Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

O objetivo geral deste protocolo passo a passo é quantificar a abundância de fragmentos de córtex ou açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos. Este método detalhará as etapas necessárias para detectar a presença de fragmentos de córtex ou açúcares redutores durante a germinação dos esporos. A principal vantagem dessa técnica é que a maioria dos laboratórios possui os reagentes e equipamentos necessários para concluir o protocolo com sucesso.

Comece este procedimento colocando um tubo de esporos de Clostridium difficile em um bloco de aquecimento e incubando-o a 65 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, coloque o tubo no gelo. A solução de germinação é específica para a espécie de esporo bacteriano que está sendo estudada.

Para testar a germinação de esporos de C. difficile, usamos uma solução de Tris 10 milimolares em pH 7,5 com 150 milimolares de cloreto de sódio, 100 milimolares de glicina e 10 milimolares de ácido taurocólico em água deionizada. Prepare um mililitro de solução de germinação por amostra mais um mililitro adicional. Antes de iniciar o ensaio, transferir um mililitro da solução de germinação para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo de lado.

Isso servirá como um espaço em branco para detecção de fragmentos do córtex. Em seguida, à solução de germinação, adicione esporos a um OD600 de cerca de 3,0 e brevemente vórtice. Essa quantidade de esporos funciona bem para moderar a liberação de fragmentos do córtex durante a germinação de esporos de C. difficile.

Imediatamente após adicionar os esporos, remova uma amostra de 1,2 mililitro para um novo tubo de microcentrífuga e coloque-a na centrífuga. Em seguida, centrifugue à temperatura ambiente por um minuto a 14.000 vezes G.Este é o ponto de tempo zero. Após a centrifugação, transfira um mililitro do sobrenadante para um novo tubo com tampa de rosca de dois mililitros e congele-o a 80 graus Celsius negativos.

Repita o processo de tirar alíquotas, centrifugar e congelar em intervalos regulares até que a amostra tenha sido coletada para cada ponto de tempo. Devido ao tempo necessário para centrifugação e amostragem, pontos de tempo inferiores a dois minutos não são possíveis durante este procedimento, portanto, essas amostras são coletadas uma vez a cada dois minutos por 14 minutos. Ao preparar as amostras de córtex, se o ácido dipicolínico precisar ser monitorado, remova uma amostra separada de 100 microlitros e dispense em um tubo de microcentrífuga no gelo.

Prepare também amostras para gerar uma curva padrão com as seguintes quantidades de N-acetilglucosamina. Zero, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000 nanomoles em solução de germinação. Depois que uma amostra tiver sido coletada para cada ponto de tempo, remova as amostras do freezer e liofilize-as junto com as amostras em branco e a curva padrão.

Em seguida, armazene todas as amostras a 80 graus Celsius negativos até o uso. No dia do ensaio, ressuspender as amostras liofilizadas, incluindo as amostras de controle e curva padrão, em 120 microlitros de ácido clorídrico com fenol e beta-mercaptoetanol. Em seguida, transfira todas as amostras ressuspensas para tubos novos de tampa de rosca de dois mililitros.

Em seguida, incube-os em banho-maria de recirculação a 95 graus Celsius por quatro horas. Após a incubação, coloque as amostras no gelo até que esfriem. Em seguida, adicione 120 microlitros de hidróxido de sódio de três molares para neutralizá-los.

Em seguida, adicione 80 microlitros de uma solução saturada de bicarbonato de sódio e 80 microlitros de uma solução de anidrido acético a 5% a cada amostra e faça um vórtice. Em seguida, incube as amostras em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, transfira as amostras de volta para o banho-maria a 95 graus Celsius por exatamente três minutos.

Observe que esta etapa é sensível ao tempo e tempos mais longos podem afetar o desenvolvimento do sinal downstream. Retire as amostras do banho-maria e arrefeca-as no gelo. Adicione 400 microlitros de tetraborato de potássio 6,54% tetrahidratado a cada tubo e vórtice.

Incube as amostras em banho-maria recirculante a 95 graus Celsius por exatamente sete minutos. Esta etapa também é sensível ao tempo. Retire as amostras e coloque-as no gelo por cinco minutos.

Enquanto as amostras estão no gelo, prepare o reagente de cor. Dissolva 0,320 gramas de DMAB em 1,9 mililitros de ácido acético glacial. Observe que este reagente é sensível ao tempo, temperatura e luz e não deve ser feito com antecedência.

Depois que o DMAB se dissolver completamente, adicione 100 microlitros de ácido clorídrico 10 normal e vortex a amostra. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético glacial e vórtice novamente. Para a reação colorimétrica, transfira 100 microlitros de cada córtex resfriado ou amostra de controle para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Adicione 700 microlitros da solução colorida recém-preparada a cada amostra. Transfira imediatamente as amostras para um banho-maria a 37 graus Celsius e incube as amostras por exatamente 20 minutos. Após a incubação, transfira 200 microlitros de cada amostra para uma placa transparente de 96 poços.

As amostras devem ser de cor amarela para começar, mas mudarão para roxo se o açúcar redutor, que indica a presença de córtex, estiver presente. Aqui, muitas das amostras não mostram uma cor roxa visível. No entanto, as amostras de 250, 500 e 5.000 nanomoles parecem visualmente diferentes do nanomol zero de controle negativo.

Usando um leitor de placas, determine a absorbância em 585 nanômetros. Quando medido em um OD de 585 nanômetros, o sinal gerado a partir das amostras padrão se ajusta melhor a uma regressão linear. Esta tabela mostra resultados típicos usando padrões de N-acetilglucosamina.

Esses dados foram então usados para gerar a curva padrão mostrada aqui. Um ensaio de germinação foi realizado em condições promotoras de germinação com tampão de germinação suplementado com glicina 100 milimolar e ácido taurocólico 10 milimolar. Em condições não germinativas, apenas 100 milimolares de glicina.

Na ausência de ácido taurocólico, os esporos de C. Difficile não germinam e há pouca alteração na presença de fragmentos de córtex na solução. No entanto, na presença de ácido taurocólico e glicina, os esporos de C. difficile germinam e liberam fragmentos do córtex na solução. Isso é absorvido como um aumento no OD585 ao longo do tempo das amostras reagidas.

A quantidade de fragmentos de córtex liberados durante este ensaio foi calculada usando uma curva padrão. Como pode ser visto aqui neste ensaio, a maior parte do córtex foi hidrolisada ou liberada 15 minutos após a exposição germinante. Isso sugere que a maioria dos esporos germinou nesse período de tempo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar fragmentos de córtex ou açúcares redutores em uma solução de germinação durante a germinação de esporos bacterianos. Ao tentar este procedimento, é importante prestar muita atenção aos tempos de reação para que o ensaio se desenvolva corretamente.