Name: Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a quantificar açúcares em bebidas usando um analisador portátil FRET com biosensores fluorescentes. Este método oferece alta sensibilidade e praticidade para pesquisas em ciência de alimentos.

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Esta pesquisa foi apoiada por doações do Centro de Biologia Sintética Inteligente de Projeto de fronteira global (2011-0031944) e do Programa de Iniciativa KRIBB Research.

1. Preparação de Biosensor <ol><li> Construir o plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6, seguindo o protocolo estabelecido anteriormente-2. </li><li> Inocular 5 ml de caldo Luria (LB) com uma única colónia de uma estirpe de Escherichia coli DE3 e incubar a 37 ° C durante 16 horas com agitação. </li><li> Transferir 1 ml da cultura D / N para um balão de 500 ml contendo 100 ml de LB e incubar a 37 ° C num incubador com agitação, até a densidade óptica a 600 nm (DO 600) atingir de 0,5 (cerca de 3 h). </li><li> Colher as células num tubo cónico de 50 ml por centrifugação a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento rapidamente em cada tubo com 50 ml de água gelada destilada (DW) e centrifugar a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50 ul de DW gelada com 10% (v / v) de glicerol por agitação suave até que a solução (células electrocompetentes) atinge uma DO600 </sub&gt; de 100. </li><li> Coloque a mistura de células electrocompetentes (50 ul de células a um OD 600 de 100) e 10 ng do plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6 num electroporação cuvete arrefecida com gelo em um dispositivo de electroporação e electroporar a mistura (18 kV / cm, 25 uF). </li><li> Rapidamente adicionar 1 ml de meio SOC para a cuvete e ressuspender as células suavemente, seguindo-se a recuperação a 37 ° C durante 1 h com agitação suave, em um tubo de 15 ml de fundo redondo. </li><li> Espalhe as células em uma placa de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar a 37 ° C durante 12 h. </li><li> Isolar uma única colónia utilizando uma ansa e inocular a colónia em 10 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C num agitador durante 12 h. </li><li> Adicionam-se 5 ml da cultura de sementeira para 500 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar a cultura num incubador com agitação a 37 ° C. </li><li> Adicionar 0,5 mM de isopropil-d β-tiogalactósido (IPTG), quando a DO600 atinge0,5 e incuba-se a cultura numa incubadora com agitação a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Centrifugar as células a 4500 × g durante 20 minutos (4 ° C) e suavemente remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de ligação (Tris-HCl a 20, pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 0,5 mM e DTT 1 mM). </li><li> Sonicate as células no gelo com seis rajadas de 10 seg a 200-300 W, seguindo cada rajada com 10 segundos de resfriamento. </li><li> Centrifuga-se o lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante (proteína solúvel) em um novo tubo de recolha. </li><li> Para conseguir a purificação por afinidade das proteínas do sensor de FRET, carga de 4 ml do lisado celular foi afastada numa coluna de afinidade de Ni-NTA (volume de 5 ml) e realizar um ensaio de cromatograf ia usando cromatograf ia líquida rápida de proteína (FPLC) 18. </li><li> Lava-se a coluna uma vez com cinco volumes de coluna de tampão de lavagem I (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0). </li><li> Repetir o passo de lavagem com cinco volumes de coluna de tampão de lavagem II (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazole 20 mM, pH 7,0). </li><li> Eluir a proteína sensor com cinco volumes de coluna de tampão de eluição (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,0). </li><li> Para concentrar e dessalinizar a amostra eluída, encher concentrador (tamanho da membrana de 10.000 MW) com um máximo de 20 ml de amostra e centrifuga-se durante 10 min a 3000 x g. Recarga concentrador com solução salina a 0,8% tamponada com fosfato (PBS). Repetir este passo duas vezes, em primeiro lugar enchendo o concentrador com 20 ml de amostra, e, em seguida, reenchimento com PBS. </li><li> Recuperar a proteína sensor de concentrado e salgado-de e armazená-lo a -80 ° C. </li></ol> 2. Medição de conteúdo de açúcar usando o Analisador de FRET NOTA: Os detalhes da construção FRET analisador foram descritos no nosso trabalho anterior 7. <ol><li> Prepara-se uma solução de detecção de 0,8% de PBS contendo 0,2uM das proteínas do sensor. </li><li> Ligue o analisador de FRET. Pressione o botão &quot;UP&quot; durante 2 segundos para calibrar a temperatura ideal. Ajuste a temperatura para 53 ° C usando as &quot;Up&quot; e botões &quot;DOWN&quot; e pressione o botão &quot;SET&quot;. </li><li> Para a calibração, pressione e segure o &quot;UP&quot; e os botões &quot;DOWN&quot; simultaneamente por 2 segundos. Confirmar que o painel LED exibe &quot;CALIB&quot; e pressione o botão &quot;SET&quot;. </li><li> Coloque um 12,5 × 12,5 × 45 mm (comprimento x largura x altura) navio paralelepípedo rectangular (tina) contendo apenas tampão PBS em um suporte de cuvete do analisador e pressione o botão &quot;SET&quot;. </li><li> Substitua a tina com um contendo apenas a solução de detecção (ver 2.1), sem açúcar (maltose / sucrose) e pressione o botão &quot;SET&quot; para calibrar a linha de base. </li><li> Substitua a tina com um contendo a solução de detecção com açúcar 10 mM e pressione o botão &quot;SET&quot;botão. </li><li> Para determinar o conteúdo de açúcar de uma amostra de bebida, colocar uma amostra de bebida ml num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 16000 x g durante 1 min. NOTA: A medição de fluorescência baseado em sensor de FRET tem a vantagem de não exigir pré-tratamento especial da amostra, porque apenas 1% (v / v) da amostra está incluído no volume total. No entanto, recomendamos a remoção de qualquer material que possa afetar a medição de fluorescência (por exemplo, células, partículas insolúveis, lipídios, gordura, ou qualquer material com autofluorescência). Além disso, se um ácido forte, base forte, agente de limpeza (detergente), ou um agente emulsionante (emulsionante) está presente a uma concentração mais elevada e pode afectar as propriedades do sensor biológico FRET, ela deve ser removida usando um solvente orgânico ou numa neutralizador. Por exemplo, quando a gordura do leite e os emulsionantes são eliminados lanches congeladas, as amostras são centrifugadas num tubo de microcentrifuga a 16000 × g durante 30 min, e o líquido entrn o sedimento de fundo e a camada superior de gordura do leite é extraído. Uma quantidade igual de hexano, em seguida, é adicionado, seguido por centrifugação a 15.000 x g durante 30 min para eliminar os lípidos. </li><li> Remover o sobrenadante com uma seringa de 1-ml e filtrar através de um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,2 um). </li><li> Colocar 0,1 mL da amostra filtrada bebida num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,9 ml de PBS e agitar com vortex suavemente. NOTA: É crítico para diluir a amostra de bebida adequada. Neste caso, a diluição de 1000 vezes foi executada de modo a que a concentração de açúcar cairia dentro da gama dinâmica do dispositivo. Recomendamos estimar a concentração de açúcar meta antecipadamente, referindo-se o teor de açúcar no rótulo da bebida. </li><li> Adicionam-se 5 ul da amostra de bebida diluída (1%, v / v) a uma cuvete contendo 0,495 ml da solução de detecção. </li><li> Coloque a cuvete num suporte da cuveta de o analisador de FRET e pré-aquecer a solução de amostra a 53 ° C. </li><li> Pressione o botão &quot;SET&quot; para medir o teor de açúcar. Nota É possível avaliar a medição de FRET utilizando um leitor de placas multilabel ou um espectrofotómetro de fluorescência equipado com um dispositivo de Peltier para controle de temperatura através da leitura da relação de 488/535 nm de 7,8. Para a detecção de sacarose, siga os passos 1,1-2,12 com um sensor de CSY-LH 2. </li></ol>

<ol><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li>
<li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li>
<li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li>
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<li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li>
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<li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li>
<li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years%3A+The+Generation+R+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+food%2C+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children%27s+dietary+energy+density%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li>
<li>Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este protocolo permite a quantificação rápida e eficiente do teor de açúcar em amostras de bebidas, utilizando um feito por medida de FRET analisador de 7 a uma temperatura óptima para sensores de FRET. O analisador foi projetado com um recém-desenvolvido, barato banda de 405 nm de ultravioleta do LED como fonte de luz e dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Este dispositivo é mais rentável do que outras fluorímetros comparáveis. O dispositivo mostrou alta sensibilidade de detecção, especialmente q...

Förster transferência de energia de ressonância (FRET) tem sido amplamente utilizado como um sensor biométrico para detectar pequenas moléculas tais como os açúcares, os iões de cálcio, e os aminoácidos 1-4. biossensores FRET contêm proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes ciano (CFP) e proteínas fluorescentes amarelas (YFPs), que estão fundidos a ambas as extremidades de proteínas de ligação a periplásmicas (PBPs). Açúcares se ligar a PBP situadas no meio do sensor de FRET, causando alterações estruturais do sensor que, posteriormente, alterar a orientação e a distância transição dipolo das duas proteínas fluorescentes em cada extremidade da PLP. Esta alteração permite uma análise quantitativa do teor de açúcar através da medição da razão entre os comprimentos de onda de emissão de EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). Devido à alta sensibilidade, especificidade, capacidade de monitoramento em tempo real e tempo de resposta rápido de biossensores preocupe, esses sensores são amplamente utilizados em aplicações ambientais, industriais e médicos 5. Além disso, Raciommedição etric utilizando biossensores FRET tem benefícios práticos importantes, uma vez que pode ser utilizada para medir componentes em amostras biológicas complexas, em que a concentração do sensor não pode ser facilmente controlada e a fluorescência de fundo está sempre presente. Apesar destas vantagens dos sensores baseados em FRET para visualização quantitativa, pequenas mudanças estruturais com domínio incompleta movimento de transferência para as proteínas fluorescentes produzem inerentemente fraca intensidade do sinal. Este sinal fraco limita a aplicação de sensores baseados em FRET para in vitro ou in vivo na análise 6. Consequentemente, a maioria FRET biossensores exigir a utilização de equipamento dispendioso e altamente sensível. Anteriormente, foi desenvolvido um analisador de FRET barato e portátil, com capacidades semelhantes às dos analisadores de fluorescência 7 existentes. Neste dispositivo, de baixo custo 405 nm ultravioleta banda-díodo emissor de luz (LED), foi usada como fonte de luz para excitação de causar thsinal de fluorescência e, a substituição de uma lâmpada ou laser caro. O sistema de detecção do analisador concentra-se eficientemente a dissipação de sinal de fluorescência em dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Num estudo mais recente, que mostrou que a optimização da temperatura de detecção, a 50 - 55 ° C poderia aumentar significativamente o sinal FRET raciométrica 8. Este aumento do sinal específico da temperatura, juntamente com o analisador de FRET feito por medida, permite o uso de sensores de FRET em aplicações de diagnóstico mais gerais com sensibilidade elevada e rápida. Neste protocolo, demonstramos a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais de temperatura FRET por meio da quantificação do teor de açúcar das bebidas disponíveis comercialmente. Este protocolo fornece os detalhes do funcionamento do dispositivo de FRET, bem como uma breve descrição do sensor e a preparação da amostra. Prevemos que este relatório irá promover a aplicação potencial do portátilanalisador em ambientes de laboratório de pequena escala e fornecer uma base para o desenvolvimento de um dispositivo de baixo custo no local de diagnóstico com biosensores baseados em FRET.

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>BD</td> <td># 244620</td><td></td></tr><tr><td>isopropil &beta; -D-tiogalactosídeo (IPTG)</td> <td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tri-HCl</td><td>Bioneer</td><td>C-9006-1</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioneer</td><td>C-9007</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Junsei</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>2% triptona, 0,5% Extrato de levedura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM</td></tr><tr><td>Glucose Resource Q</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1177-01</td><td>6 &vezes; coluna de cromatografia de troca aniônica de 30 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>HisTrap HP1</td><td>Amersham Biosciences</td><td>29-0510-21</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo</td><td>Sigma</td><td>Z802875</td><td></td></tr><tr><td>AK&Auml; KTAFPLC</td><td>Amersham Biosciences</td><td>18-1900-26</td><td>uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC)</td></tr><tr><td>Cary Eclipse</td><td>VarianInc</td><td></td><td>um espectrofotômetro de fluorescência</td></tr><tr><td>VICTOR&nbsp; &nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td>um leitor de placas multietiquetas</td></tr><tr><td>E. coli JM109 (DE3)</td><td>Promega</td><td></td><td>Células eletrocompetentes</td></tr><tr><td>A (Bebida)</td><td>Korea Yakult Co. (Coreia)</td><td>Birak</td><td>Bebidas fermentadas</td></tr><tr><td>B (Bebida)</td><td>Lotte Foods (Coreia)</td><td>Epro</td><td>Soft drink</td></tr><tr><td>C (Bebida)</td><td>Lotte Foods (Coreia)</td><td>Getoray</td><td>Sports drink</td></tr></tbody></table>

altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil fret analyzer

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

As recentes melhorias no Förster transferência de energia de ressonância (FRET) sensores permitiram a sua utilização para detectar várias moléculas pequenas, incluindo íons e aminoácidos. No entanto, a fraca intensidade do sinal dos sensores de FRET inato é um grande desafio que impede a sua aplicação em vários campos e torna o uso de caro, de ponta fluorómetros necessário. Anteriormente, nós construímos, um analisador de FRET relação custo-benefício de alto desempenho que podem especificamente medir a razão de duas bandas de comprimento de onda de emissão (530 e 480 nm) para alcançar alta sensibilidade de detecção. Mais recentemente, descobriu-se que os sensores traste com proteínas de ligação periplasmática bacteriana detectar ligandos com a máxima sensibilidade na gama da temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este relatório descreve um protocolo para avaliar teor de açúcar em amostras de bebidas disponíveis comercialmente usando o nosso analisador FRET portátil com um sensor de FRET específicas de temperatura. Os nossos resultados mostraram que o pré-aquecimento adicionaldo processo do sensor de FRET aumenta significativamente a relação sinal de FRET, para permitir uma medição mais precisa do teor de açúcar. O analisador e o sensor de FRET feito por encomenda foram aplicadas com sucesso para quantificar o teor de açúcar, em três tipos de bebidas comerciais. Prevemos que reforçar ainda mais a redução de tamanho e desempenho do equipamento vai facilitar o uso de analisadores portáteis em ambientes onde o equipamento high-end não está disponível.

Para realizar a análise quantitativa do conteúdo de açúcar usando o analisador de FRET, que é necessário para construir uma curva ajustada a estimativa da concentração de açúcares alvo a partir da razão observada FRET. Seja r definir a razão entre a intensidade de emissão de PCP a 480 nm e a intensidade de emissão de YFP gerado a 530 nm (Eq. 1). <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54144/54144equation1.jpg" /></...

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais, quantificando o teor de açúcar em bebidas comercialmente disponíveis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de detecção e monitoramento de moléculas pequenas, como o açúcar. A principal vantagem desta técnica é que ela pode monitorar de forma eficiente um sinal fresco em resposta às moléculas pequenas, sem a necessidade de fluorímetros caros e de alta precisão.O procedimento será demonstrado pelo Dr. Han do nosso laboratório. Primeiro, prepare o plasmídeo do biossensor fluorescente específico para maltose ou sacarose ciano e amarelo. Em seguida, inocular cinco mililitros de caldo Luria com uma única colônia de E. coli DE3 e incubar o cultivo a 37 graus Celsius em um incubador com agitação durante 16 horas.Em seguida, coloque um mililitro da cultura em um frasco contendo 100 mililitros de LB. Incube o frasco a 37 graus Celsius em um incubador agitado até que a densidade óptica em 600 nanômetros seja cerca de 0,5. Centrifugue a cultura por 20 minutos a quatro graus Celsius. Reuspenda rapidamente o pellet em 50 mililitros de água destilada gelada e

highly-sensitive-rapid-fluorescence-detection-with-portable-fret

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

A transferência de célula para célula de agregados proteicos, ou sementes proteopáticas, pode estar subjacente à progressão da patologia em doenças neurodegenerativas. Aqui, é descrito um novo ensaio de citometria de fluxo FRET que permite a detecção específica e sensível da atividade de semeadura de amostras recombinantes ou biológicas.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

A detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotículas normalmente envolve sistemas de detecção baseados em microscópio de epifluorescência volumosos e complexos. Aqui descrevemos um esquema de detecção multicolorido compacto e modular que utiliza uma matriz de fibras ópticas para codificar temporariamente dados multicoloridos coletados por um único fotodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Um sensor de espalhamento de luz angular fototérmica (PT-AS) permite o ensaio de hemoglobina rápido e livre de produtos químicos de amostras de sangue em escala de nanolitros. Aqui, são fornecidos detalhes da configuração do PT-AS e um protocolo de medição da concentração de hemoglobina no sangue. Resultados representativos para amostras de sangue anêmico também são apresentados.

A rápida e sem produtos químicos dosagem de hemoglobina com Photothermal angular de espalhamento de luz

Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

Os protocolos de ensaio baseados em células de ressonância Förster são descritos para a quantificação simples, específica, sensível e robusta do transdutor de sinal endogenso e ativador de transcrição (STAT) 1/3/4/5/6 em lises celulares em um formato de 384 poços.

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

Este artigo apresenta um método para análise espiostemporal de sondas móveis, de uma molécula, baseadas em Förster, utilizando microscopia de fluorescência widefield. O kit de ferramentas de software recém-desenvolvido permite a determinação de traços de tempo smFRET de sondas móveis, incluindo a eficiência correta do FRET e as posições moleculares, em função do tempo.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Este protocolo descreve um método exclusivo para detectar a ligação entre compostos e moléculas de proteína, oferecendo as vantagens de perda mínima de amostra de proteína e alta precisão de dados.

Detecção da interação proteína-umbeliferona CD40 por fluorescência de varredura diferencial

Este trabalho discutiu o protocolo para projetar e desenvolver um dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As e F em amostras ambientais, amostras biológicas e alimentos e bebidas. Quase 2000 amostras foram testadas e os resultados estão de acordo com a técnica padrão-ouro.

Técnica avançada de detecção E-Eye guiada por TD-DFT para quantificação no local de Fe, Cr, F e As em amostras ambientais, biológicas e de alimentos

Aprenda a quantificar açúcares em bebidas usando um analisador portátil FRET com biosensores fluorescentes. Este método oferece alta sensibilidade e praticidade para pesquisas em ciência de alimentos.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

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