sinal-ruído no domínio da frequência foram obtidas por quatro anos, transformando os blocos de dados de sinal e ruído em espectro de potência e, em seguida, dividindo o espectro médio de potência do sinal pelo espectro médio de potência de ruído correspondente. O resultado pode ser extremamente sensível aos sinais nas melhores preparações. A técnica pode ser usada para registrar muitas espécies.As moscas da cenócia receberam a mesma estimulação de luz naturalista e repetitiva a 19 graus Celsius. Os dados foram obtidos pré e pós-sinapticamente da mesma mosca, avançando o eletrodo de registro. A dinâmica mais rápida do registro é consistente com a natureza predatória desta espécie.Uma vez dominada, essa técnica permite gravações sempre longas e de alta qualidade, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante perceber, quero dizer, é como aprender a tocar piano. Quanto mais você praticar, melhores resultados obterá.Após esse procedimento, outros métodos, como intervenções farmacológicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o papel dos neuromoduladores na formação das respostas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiofísica explorarem como otimizar a informação, captura e transferência de luz, além das reações bioquímicas cáusticas na maquinaria de fototransdução e nas seguintes ciências biológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar a Drosophila para experimentos intracelulares e como despertar as respostas neurológicas de seus fotorreceptores e interneurônios.

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Research

JoVE Journal

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Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão Drosophila Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão

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