Name: Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a detectar fragmentos de córtex e açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos de Clostridium difficile usando ensaio colorimétrico. Este método acessível auxilia pesquisadores em microbiologia.

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O Projeto descrito é suportado pelo Prêmio Número 5R01AI116895 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas ou o National Institutes of Health.

1. As amostras de Geração <ol><li> Calor ativar C. difficile esporos a 65 ° C durante 30 min e armazenar em gelo. Nota: C. esporos difficile pode ser produzida e purificada tal como descrito anteriormente 7,9,10. </li><li> Preparar a solução de germinação a X + 1 ml onde X é o número de amostras a serem tomadas durante o ensaio. Nota: A solução de germinação é específico para as espécies de bactérias esporos sendo estudado. Para ensaiar C. difficile a germinação de esporos, foi utilizada uma solução de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM e 10 mM de ácido taurocólico em água desionizada. </li><li> Antes de iniciar o ensaio, retirar uma amostra da solução de 1,0 ml sem germinação de esporos para servir como uma estrutura para a detecção fragmento córtex. </li><li> Adicionar esporos a um OD 600 de ~ 3.0 para a solução de germinação e vortex rapidamente. Nota: Para os nossos estudos de germinação em B. subtilis, foi utilizada a mesma OD 600 esporos como por C. difficile. Nota: Esta quantidade de esporos funcionou bem para monitoramento córtex liberação fragmento durante C. germinação de esporos difficile. A quantidade de esporos utilizada neste ensaio devem ser determinadas experimentalmente para cada bactéria ou estirpe. </li><li> Remover uma amostra de 1,2 ml, imediatamente após adição dos esporos e centrifugação à temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este é o ponto de tempo zero. </li><li> Transferir 1,0 ml do sobrenadante a partir da amostra centrifugada para um tubo fresco para a análise de fragmentos de córtex posterior. Nota: Se DPA necessitam de ser monitorizados, remover uma amostra de 100 ul em separado para a detecção de DPA na solução utilizando um ensaio baseado em fluorescência térbio 9,18,19. </li><li> Congelar a amostra recolhida a -80 ° C. </li><li> Repita os passos 1.4 e 1.5, em intervalos regulares, até que todos os pontos de tempo completo. Nota: Devido ao tempo necessário para a centrifugação e amostragem, momentos menos thum 2 min apart não fosse possível durante o nosso procedimento, para que os nossos intervalos de amostragem eram uma vez a cada 2 min para 14 min. </li><li> Como um controlo positivo para reduzir a detecção e quantificação de açúcar, incluem as seguintes quantidades de N-acetilglicosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, e 5000. Preparar estas amostras ao mesmo tempo como amostras de córtex e execute, juntamente com as amostras de córtex de modo que a curva padrão é relevante para os dados gerados pela germinação de esporos. </li><li> Depois de todas as amostras ponto de tempo são recolhidas, liofilizar as amostras. Nota: Nós liofilizado nossas amostras em tubos de 2 ml com tampa de rosca. </li></ol> 2. Medir Cortex Fragments <ol><li> Ressuspender as amostras liofilizadas em 120 mL de HCl 3 N suplementado com 1% de fenol e 0,5% β-mercaptoetanol. </li><li> Transferir as amostras em suspensão para 2 ml tubos com tampa de rosca. Nota: Para reprodutibilidade, assegurar toda a amostra liofilizada ï¿½ressuspenso e transferidos. </li> &lt;li&gt; Incubar as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante 4 h. </li><li> Após a incubação, colocar as amostras em gelo até que eles são legais. </li><li> Neutraliza-se a amostras com 120 uL de NaOH 3 M. </li><li> Adicionar 80 ul de uma solução saturada de bicarbonato de sódio e 80 mL de uma solução de anidrido acético a 5% a cada amostra e vortex. </li><li> Incubam-se as amostras à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Transferir as amostras de volta para o banho de água C 95 ° para exatamente 3 min. Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante. </li><li> Retirar amostras a partir do banho de água e arrefece-se em gelo. </li><li> Adicionar 400 uL de 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O para cada tubo e vortex. </li><li> Incubam-se as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante exactamente 7 min. Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante. </li><li> Removeras amostras e colocar em gelo durante 5 min. </li></ol> 3. Cor Reagente <ol><li> Enquanto as amostras estão no gelo (Passo 2,12), preparar o reagente de cor. Dissolve-se 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente de Ehrlich) em 1,9 ml de ácido acético glacial. Nota: O reagente é o tempo, temperatura e sensível à luz e não devem ser feitas com antecedência. </li><li> Após o DMAB se dissolva completamente, adicionar 100 mL de HCl 10 N e vortex. </li><li> Adicionar 5 ml de ácido acético glacial e agitar com vortex. </li></ol> 4. reacção colorimétrica <ol><li> Transferir 100 uL de cada amostra arrefecida córtex para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 700 ul da solução de cor recém-preparadas para cada amostra. </li><li> transferir imediatamente as amostras para um banho de água C 37 ° e incubar por exatamente 20 min. </li><li> Transferir 200 ul de cada amostra para uma placa de 96 poços clara. </li><li> Quantificar as amostras a 585 nm em um pratoleitor. As amostras devem começar em uma cor amarela e uma reacção positiva se deslocará para roxo. Quanto mais córtex presente, quanto mais profunda a cor roxa. </li></ol>

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<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Após estimulação, os esporos submetidos ao processo de germinação perder as suas propriedades de resistência, sem a necessidade de síntese macromolecular. Quando a germinação de esporos é acionado, o núcleo de esporos libera DPA em troca de água 2. Devido ao elevado teor de DPA do esporo dormente, o núcleo é de esporos sob intensa pressão osmótica e o peptidoglicano especializado, córtex, ajuda a impedir que o núcleo de inchaço, agindo, presumivelmente, como uma barreira para a expansão 2. <p c...

Endospores são metabolicamente formas latentes de bactérias que permitem que as bactérias para persistir em ambientes desfavoráveis. Em muitas bactérias formadoras de esporos, a formação de esporos é induzida pela privação de nutrientes, mas este processo pode ser controlada por alterações de pH, exposição ao oxigénio ou outros stresses 1. Embora em sua forma de esporos metabolicamente dormente, as bactérias resistir à radiação UV, a dessecação, temperaturas mais elevadas e que congela 2. A maior parte do conhecimento sobre o processo de esporulação vem de estudos no organismo modelo, Bacillus subtilis. O processo de esporulação começa com a replicação do ADN e a formação de um filamento de 3,4 axial. Um septo assimétrica, em seguida, divide a célula em dois compartimentos de tamanho desigual. O compartimento maior, a célula mãe, engolfa o compartimento mais pequeno, o forespore. Tanto a célula mãe e forespore coordenar a expressão do gene para amadurecer o esporo e a célula mãe, eventualmente, lisa, liberando o Dormant de esporos para o ambiente circundante um. A estrutura e a composição de esporos é conservada entre várias espécies bacterianas. O núcleo de esporos tem um teor de água inferior a célula vegetativa e é rica em ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante a formação de esporos, DPA é bombeado para dentro do núcleo de esporos em troca de água. Em torno do núcleo é uma membrana de esporos interior, onde, na maioria das bactérias formadoras de esporos, os receptores que reconhecem as pequenas moléculas que estimulam a germinação (germinants) estão localizados a 2. Localizado no exterior membrana interna do esporo é uma camada de peptidoglicano da parede celular. Uma camada de peptidoglicano especializado (córtex) rodeia o peptidoglicano da parede celular e é composta de muitos dos mesmos componentes como peptidoglicano da parede celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM)]. No entanto, aproximadamente 50% dos resíduos de NAM no córtex foram convertidos para murâmico-δ-lactama 5,6 </s-se&gt;. Durante a germinação de esporos, estes resíduos murâmico-δ-lactâmicos são reconhecidos pelos esporos do córtex enzimas líticas (SCLEs), permitindo assim que o córtex para ser degradada (um processo essencial para completar a germinação) mas não a parede celular. Rodeando o córtex é uma membrana exterior e várias camadas de proteínas de revestimento 2. Controlando o processo de germinação é criticamente importante para as bactérias formadoras de esporos. A germinação é iniciada quando os receptores germinativa interagir com seus respectivos germinants 2. Em muitas bactérias formadoras de esporos, estes são germinants amino ácidos, açúcares, nucleótidos, iões, ou combinações destes dois. C. difficile germinação de esporos é iniciada por meio de combinações de certos ácidos biliares, [por exemplo, ácido taurocólico (TA)] e aminoácidos (por exemplo, glicina) 7-10. Embora existam diferenças entre o C. via de germinação difficile e as vias estudadas em outra forma de esporobactérias, tais como B. subtilis, comum a todos é a exigência absoluta para degradar o córtex esporos para permitir que uma célula vegetativa a crescer a partir do esporos germinados 2,8. Córtex degradação pode ser conseguida pela SCLEs CwlJ / SleB (como encontrado em B. subtilis) ou SLEC (como encontrado em muitos Clostridia). hidrólise córtex reduz a restrição na parede da célula e esporo. Isto permite uma re-hidratação completa do núcleo, um passo necessário para a reactivação muitas das proteínas necessárias para o metabolismo celular 2. Quando esporos germinam, as mudanças de esporos a partir de um estado dormente de fase brilhante para um estado de fase-escuro e este processo pode ser medido por uma alteração na densidade óptica (DO) a 600 nm 11. Um relatório anterior sugere que grande parte dessa mudança de OD é devido à liberação da DPA do esporo 12. Durante a nossa recente estudo, buscou-se comparar o tempo de C. difficile germinação de esporos e acompanhou olançamento do DPA e córtex fragmentos 9. Para este estudo foi fundamental para monitorar o lançamento de fragmentos de córtex, quando começaram a ser lançado pela germinação de esporos. O ensaio colorimétrico aqui utilizado baseou-se num método para a detecção de açúcares com extremidades redutoras desenvolvido Ghuysen et ai. 13. Porque os outros têm descrito protocolos para a detecção de açúcares redutores 14 ou modificou os protocolos 15, a literatura sobre este assunto pode ser confuso. Aqui, nós detalhe um método passo-a-passo para a detecção colorimétrica de açúcares redutores libertados de germinação C. esporos difficile. Embora este estudo utiliza C. esporos difficile, os açúcares redutores libertados durante a germinação de esporos a partir de outras bactérias formadoras de esporos são capazes de serem detectadas com este protocolo 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>Tubo com tampa de rosca de 2,0 ml</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.250 &#956; l ponteiras de pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956; pontas de pipeta VWR</td><td></td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-D-glucosamina</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de potássio tetrahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4- (Dimetilamino) benzaldeído</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturado fenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moleculares Ácido Acético, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>aquecido, banho-maria circulante</td><td>VWR</td><td>Modelo científico 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 placas de cultura de tecidos bem claras</td></tr><tr><td>Tubos de cultura VWR</td><td></td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de cortex fragmentos durante bacteriana germinação de esporos

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

O processo de germinação de endósporos em Clostridium difficile e outros Clostridia, cada vez mais está sendo diferido da bactéria formadora de esporos modelo, Bacillus subtilis. A germinação é desencadeada por germinantes de moléculas pequenas e ocorre sem a necessidade de síntese macromolecular. Embora existam diferenças entre os mecanismos de germinação de esporos em espécies de Bacillus e Clostridium, um requisito comum é a hidrólise do córtex semelhante ao peptidoglicano, que permite que o núcleo do esporo inche e se reidrate. Após a reidratação, o metabolismo pode começar e isso, eventualmente, leva ao crescimento de uma célula vegetativa. A detecção de fragmentos de córtex hidrolisado durante a germinação de esporos pode ser difícil e as modificações nos ensaios descritos anteriormente podem ser confusas ou difíceis de reproduzir. Assim, com base em nosso recente relatório usando este ensaio, detalhamos um protocolo passo a passo para a detecção colorimétrica de fragmentos de córtex durante a germinação de esporos bacterianos.

A Tabela 1 mostra os resultados típicos usando padrões de NAG. Os dados são utilizados para gerar uma curva padrão. A Tabela 2 mostra os resultados típicos de um ensaio de germinação de germinação em tampão suplementado com 100 mM de glicina e TA 10 mM (condições de promoção da germinação) ou de glicina 100 mM apenas (condições não-germinação). Na ausência de TA, C. difficile esporos germinam e não há pouca alteração na presença de fragmentos do...

Aqui, descrevemos um ensaio colorimétrico para detectar a presença de açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos.

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

O objetivo geral deste protocolo passo a passo é quantificar a abundância de fragmentos do córtex ou de açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos. Este método detalhará os passos necessários para detectar a presença de fragmentos do córtex ou de açúcares redutores durante a germinação de esporos. A principal vantagem desta técnica é que a maioria dos laboratórios possui os reagentes e equipamentos necessários para realizar com êxito o protocolo.Inicie este procedimento colocando um tubo com esporos de Clostridium difficile em um bloco aquecedor e incubando-o a 65 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, coloque o tubo sobre gelo. A solução de germinação é específica para a espécie de esporo bacteriano em estudo.Para a análise da germinação de esporos de C.difficile, utilizamos uma solução de Tris 10 milimolar em pH 7,5 com 150 milimolares de cloreto de sódio, 100 milimolares de glicina e 10 milimolares de ácido taurocólico em água desionizada. Prepare um mililitro de solução de germinação por amostra, mais um mililitro adicional. Antes de iniciar o ensaio, transfira um mililitro da solução de germinação para um tubo de microcentrífuga e reserve-o.Isso servirá como uma amostra em branco para a detecção de fragmentos do córtex. Em seguida, adicione esporos à solução de germinação até uma DO600 de aproximadamente 3,0 e vortex brevemente. Essa quantidade de esporos é adequada para moderar a liberação de fragmentos do córtex durante a germinação de esporos de C. difficile.Imediatamente após adicionar os esporos, retire uma amostra de 1,2 mililitro para um novo tubo de microcentrífuga e coloque-o na centrífuga. Em seguida, centrifugue à temperatura ambiente por um minuto a 14.000 ×g. Este é o ponto de tempo zero. Após a centrifugação, transfira um mililitro do sobrenadante para um tubo novo com tampa de rosca de dois mililitros e congele a -80 graus Celsius.Repita o processo de coleta de alíquotas, centrifugação e congelamento em intervalos regulares até que a amostra tenha sido coletada para cada ponto temporal. Devido ao tempo necessário para a centrifugação e a coleta, pontos temporais inferiores a dois minutos não são possíveis durante este procedimento; portanto, essas amostras são coletadas a cada dois minutos durante 14 minutos. Ao preparar as amostras do córtex, caso seja necessário monitorar o ácido dipicolínico, remova uma amostra separada de 100 microlitros e transfira para um tubo de microcentrífuga sobre gelo.Prepare também amostras para gerar uma curva padrão com as seguintes quantidades de N-acetilglicosamina: zero, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000 nanomols em solução de germinação. Após coletar uma amostra para cada ponto temporal, retire as amostras do congelador e liofilize-as juntamente com a amostra em branco e as amostras da curva padrão.Em seguida, armazene todas as amostras a menos 80 graus Celsius até o uso. No dia do ensaio, reconstitua as amostras liofilizadas, incluindo as amostras controle e da curva padrão, em 120 microlitros de ácido clorídrico com fenol e beta-mercaptoetanol. Em seguida, transfira todas as amostras reconstituídas para tubos novos de dois mililitros com tampa rosqueável.Em seguida, incube-os em banho-maria recirculante a 95 graus Celsius por quatro horas. Após a incubação, coloque as amostras em gelo até esfriarem. Em seguida, adicione 120 microlitros de hidróxido de sódio três molar para neutralizá-las.Em seguida, adicione 80 microlitros de uma solução saturada de bicarbonato de sódio e 80 microlitros de uma solução de anidrido acético a 5% a cada amostra e agite em vórtex. Incube então as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, transfira as amostras de volta ao banho-maria a 95 graus Celsius por exatamente três minutos.Observe que esta etapa é sensível ao tempo e períodos mais longos podem afetar o desenvolvimento do sinal em etapas subsequentes. Remova as amostras do banho-maria e resfrie-as em gelo. Adicione 400 microlitros de tetraborato de potássio tetraidratado a 6,54% a cada tubo e vortexe.Incube as amostras em banho-maria com recirculação a 95 graus Celsius por exatamente sete minutos. Este passo também é sensível ao tempo. Remova as amostras e coloque-as sobre gelo por cinco minutos.Enquanto as amostras estão no gelo, prepare o reagente corante. Dissolva 0,320 gramas de DMAB em 1,9 mililitros de ácido acético glacial. Observe que este reagente é sensível ao tempo, à temperatura e à luz, e não deve ser preparado com antecedência.Após a dissolução completa do DMAB, adicione 100 microlitros de ácido clorídrico 10 normal e vortexe a amostra. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético glacial e vortexe novamente. Para a reação colorimétrica, transfira 100 microlitros de cada amostra de córtex ou controle resfriada para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.Adicione 700 microlitros da solução de cor recém-preparada a cada amostra. Transfira imediatamente as amostras para um banho-maria a 37 graus Celsius e incube as amostras por exatamente 20 minutos. Após a incubação, transfira 200 microlitros de cada amostra para uma placa clara de 96 poços.As amostras devem ser amarelas no início, mas mudarão para roxo se houver açúcar redutor, o que indica a presença de córtex. Aqui, muitas das amostras não apresentam uma coloração roxa visível. No entanto, as amostras de 250, 500 e 5.000 nanomoles parecem visualmente diferentes do controle negativo de zero nanomol.Utilizando um leitor de placas, determine a absorbância em 585 nanômetros. Quando medida em uma DO de 585 nanômetros, o sinal gerado pelas amostras padrão se ajusta melhor a uma regressão linear. Esta tabela mostra resultados típicos utilizando padrões de N-acetilglicosamina.Esses dados foram então utilizados para gerar a curva padrão mostrada aqui. Um ensaio de germinação foi realizado em condições que promovem a germinação, com tampão de germinação suplementado com 100 milimolares de glicina e 10 milimolares de ácido taurocólico. Em condições não germinativas, apenas 100 milimolares de glicina.Na ausência de ácido taurocólico, os esporos de C. difficile não germinam, e há pouca alteração na presença de fragmentos de córtex na solução. No entanto, na presença de ácido taurocólico e glicina, os esporos de C. difficile germinam e liberam fragmentos de córtex na solução. Isso é observado como um aumento na OD585 ao longo do tempo das amostras reagidas.A quantidade de fragmentos de córtex liberados durante este ensaio foi calculada utilizando uma curva padrão. Como pode ser observado neste ensaio, a maior parte do córtex foi hidrolisada ou liberada até 15 minutos após a exposição ao germinante. Isso sugere que a maioria dos esporos germinou dentro desse intervalo de tempo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar fragmentos do córtex ou açúcares redutores em uma solução de germinação durante a germinação de esporos bacterianos. Ao realizar este procedimento, é importante prestar muita atenção aos tempos de reação para que o ensaio se desenvolva corretamente.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Francis, M. B., et al. Detecção de fragmentos de córtex durante a germinação de esporos bacterianos. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra um método colorimétrico para detectar a degradação do córtex durante a germinação de esporos bacterianos, medindo a liberação de açúcares redutores ao longo do tempo. Usando padrões de N-acetilglucosamina e amostras de ponto de tempo, o ensaio quantifica a concentração de açúcar por meio de uma reação cromogênica roxa, indicando a extensão da...

Detecção colorimétrica da degradação do córtex durante a germinação de esporos bacterianos

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualização de germinossomos e membrana interna em esporos de Bacillus subtilis . J. Vis. (2019)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de iluminação estruturada para adquirir imagens de fluorescência tridimensionais que revelam a organização das proteínas de germinação dentro do esporo bacteriano.

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Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

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