Name: Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a detectar fragmentos de córtex e açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos de Clostridium difficile usando ensaio colorimétrico. Este método acessível auxilia pesquisadores em microbiologia.

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O Projeto descrito é suportado pelo Prêmio Número 5R01AI116895 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas ou o National Institutes of Health.

1. As amostras de Geração <ol><li> Calor ativar C. difficile esporos a 65 ° C durante 30 min e armazenar em gelo. Nota: C. esporos difficile pode ser produzida e purificada tal como descrito anteriormente 7,9,10. </li><li> Preparar a solução de germinação a X + 1 ml onde X é o número de amostras a serem tomadas durante o ensaio. Nota: A solução de germinação é específico para as espécies de bactérias esporos sendo estudado. Para ensaiar C. difficile a germinação de esporos, foi utilizada uma solução de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM e 10 mM de ácido taurocólico em água desionizada. </li><li> Antes de iniciar o ensaio, retirar uma amostra da solução de 1,0 ml sem germinação de esporos para servir como uma estrutura para a detecção fragmento córtex. </li><li> Adicionar esporos a um OD 600 de ~ 3.0 para a solução de germinação e vortex rapidamente. Nota: Para os nossos estudos de germinação em B. subtilis, foi utilizada a mesma OD 600 esporos como por C. difficile. Nota: Esta quantidade de esporos funcionou bem para monitoramento córtex liberação fragmento durante C. germinação de esporos difficile. A quantidade de esporos utilizada neste ensaio devem ser determinadas experimentalmente para cada bactéria ou estirpe. </li><li> Remover uma amostra de 1,2 ml, imediatamente após adição dos esporos e centrifugação à temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este é o ponto de tempo zero. </li><li> Transferir 1,0 ml do sobrenadante a partir da amostra centrifugada para um tubo fresco para a análise de fragmentos de córtex posterior. Nota: Se DPA necessitam de ser monitorizados, remover uma amostra de 100 ul em separado para a detecção de DPA na solução utilizando um ensaio baseado em fluorescência térbio 9,18,19. </li><li> Congelar a amostra recolhida a -80 ° C. </li><li> Repita os passos 1.4 e 1.5, em intervalos regulares, até que todos os pontos de tempo completo. Nota: Devido ao tempo necessário para a centrifugação e amostragem, momentos menos thum 2 min apart não fosse possível durante o nosso procedimento, para que os nossos intervalos de amostragem eram uma vez a cada 2 min para 14 min. </li><li> Como um controlo positivo para reduzir a detecção e quantificação de açúcar, incluem as seguintes quantidades de N-acetilglicosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, e 5000. Preparar estas amostras ao mesmo tempo como amostras de córtex e execute, juntamente com as amostras de córtex de modo que a curva padrão é relevante para os dados gerados pela germinação de esporos. </li><li> Depois de todas as amostras ponto de tempo são recolhidas, liofilizar as amostras. Nota: Nós liofilizado nossas amostras em tubos de 2 ml com tampa de rosca. </li></ol> 2. Medir Cortex Fragments <ol><li> Ressuspender as amostras liofilizadas em 120 mL de HCl 3 N suplementado com 1% de fenol e 0,5% β-mercaptoetanol. </li><li> Transferir as amostras em suspensão para 2 ml tubos com tampa de rosca. Nota: Para reprodutibilidade, assegurar toda a amostra liofilizada ï¿½ressuspenso e transferidos. </li> &lt;li&gt; Incubar as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante 4 h. </li><li> Após a incubação, colocar as amostras em gelo até que eles são legais. </li><li> Neutraliza-se a amostras com 120 uL de NaOH 3 M. </li><li> Adicionar 80 ul de uma solução saturada de bicarbonato de sódio e 80 mL de uma solução de anidrido acético a 5% a cada amostra e vortex. </li><li> Incubam-se as amostras à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Transferir as amostras de volta para o banho de água C 95 ° para exatamente 3 min. Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante. </li><li> Retirar amostras a partir do banho de água e arrefece-se em gelo. </li><li> Adicionar 400 uL de 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O para cada tubo e vortex. </li><li> Incubam-se as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante exactamente 7 min. Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante. </li><li> Removeras amostras e colocar em gelo durante 5 min. </li></ol> 3. Cor Reagente <ol><li> Enquanto as amostras estão no gelo (Passo 2,12), preparar o reagente de cor. Dissolve-se 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente de Ehrlich) em 1,9 ml de ácido acético glacial. Nota: O reagente é o tempo, temperatura e sensível à luz e não devem ser feitas com antecedência. </li><li> Após o DMAB se dissolva completamente, adicionar 100 mL de HCl 10 N e vortex. </li><li> Adicionar 5 ml de ácido acético glacial e agitar com vortex. </li></ol> 4. reacção colorimétrica <ol><li> Transferir 100 uL de cada amostra arrefecida córtex para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 700 ul da solução de cor recém-preparadas para cada amostra. </li><li> transferir imediatamente as amostras para um banho de água C 37 ° e incubar por exatamente 20 min. </li><li> Transferir 200 ul de cada amostra para uma placa de 96 poços clara. </li><li> Quantificar as amostras a 585 nm em um pratoleitor. As amostras devem começar em uma cor amarela e uma reacção positiva se deslocará para roxo. Quanto mais córtex presente, quanto mais profunda a cor roxa. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Após estimulação, os esporos submetidos ao processo de germinação perder as suas propriedades de resistência, sem a necessidade de síntese macromolecular. Quando a germinação de esporos é acionado, o núcleo de esporos libera DPA em troca de água 2. Devido ao elevado teor de DPA do esporo dormente, o núcleo é de esporos sob intensa pressão osmótica e o peptidoglicano especializado, córtex, ajuda a impedir que o núcleo de inchaço, agindo, presumivelmente, como uma barreira para a expansão 2. <p c...

Endospores são metabolicamente formas latentes de bactérias que permitem que as bactérias para persistir em ambientes desfavoráveis. Em muitas bactérias formadoras de esporos, a formação de esporos é induzida pela privação de nutrientes, mas este processo pode ser controlada por alterações de pH, exposição ao oxigénio ou outros stresses 1. Embora em sua forma de esporos metabolicamente dormente, as bactérias resistir à radiação UV, a dessecação, temperaturas mais elevadas e que congela 2. A maior parte do conhecimento sobre o processo de esporulação vem de estudos no organismo modelo, Bacillus subtilis. O processo de esporulação começa com a replicação do ADN e a formação de um filamento de 3,4 axial. Um septo assimétrica, em seguida, divide a célula em dois compartimentos de tamanho desigual. O compartimento maior, a célula mãe, engolfa o compartimento mais pequeno, o forespore. Tanto a célula mãe e forespore coordenar a expressão do gene para amadurecer o esporo e a célula mãe, eventualmente, lisa, liberando o Dormant de esporos para o ambiente circundante um. A estrutura e a composição de esporos é conservada entre várias espécies bacterianas. O núcleo de esporos tem um teor de água inferior a célula vegetativa e é rica em ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante a formação de esporos, DPA é bombeado para dentro do núcleo de esporos em troca de água. Em torno do núcleo é uma membrana de esporos interior, onde, na maioria das bactérias formadoras de esporos, os receptores que reconhecem as pequenas moléculas que estimulam a germinação (germinants) estão localizados a 2. Localizado no exterior membrana interna do esporo é uma camada de peptidoglicano da parede celular. Uma camada de peptidoglicano especializado (córtex) rodeia o peptidoglicano da parede celular e é composta de muitos dos mesmos componentes como peptidoglicano da parede celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM)]. No entanto, aproximadamente 50% dos resíduos de NAM no córtex foram convertidos para murâmico-δ-lactama 5,6 </s-se&gt;. Durante a germinação de esporos, estes resíduos murâmico-δ-lactâmicos são reconhecidos pelos esporos do córtex enzimas líticas (SCLEs), permitindo assim que o córtex para ser degradada (um processo essencial para completar a germinação) mas não a parede celular. Rodeando o córtex é uma membrana exterior e várias camadas de proteínas de revestimento 2. Controlando o processo de germinação é criticamente importante para as bactérias formadoras de esporos. A germinação é iniciada quando os receptores germinativa interagir com seus respectivos germinants 2. Em muitas bactérias formadoras de esporos, estes são germinants amino ácidos, açúcares, nucleótidos, iões, ou combinações destes dois. C. difficile germinação de esporos é iniciada por meio de combinações de certos ácidos biliares, [por exemplo, ácido taurocólico (TA)] e aminoácidos (por exemplo, glicina) 7-10. Embora existam diferenças entre o C. via de germinação difficile e as vias estudadas em outra forma de esporobactérias, tais como B. subtilis, comum a todos é a exigência absoluta para degradar o córtex esporos para permitir que uma célula vegetativa a crescer a partir do esporos germinados 2,8. Córtex degradação pode ser conseguida pela SCLEs CwlJ / SleB (como encontrado em B. subtilis) ou SLEC (como encontrado em muitos Clostridia). hidrólise córtex reduz a restrição na parede da célula e esporo. Isto permite uma re-hidratação completa do núcleo, um passo necessário para a reactivação muitas das proteínas necessárias para o metabolismo celular 2. Quando esporos germinam, as mudanças de esporos a partir de um estado dormente de fase brilhante para um estado de fase-escuro e este processo pode ser medido por uma alteração na densidade óptica (DO) a 600 nm 11. Um relatório anterior sugere que grande parte dessa mudança de OD é devido à liberação da DPA do esporo 12. Durante a nossa recente estudo, buscou-se comparar o tempo de C. difficile germinação de esporos e acompanhou olançamento do DPA e córtex fragmentos 9. Para este estudo foi fundamental para monitorar o lançamento de fragmentos de córtex, quando começaram a ser lançado pela germinação de esporos. O ensaio colorimétrico aqui utilizado baseou-se num método para a detecção de açúcares com extremidades redutoras desenvolvido Ghuysen et ai. 13. Porque os outros têm descrito protocolos para a detecção de açúcares redutores 14 ou modificou os protocolos 15, a literatura sobre este assunto pode ser confuso. Aqui, nós detalhe um método passo-a-passo para a detecção colorimétrica de açúcares redutores libertados de germinação C. esporos difficile. Embora este estudo utiliza C. esporos difficile, os açúcares redutores libertados durante a germinação de esporos a partir de outras bactérias formadoras de esporos são capazes de serem detectadas com este protocolo 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>Tubo com tampa de rosca de 2,0 ml</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.250 &#956; l ponteiras de pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956; pontas de pipeta VWR</td><td></td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-D-glucosamina</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de potássio tetrahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4- (Dimetilamino) benzaldeído</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturado fenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moleculares Ácido Acético, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>aquecido, banho-maria circulante</td><td>VWR</td><td>Modelo científico 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 placas de cultura de tecidos bem claras</td></tr><tr><td>Tubos de cultura VWR</td><td></td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de cortex fragmentos durante bacteriana germinação de esporos

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

O processo de germinação de endósporos em Clostridium difficile e outros Clostridia, cada vez mais está sendo diferido da bactéria formadora de esporos modelo, Bacillus subtilis. A germinação é desencadeada por germinantes de moléculas pequenas e ocorre sem a necessidade de síntese macromolecular. Embora existam diferenças entre os mecanismos de germinação de esporos em espécies de Bacillus e Clostridium, um requisito comum é a hidrólise do córtex semelhante ao peptidoglicano, que permite que o núcleo do esporo inche e se reidrate. Após a reidratação, o metabolismo pode começar e isso, eventualmente, leva ao crescimento de uma célula vegetativa. A detecção de fragmentos de córtex hidrolisado durante a germinação de esporos pode ser difícil e as modificações nos ensaios descritos anteriormente podem ser confusas ou difíceis de reproduzir. Assim, com base em nosso recente relatório usando este ensaio, detalhamos um protocolo passo a passo para a detecção colorimétrica de fragmentos de córtex durante a germinação de esporos bacterianos.

A Tabela 1 mostra os resultados típicos usando padrões de NAG. Os dados são utilizados para gerar uma curva padrão. A Tabela 2 mostra os resultados típicos de um ensaio de germinação de germinação em tampão suplementado com 100 mM de glicina e TA 10 mM (condições de promoção da germinação) ou de glicina 100 mM apenas (condições não-germinação). Na ausência de TA, C. difficile esporos germinam e não há pouca alteração na presença de fragmentos do...

Aqui, descrevemos um ensaio colorimétrico para detectar a presença de açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos.

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

O objetivo geral deste protocolo passo a passo é quantificar a abundância de fragmentos do córtex ou de açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos. Este método detalhará os passos necessários para detectar a presença de fragmentos do córtex ou de açúcares redutores durante a germinação de esporos. A principal vantagem desta técnica é que a maioria dos laboratórios possui os reagentes e equipamentos necessários para realizar com êxito o protocolo.Inicie este procedimento colocando um tubo com esporos de Clostridium difficile em um bloco aquecedor e incubando-o a 65 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, coloque o tubo sobre gelo. A solução de germinação é específica para a espécie de esporo bacteriano em estudo.Para a análise da germinação de esporos de C.difficile, utilizamos uma solução de Tris 10 milimolar em pH 7,5 com 150 milimolares de cloreto de sódio, 100 milimolares de glicina e 10 milimolares de ácido taurocólico em água desionizada. Prepare um mililitro de solução de germinação por amostra, mais um mililitro adicional. Antes de iniciar o ensaio, transfira um mililitro da solução de germinação para um tubo de microcentrífuga e reserve-o.Isso se

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Francis, M. B., et al. Detecção de fragmentos de córtex durante a germinação de esporos bacterianos. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra um método colorimétrico para detectar a degradação do córtex durante a germinação de esporos bacterianos, medindo a liberação de açúcares redutores ao longo do tempo. Usando padrões de N-acetilglucosamina e amostras de ponto de tempo, o ensaio quantifica a concentração de açúcar por meio de uma reação cromogênica roxa, indicando a extensão da...

Detecção colorimétrica da degradação do córtex durante a germinação de esporos bacterianos

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualização de germinossomos e membrana interna em esporos de Bacillus subtilis . J. Vis. (2019)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de iluminação estruturada para adquirir imagens de fluorescência tridimensionais que revelam a organização das proteínas de germinação dentro do esporo bacteriano.

Visualização de proteínas de germinação na membrana interna de esporos bacterianos

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Um método para destacar endósporos bacterianos de comunidades microbianas complexas foi desenvolvido para realizar estudos moleculares ou de cultura personalizados desse grupo de bactérias.

O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Este protocolo ilustra as etapas consecutivas importantes, necessárias para avaliar a pertinência de monitoramento parâmetro de vitalidade e os processos de reparação do DNA em reviving esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão de tracking proteínas através do tempo-resolvido microscopia confocal e microscopia eletrônica de reparo de DNA marcado com fluorescência.

Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Aqui nós apresentamos protocolos para iniciante pesquisadores para iniciar fenotipagem para farmacologicamente importante bacteriana gênero Streptomyces.

Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Cluster de proteínas do receptor germinant em 'germinosomes' na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.

Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia

Este protocolo enfoca o uso de citometria de fluxo e contagem de esferas para quantificar esporos bacterianos marcados com brometo de etídio. O método também é eficiente para analisar o acoplamento covalente de proteínas na superfície de esporos intactos.

Aprimoramento da Enumeração de Esporos de Bacillus subtilis e Análise de Marcação em Citometria de Fluxo

Aprenda a detectar fragmentos de córtex e açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos de Clostridium difficile usando ensaio colorimétrico. Este método acessível auxilia pesquisadores em microbiologia.

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

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