Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais, quantificando o teor de açúcar em bebidas comercialmente disponíveis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de detecção e monitoramento de moléculas pequenas, como o açúcar. A principal vantagem desta técnica é que ela pode monitorar de forma eficiente um sinal fresco em resposta às moléculas pequenas, sem a necessidade de fluorímetros caros e de alta precisão.

O procedimento será demonstrado pelo Dr. Han do nosso laboratório. Primeiro, prepare o plasmídeo do biossensor fluorescente específico para maltose ou sacarose ciano e amarelo. Em seguida, inocular cinco mililitros de caldo Luria com uma única colônia de E. coli DE3 e incubar o cultivo a 37 graus Celsius em um incubador com agitação durante 16 horas.

Em seguida, coloque um mililitro da cultura em um frasco contendo 100 mililitros de LB. Incube o frasco a 37 graus Celsius em um incubador agitado até que a densidade óptica em 600 nanômetros seja cerca de 0,5. Centrifugue a cultura por 20 minutos a quatro graus Celsius. Reuspenda rapidamente o pellet em 50 mililitros de água destilada gelada e centrifugue novamente por 20 minutos.

Resuspenda o pellet em 50 microlitros de uma solução a 10 por cento em volume de glicerol e água destilada gelada. Agite suavemente a mistura até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja 100. Em uma cubeta de eletroporação gelada, combine a mistura com 10 nanogramas do plasmídeo CMY.

Eletropore o conjunto. No cubeta, ressuspenda as células em um mililitro de meio SOC e, em seguida, transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Incube as células sob agitação suave a 37 graus por uma hora.

Espalhe as células em uma placa de ágar LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as células a 37 graus por 12 horas. Usando um alça, transfira uma única colônia para 10 mililitros de LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

Incube a mistura a 37 graus sob agitação por 12 horas para criar o cultivo semente. Transfira cinco mililitros do cultivo semente para 500 mililitros de LB com ampicilina e incube as células a 37 graus em um incubador com agitação. Quando a densidade óptica a 600 nanômetros atingir 0,5, adicione IPTG para obter uma concentração final de 0,5 milimolar.

Após incubar a cultura por 24 horas, centrifugue as células por 20 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de ligação. Sonique as células em gelo por 10 segundos e, em seguida, resfrie as células por 10 segundos.

Repita a sonicação e o resfriamento mais cinco vezes. Centrifugue o lisado por 30 minutos. Transfira o sobrenadante para outro tubo de coleta.

Depure o sobrenatante em uma coluna de afinidade com níquel NTA. Encha um concentrador de 10.000 miliwatts com 20 mililitros da amostra purificada. Centrifugue a amostra por 10 minutos e, em seguida, reabasteça o concentrador com solução salina tamponada com fosfato a 0,8%.

Repita este processo com o restante da amostra desta maneira, 20 mililitros de cada vez, até que toda a proteína tenha sido concentrada e dessalificada. Armazene o biossensor FRET purificado a 80 graus Celsius. Prepare uma solução de 0,2 micromolar da proteína do biossensor CMY e 0,8% PBS como solução de detecção.

Ligue um analisador portátil de FRET. Defina a temperatura de análise para 53 graus Celsius. Em seguida, configure o instrumento no modo de calibração.

Encha uma cubeta com PBS 0,8% como fundo. Pré-aqueça a amostra a 53 graus Celsius no analisador e, em seguida, configure o fundo. Em seguida, encha uma cubeta com a solução de detecção.

Coloque a cubeta no analisador e defina a linha de base. Substitua a cubeta por outra contendo a solução de detecção e açúcar a um milimolar. Ajuste a intensidade no ponto de saturação para concluir a calibração.

Para iniciar o preparo de uma amostra de bebida para análise do teor de açúcar, utilizando um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, centrifugue um mililitro da bebida. Remova o sobrenadante com uma seringa de um mililitro e filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro. Combine 0,1 mililitro de filtrado e 0,9 mililitro de PBS a 0,8% em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Vortexe suavemente a mistura para garantir a diluição completa. Coloque cinco microlitros da amostra de bebida diluída e 495 microlitros da solução de detecção em uma cubeta. Coloque a cubeta no analisador e aqueça a amostra previamente a 53 graus Celsius.

Pressione o botão de configuração para medir o teor de açúcar da amostra. Neste método, a eficiência de FRET é medida pela razão entre a intensidade de emissão da proteína fluorescente amarela e a da proteína fluorescente ciano no biossensor. A temperatura de medição ideal para esses biossensores CMY está entre 50 e 55 graus Celsius, pois a diferença na razão da intensidade de emissão entre uma solução controle e uma solução saturada de maltose é a maior possível.

O biossensor CMY-BII foi utilizado para avaliar o teor de maltose em três bebidas a 53 graus. Uma curva de resposta à dose é gerada a partir da obtenção dessa razão em várias concentrações de maltose em uma temperatura determinada. A razão de emissão é relacionada à concentração de maltose utilizando os valores obtidos durante a calibração.

O teor de maltose medido é apresentado juntamente com o teor total de açúcares informado pelos fabricantes das bebidas. A Bebida A continha fontes de maltose, como arroz e cevada. Consequentemente, a quantidade observada de maltose corresponde a cerca da metade do teor total de açúcares informado.

Bebida C, uma bebida esportiva, apresentava um teor muito baixo de maltose. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de operar o dispositivo e os sensores FRET entre 50 e 55 graus Celsius. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar moléculas tão pequenas com um analisador FRET portátil de fabricação própria.