Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais, quantificando o teor de açúcar das bebidas disponíveis comercialmente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de detecção e monitoramento de pequenas moléculas, como o açúcar. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode monitorar com eficiência um novo sinal respondendo às pequenas moléculas sem fluorômetros caros e sofisticados.

Demonstrando o procedimento estará o Dr.Han do nosso laboratório. Primeiro, prepare o plasmídeo biossensor fluorescente ciano e amarelo específico para maltose ou sacarose. Em seguida, inocule cinco mililitros de caldo Luria com uma única colônia de DE3 E.Coli e incube a cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada por 16 horas.

Em seguida, coloque um mililitro da cultura em um frasco contendo 100 mililitros de LB. Incubar o frasco a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada até que a densidade óptica a 600 nanômetros seja de cerca de 0,5. Centrifugue a cultura por 20 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda rapidamente o pellet em 50 mililitros de água destilada gelada e centrifugue por 20 minutos novamente.

Ressuspenda o pellet em 50 microlitros de uma solução de 10 por cento de glicerol e água destilada gelada. Agite suavemente a mistura até que a densidade óptica de 600 nanômetros atinja 100. Em uma cubeta de eletroporação gelada, combine a mistura com 10 nanogramas de plasmídeo CMY.

Eletroporar a mistura. Na cubeta, ressuspenda as células em um mililitro de meio SOC e, em seguida, transfira-as para um tubo de fundo redondo de 15 mililitros. Recupere as células agitando suavemente a 37 graus por uma hora.

Espalhe as células em uma placa de ágar LB com 100 microgramas por um mililitro de ampicilina. Incube as células a 37 graus por 12 horas. Usando um laço, transfira uma única colônia para 10 mililitros de LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

Incube a mistura a 37 graus agitando por 12 horas para criar a cultura de sementes. Transfira cinco mililitros da cultura de sementes para 500 mililitros de LB com ampicilina e incube as células a 37 graus em uma incubadora agitada. Quando a densidade óptica a 600 nanômetros atingir 0,5, adicione IPTG para fazer uma concentração final de 0,5 milimolar.

Depois de incubar a cultura por 24 horas, centrifugue as células por 20 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de ligação. Sonicar as células no gelo por 10 segundos e, em seguida, resfriá-las por 10 segundos.

Repita a sonicação e o resfriamento mais cinco vezes. Centrifugue o lisado durante 30 minutos. Transfira o sobrenadante para outro tubo de coleta.

Purifique o sobrenadante em uma coluna de afinidade NTA de níquel. Encher um concentrador de 10 000 miliwatts com 20 mililitros da amostra purificada. Centrifugue a amostra por 10 minutos e, em seguida, reabasteça o concentrador com solução salina tamponada com fosfato a 0,8%.

Repita esse processo com o restante da amostra dessa maneira, 20 mililitros de cada vez, até que toda a proteína esteja concentrada e dessalinizada. Armazene o biossensor FRET purificado a 80 graus Celsius. Prepare uma solução micromolar de 0,2 de proteína biossensor CMY e 0,8% PBS como solução de detecção.

Ligue um analisador FRET portátil. Defina a temperatura de análise para 53 graus Celsius. Em seguida, defina o instrumento para o modo de calibração.

Encha uma cubeta com 0,8% PBS como fundo. Pré-aqueça a amostra a 53 graus Celsius no analisador e, em seguida, defina o plano de fundo. Em seguida, encha uma cubeta com solução de detecção.

Coloque a cubeta no analisador e defina a linha de base. Substituir a cubeta por uma solução de detecção e um açúcar milimolar. Defina a intensidade na saturação para terminar a calibração.

Para começar a preparar uma amostra de bebida para análise do teor de açúcar, usando um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, centrifugue um mililitro da bebida. Remova o sobrenadante com uma seringa de um mililitro e filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro. Combine 0,1 mililitros de filtrado e 0,9 mililitros de 0,8% PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Agite suavemente a mistura para garantir a diluição completa. Coloque cinco microlitros da amostra de bebida diluída e 495 microlitros de solução de detecção em uma cubeta. Coloque a cubeta no analisador e pré-aqueça a amostra a 53 graus Celsius.

Pressione o botão set para medir o teor de açúcar da amostra. Neste método, a eficiência do FRET é medida pela razão entre a intensidade de emissão da proteína fluorescente amarela e a proteína fluorescente ciano no biossensor. A temperatura ideal de medição para esses biossensores CMY está entre 50 e 55 graus Celsius, pois a diferença na taxa de intensidade de emissão entre uma solução de controle e uma solução saturada de maltose é maior.

O biossensor CMY-BII foi usado para avaliar o teor de maltose de três bebidas a 53 graus. Uma curva de resposta à dose é gerada a partir da obtenção dessa proporção em várias concentrações de maltose a uma determinada temperatura. A razão de emissão está relacionada à concentração de maltose usando os valores obtidos durante a calibração.

Os teores de maltose medidos são mostrados com os teores totais de açúcar relatados pelos fabricantes de bebidas. A bebida A continha fontes de maltose, como arroz e cevada. Da mesma forma, a quantidade observada de maltose representa cerca de metade do teor total de açúcar relatado.

A bebida C, uma bebida esportiva, tinha um teor de maltose muito baixo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de operar o dispositivo e os sensores FRET entre 50 e 55 graus Celsius. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar moléculas tão pequenas com um analisador de FRET portátil feito sob medida.