Name: Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprenda a preparar um modelo de coração isolado em roedores para estudar o desempenho miocárdico e o consumo de oxigênio. Este método permite controlar precisamente as condições de carga ventricular em pesquisas cardiovasculares.

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O equipamento e as experiências descritas aqui foram financiados pelo Departamento de Cardiologia do Hospital Infantil de Boston e por doações filantrópicas da família Haseotes. Somos gratos a Drs. Frank McGowan e Huamei Ele por nos fornecer as primeiras experiências com este modelo, e Lindsay Thomson para obter ajuda com trabalhos de arte.

Este protocolo é realizada sob um protocolo atual em comissão de cuidados com os animais e a utilização da instituição. 1. Preparação para o Estudo <ol><li> Ligar o banho de água para aquecer o reservatório de tampão de Krebs-Henseleit (KHB) (definido como 42 ° C). </li><li> Preparar 16 litros de KHB contendo (em mM) 128 de NaCl, 5,7 de KCl, 1,3 MgSO4, 25 NaHCO3, 2,7 CaCl2, 0,53 de EDTA, 0,54 NaC 3 H 3 O 3, e 10,8 dextrose. 13 As massas de substrato são como se segue : 27,584 g de NaCl, 1,58 g de KCl, 0,578 g de MgSO4, 8,401 g de NaHCO3, 1,47 g de CaCl2, 0,744 g de EDTA, 0,22 g de NaC 3 H 3 O 3, e 7,208 g de dextrose. Nota: estes componentes podem ser armazenados em tubos cónicos na forma de pó para reconstituição no dia da experimentação. <ol><li> Filtro de 4 L de água desionizada através de um filtro de 0,22 micron. </li><li> Adicionar 3,7 L de água a esta de 4 Ltaça. Adicionar todos os componentes, excepto para CaCl2 à água. </li><li> Dissolve-se o CaCl2 nos restantes 300 ml de água utilizando um copo separado. </li><li> Oxigenar a solução com 95% de O2 / 5% de CO 2 a 1 L / min (LPM) durante 5 min. Isto corrige o pH para 7,40 e aumenta a dissolução do CaCI2. </li><li> Adicionar o CaCl 2 a parte restante do KHB. </li><li> Adicione o KHB concluído para um reservatório e circular por toda a tubulação para 30 min. Certifique-se de que o sistema está livre de bolhas macroscópicos. Oxigenado com 95% O2 / 5% de CO 2 a 0,5 LPM. NOTA: KHB pode ser armazenado durante a noite no frigorifico durante não mais do que 1 - 2 dias, trazida de volta para a temperatura ambiente e filtrou-se para re-utilização. Não reutilize KHB entre os experimentos. </li><li> Prepare 2 x 50 ml copos limpos com KHB gelada e coloque-os em um balde de gelo perto da estação de dissecção. Certifique-se de que a KHB é frio (e não refrigerados) antes de ex<html> plantando o coração. </li><li> Posicionar o cateter de micro pressão-volume (PV) numa seringa de 10 ml cheia com KHB filtrada durante 30 min antes da calibração, conforme as instruções do fabricante. NOTA: Temperatura de KHB usada para embeber o cateter PV deve ser o mais próximo de 37 ° C quanto possível. </li></ol></li><li> Preparar a anestesia e a estação de dissecação para o animal. <ol><li> Certifique-se de isoflurano adequada no reservatório. Elaborar 500 U de heparina numa seringa de 1 ml; colocar uma agulha de calibre 26 (1/2 &quot;) nesta seringa. Prepara-se uma máscara para anestesiar o animal. </li></ol></li><li> Ajuste a pressão bloco de perfusão aórtica 80 mmHg eo átrio esquerdo (AE) pressão bloco de perfusão 10 mmHg. tanto o bloco aórtica aberta e bloco de LA para permitir quente KHB a escorrer para fora. Quando estiver pronto para dissecar o animal, abrir o bloco aórtica para permitir um gotejamento lento constante de KHB fora. </li><li> Calibra-se o cateter fotovoltaico de acordo com as instruções dos fabricantes. </li></ol>&quot;&gt; 2. Preparação Animal e Dissection NOTA: Para obter melhores resultados, certifique-animal é entre 300 e 500 g; verificou-se que um peso do animal entre 425-450 g é ideal para o nosso sistema. <ol><li> Anestesiar o animal numa câmara de isoflurano utilizando (1 - 2%) até que o animal está inconsciente. Transferir o animal para a estação de dissecção e colocar a máscara de anestesia com isoflurano e oxigénio no animal. Execute toe pitada para avaliar o nível de sedação. Aplicar vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Injectar heparina, 500 unidades por via intraperitoneal na cavidade abdominal. Permitir 10 min para a heparina de forma a ser absorvido. Fixe os membros do animal com fita para melhorar a visualização do tórax. </li><li> A dissecção do coração. <ol><li> Depois de assegurar que não há resposta a um aperto do dedo do pé, levantar a pele para longe da cavidade abdominal com uma pinça e, em seguida, utilizar tesouras de incisão da cavidade peritoneal, a seguir a curva de tele diafragma volta ao ângulo posterior das costelas. </li><li> Uma vez que o diafragma é visível, utilizando uma tesoura pequena, cortados ao longo da superfície anterior do diafragma seguindo a direcção dos cortes anteriores para permitir a entrada no tórax. Estender cada corte ao longo da linha axilar bilateral para a axila. NOTA: Os próximos passos devem ser realizados de forma eficiente uma vez que a ventilação será comprometida uma vez que o diafragma é incisão. </li><li> Retrair a caixa torácica anterior do processo xifóide usando uma pinça. Inciso pericárdio e pleura. </li><li> Identificar a veia cava inferior (VCI) e aorta logo acima do diafragma e retraem-los em bloco anterior usando uma pinça sem corte. </li><li> Usando grandes, tesoura curva, rapidamente fazer uma incisão através da VCI e aorta, puxando o coração e os pulmões para fora do peito em bloco. Corte as esófago, traqueia, artérias e veias braquiocefálicas cefálica para remover o coração e os pulmões do tórax. Extirpar o teutecido mic com este bloco de tecido. Tome cuidado para não cortar a porção proximal da aorta ascendente. </li><li> imediatamente mergulhe o coração e os pulmões em KHB gelada e passar para o aparelho de Langendorff, previamente configurado conforme descrito na etapa 1. </li></ol></li></ol> 3. aórtica Canulação <ol style="margin-left: 40px;"><li> Colocar o complexo de coração-pulmão de um prato liso e orientar o coração com o timo e grandes vasos de frente para o experimentador e do aspecto posterior dos pulmões de frente para a mesa. Separar os dois lóbulos do timo e identificar a decolagem das artérias braquiocefálicas da aorta. <ol><li> Armar a aorta ao longo da borda do prato e transecto da aorta usando uma tesoura pequena aproximadamente 5 mm acima da válvula aórtica, apenas proximal à decolagem da artéria subclávia direita. NOTA: A incisão deve render um círculo limpo - a aorta na secção transversal. Se estiver desligado angular (ou seja, uma grande oval)ou incompleta, repetir o corte para atingir o resultado desejado. Isso irá facilitar o uso da aorta eficiente. </li></ol></li><li> Usando 2 pares de pinças curvas em ambos os lados da aorta, orientar a aorta através da cânula aórtica (que deve ser gotejando lentamente com KHB). A válvula aórtica deve sentar-se 1 - 2 mm abaixo da ponta da cânula. <ol><li> Após punção aorta, reposicionar a pinça perpendicularmente ao longo da aorta para segurar a aorta no lugar. Alternativamente, coloque uma pequena braçadeira do outro lado da aorta para manter o complexo de pulmão coração no lugar, permitindo que um único experimentador para completar este modelo. </li></ol></li><li> Ter um assistente passar um fio de seda 4-0 logo abaixo do fórceps e gravata no lugar, looping em torno da cânula e amarrando várias vezes, tanto na frente e atrás do coração. Abra a cânula totalmente para começar fluxo aórtico retrógrada completo. Observe o coração bater vigorosamente. NOTA: Se o coração não começa a bater rapidamente (~ 200 BPM) e vigorosamente, oamarrar ou cânula podem ser ocluir uma ou de ambas as artérias coronárias. Se esse é suspeito, remova o empate e reposicioná-lo longe das artérias coronárias. Se o coração distende e não bater, a cânula pode ser através da válvula aórtica. Em caso de vazamento da artéria coronária (sprays KHB a partir da raiz da aorta), o avanço da cânula mais perto da válvula aórtica (este fenómeno pode ocorrer se a artéria inominada é canular no lugar da aorta ascendente). </li></ol> 4. Veia Pulmonar Oclusão e Preparação da artéria pulmonar para Canulação NOTA: O objectivo deste passo é o de criar um sistema do átrio esquerdo fechado para assegurar que todo o volume e a pressão a partir do bloco átrio esquerdo é transmitida para as estruturas do coração esquerdo. Fracasso para ocluir completamente as veias pulmonares pode resultar em deficiência de pré-carga e pode falsificar resultados ou criar uma preparação de coração de trabalho instável. <ol><li> Remover o timo para melhorar a exposição de the artéria pulmonar (AP). </li><li> rodar manualmente a cânula da aorta de modo a que o aspecto posterior do coração está de frente para o operador. Dissecar os vasos principais para o pulmão direito. Suspender o tecido pulmonar direita usando uma pinça para delinear mais destes navios. Usando grampos cirúrgicos de médio-grande (ou sutura), oclusão da artéria pulmonar direita e veia e brônquios com um único clipe. Ressecar o distal pulmão direito ao clipe. NOTA: Devido a dificuldade de dissecção da artéria pulmonar livre, a nossa prática é a oclusão das veias pulmonares para a distensão da artéria pulmonar, tornando mais fácil para inciso sem prejudicar as estruturas vizinhas em um modelo de coração batendo. </li><li> Repita o passo 4,2 no pulmão esquerdo. NOTA: armadilhas potenciais e resolução de problemas: Uma vez que ambas as artérias pulmonares são ocluído, o átrio direito visivelmente distender e o coração pode tornar-se bradicardia. Isto é porque o ventrículo direito fica pressurizado. Se isto não ocorre, é provável que o pulmveias onary não são completamente obstruída, e a pré-carga que irá ser insuficiente para trabalhar o modo de coração. Se o coração não é capaz de manter o débito cardíaco após atrial esquerdo (AE) canulação e tentativa de transição para o coração (veja abaixo) de trabalho, considerar a colocação de clipes adicionais ou um laço ao redor dos troncos das veias pulmonares para ocluir qualquer vazamento residual. Uma vez que os APs são ocluídas, no entanto, Passo 5 deve ser efectuada imediatamente para minimizar a isquemia do miocárdio. Note-se que alguns investigadores incisão na artéria pulmonar antes da ligação das veias pulmonares para evitar a pressurização do ventrículo direito. </li><li> incisão arterial pulmonar <ol><li> Girar a cânula da aorta de modo a que o aspecto anterior do coração está de frente para o operador. Identificar a artéria pulmonar. Mais uma vez, esta artéria pode ser distendido. Com uma tesoura pequena fazer uma incisão transversal aproximadamente 3 mm acima da válvula pulmonar. NOTA: Este será imediatamente aliviar a pressão ea frequência cardíaca pode aumentar. Estarcausar esta cânula é fácil para desalojar, canular a artéria pulmonar após canulação do átrio esquerdo é completa. </li></ol></li></ol> 5. Atrial Esquerdo Canulação <ol><li> Girar a cânula da aorta de modo a que o átrio esquerdo está de frente para o operador. Usando as pequenas tesouras, fazer um 2 - mm incisão 3 na parte superior do corpo do átrio esquerdo, cerca de 3 mm acima do sulco atrioventricular. <ol><li> Posicione a cânula atrial esquerda perpendicular ao plano da válvula mitral e apontou para o septo atrial. </li><li> Abra a cânula LA KHB até que flui. Certifique-se de que a KHB é quente ao toque (fica frio rapidamente quando sentado em qualquer tubo não revestido), a fim de evitar a disfunção miocárdica devido à hipotermia seguinte transição para o modo de funcionamento. Transição para uma taxa de gotejamento durante a punção. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça para segurar contra-tração, insira a cânula atrial para o corpo do átrio esquerdo, tomando cuidado para não usar excessive força, que pode rasgar o átrio. NOTA: O LA cânula deve ser posicionado de modo que fica no meio do átrio sem qualquer tensão na parede atrial. </li><li> Passe uma sutura de seda 4-0 ao redor do corpo do átrio esquerdo e dê um nó para criar um selo do átrio ao redor da cânula. Ter o cuidado de assegurar que a face posterior do átrio esquerdo está incluído na sutura. Adicionar suturas adicionais, conforme necessário. Uma vez selado, puxar a cânula para trás 1 - 2 mm, de modo que fica no meio do átrio e não contra o septo auricular. NOTA: O motivo mais comum que o coração se torna malperfused na transição para trabalhar modo de coração é que a cânula LA confina com o septo atrial, que obstrui entrada do átrio esquerdo. O traçado LA muitas vezes muda de demonstrar uma adequada uma onda de onda e v quando a cânula é na posição correta (veja a Figura 2E). </li><li> Abrir a válvula de LA cânula para administrar inteiramente a pré-carga completa ao átrio esquerdo. monitorar otaxa de gotejamento do coração (que vem de efluentes coronária). Certifique-se de que a taxa de gotejamento não muda quando a cânula LA está aberta. Se isso acontecer, retie o átrio em torno da cânula, como descrito no passo 6.4, como tal representa uma fuga no sistema. </li></ol> 6. A canulação da artéria pulmonar e Transição para Trabalho Modo Coração <ol><li> Se a medição do consumo de oxigênio pelo miocárdio (ou outras substâncias em efluentes coronária, tais como os níveis da droga ou citocinas), insira 1/32 &quot;tubo flexível dentro da incisão antes na artéria pulmonar. NOTA: O consumo de oxigênio é medido como a diferença no teor de oxigénio entre perfusato atrial esquerda e efluentes artéria pulmonar 2. <ol><li> Para a medição contínua do consumo de oxigênio pelo miocárdio, usar um eletrodo de oxigênio in-line para comparar atrial esquerda e efluente do seio coronário. </li><li> Recolha efluente do seio coronário (tanto da artéria pulmonar e pingando do coração) em um cil formouinder para quantificação temporizada de fluxo coronário. </li><li> Calcule o consumo de oxigênio pelo miocárdio, como descrito anteriormente. 2 </li></ol></li><li> A transição para o trabalho modo de coração, desligando a bomba retrógrada da aorta. NOTA: Quando isto é feito, a pressão torna-se LA a pressão de pré-carga e o resistor que foi anteriormente proporcionando resistência à bomba retrógrada no modo de Langendorff proporciona agora resistência ao débito cardíaco, a criação de uma pressão arterial média. Se a pressão arterial média declina abaixo ~ 80 mmHg, a causa provavelmente está relacionado a qualquer pré-carga ou a função miocárdica. O problema mais provável é a cânula atrial esquerdo, que deve ser ajustada depois de reiniciar a bomba retrógrada. </li></ol> 7. Inserção do Ventrículo Esquerdo Cateter Volume Pressão NOTA: O cateter PV pode ser colocado quer retrógrada (através da válvula aórtica) ou através de punção apical. O benefício de retrógrada é que pOSIÇÃO é mais consistente e que obvia a necessidade de punção apical e os riscos concomitantes de lesão coronária ou perda de pré-carga. No entanto, a colocação retrógrada às vezes pode ser muito desafiador, por isso, descrevem ambas as técnicas aqui. <ol><li> Anexar um cateter 1,4 pressão-volume francês para o sistema de circuito de volume pressão. Calibrar o sistema em KHB quente de acordo com as instruções do fabricante. Assegurar a forma de onda é visível em tempo real. Traga o cateter e cabos perto da superfície do VE, de modo a não deslocar-lo após a colocação. </li><li> Para a colocação retrógrada, abra a válvula ajustável e alimentar o cateter PV gentilmente através da válvula aórtica até a pressão estável e forma de onda de volume são identificados. Evite o uso excessivo da força, que pode danificar a válvula aórtica ou perfurar o ápice ventricular. NOTA: Nós descobrimos que é importante para minimizar o comprimento da tubulação e número de voltas que o cateter PV deve navegar para abordar o AV. istopode ser útil para reduzir a tubagem que vem com o sistema. </li><li> Para a colocação apical, use um 24 G angio-cateter para criar uma punção apical no VE. Certifique-se de evitar a artéria descendente anterior coronária. Aponte a agulha na direcção da válvula aórtica do ápice ventricular. Avançar o cateter de pressão-volume no corpo da LV. Pare o avanço do cateter, logo que a pressão e o volume da forma de onda do LV é identificado. </li><li> Uma vez que o cateter de pressão-volume está no lugar, movimentar a camisa de água em posição à volta do coração. Fixar o cateter para a parede da camisa de água com um pequeno pedaço de fita adesiva. </li><li> Certifique-se de, pelo menos, um período de 30 min da estabilidade antes de iniciar quaisquer medidas ou intervenções. </li></ol> 8. A infusão de medicação <ol><li> (Opcional) infundir medicamentos (por exemplo, dopamina) para o bloco do átrio esquerdo, utilizando uma bomba de medicação padrão. NOTA: Temos medicamentos dosados ​​de acordo com o whole peso do corpo do animal desde que o fluxo equivalente a um débito cardíaco inteira passa através do bloco de fibrilação; apenas uma pequena porção desta passa através da circulação coronária, como faz in vivo. Alternativamente, um segundo conjunto de perfusato pode ser criada com uma concentração predefinida de medicação e utilizada para perfundir o coração. NOTA: Em nosso protocolo, nós infundir medicamentos ao longo de um período de 12 min, a coleta de dados fisiológicos durante a final de 10 minutos de cada infusão e comparando-o a um imediatamente anterior 10 min de base. </li></ol> 9. Manipulações fisiológicas <ol><li> Frequência cardíaca <ol><li> (Opcional) sutura dois fios de estimulação na parede do átrio direito e anexar a um dispositivo temporário de estimulação. NOTA: Este permite um controlo preciso da taxa cardíaca (acima da taxa sinusal nativa) e uma compreensão da relação entre a frequência cardíaca e da contractilidade independente de um medicamento cardiotónico. </li></ol></li><li> preload <ol><li> variar apré-carga (definido como o volume diastólico final do ventrículo esquerdo), variando a altura da coluna de alimentação do bloco átrio esquerdo. </li></ol></li><li> Pressão sanguínea <ol><li> Manipular a pressão arterial (o principal determinante da pós-carga neste modelo) usando as válvulas de pressão na IH-51. </li></ol></li><li> teor de oxigénio coronária <ol><li> Realizar vários graus de hipóxia miocárdica por perfusão do coração com KHB saturado em várias misturas de gases. Faça isso usando reservatórios encamisados ​​separados (cada um com a sua própria mistura de gás) para assegurar o equilíbrio entre o gás e KHB. </li><li> Realizar isquemia coronária por meio de sutura ligar uma artéria coronária distal. NOTA: A ligadura das artérias coronárias proximais no modo de coração de trabalho pode resultar em disfunção miocárdica letal. </li><li> Induzir isquemia coronária mundial, interrompendo ou retardando perfusão retrógrada por um período de tempo definido. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este modelo de coração de trabalho permite a avaliação do desempenho ventricular com controle total da pré-carga ventricular e pós-carga, tensão de oxigênio do perfusato, bem como a frequência cardíaca. Entre outros fatores, que permite a avaliação dos efeitos do miocárdio intrínsecas de medicamentos inotrópicos independentes da pós-carga e pré-carga, que maneiras que não são possíveis utilizando um modelo in vivo. Porque este modelo utiliza um perfusato cristalóide, que permite a avaliação do miocárdio sem interferência da hemoglobina, o que simplifica a análise espectroscópica de estados de energia do miocárdio, por exemplo. 14 Neste modelo, o átrio direito não é canulada como parte de nossa instrumentação, embora seja possível ao fazê-lo. Nós intencionalmente escolheu não fazê-lo, a fim de facilitar a amostragem de fluxo seio coronário para a avaliação do consumo de oxigênio pelo miocárdio. Importante, porém, o coração direito ainda executa o trabalho pressão e volume neste modelo, uma vez que as bombas de cosinus coronário fluir para dentro da cânula da artéria pulmonar. Fornecendo algum pré-carga do ventrículo direito melhora o posicionamento do septo ventricular e melhora o desempenho do ventrículo esquerdo, e é um componente importante deste modelo. 15 Existem várias armadilhas experimentais de mencionar. A primeira é a canulação retrógrada inicial, a qual deve ser executada de modo expedito (isto é, em menos de 2 min) para minimizar o período de isquemia. A habilidade mais importante mestre é o isolamento eficiente, preparação e manipulação da aorta ascendente. É importante que o coto aórtico não ser cortado excessivamente curto, deixando espaço suficiente para a canulação por cima da válvula da aorta. No entanto, também é importante que o coto aórtico não ser demasiado longo, o que pode causar torqueing da aorta em torno da cânula. Também é importante que a cânula da aorta e da raiz da aorta ser apropriadamente escolhidos de tamanho. Um excessivamente grande aorta em uma pequena cânula também podelevar a torqueing da raiz da aorta na cânula. A artéria subclávia direita normalmente tira da aorta ascendente aproximadamente 7 mm acima da válvula aórtica. Identificar os vasos braquiocefálicos (cerca de 1 mm de diâmetro) durante a dissecção e corte da aorta servem como marcos importantes para a incisão aórtica transversal. Aparar a aorta logo abaixo da decolagem do primeiro artéria inominada é aconselhável. A inclusão deste navio na raiz da aorta aparado geralmente leva a um vazamento de KHB e perda de pressão da raiz da aorta após a transição para o modo de funcionamento do coração. Outro aspecto tecnicamente desafiador de canulação é a canulação do átrio esquerdo. Embora seja possível para canular o apêndice atrial esquerdo, verificou-se que a cânula frequentemente fica preso dentro do apêndice, e não passar facilmente para dentro do corpo do átrio esquerdo. Assim, prefere-se fazer a incisão no corpo do átrio esquerdo, aproximadamente2 mm superior ao sulco atrioventricular. É importante para posicionar a cânula da auricula esquerda no plano correcto antes da inserção, a fim de evitar que se rasgue o átrio parede fina ao fixar a cânula. Verificou-se que o tamanho ideal da incisão átrio esquerdo foi de aproximadamente 3 mm. Criando muito pequena de uma incisão também pode fazer a colocação da cânula da auricula esquerda mais difícil, e pode levar à ruptura do átrio esquerdo. Nós usamos um 8 mm, peça reta, chanfrada do tubo de oxigênio-impermeável (diâmetro interno 2,9 mm) no bloco do átrio esquerdo. Verificou-se que utilizando este, em vez de uma cânula com um bordo chanfrado, leva a canulação fibrilação mais consistente e facilita o processo de fixação do bloco átrio esquerdo. Independentemente da tubagem utilizada, é importante para garantir que a extremidade do tubo não é obstruída pelo septo atrial ou a válvula mitral (como acima descrito, verificou-se que o traçado da pressão atrial esquerda foi útil neste Regard), como até mesmo sutil movimento da cânula atrial pode alterar significativamente a pré-carga do ventrículo esquerdo e medidas hemodinâmicas resultantes. Pela mesma razão, é importante para garantir que o átrio esquerdo não vaza seguinte após a abertura do bloco átrio esquerdo. É importante, independentemente do tipo de tubo utilizado para assegurar que o tubo dentro deste sistema é impermeável ao oxigénio para garantir a entrega de oxigénio adequado ao coração. Outro aspecto um desafio técnico do processo foi a colocação do cateter de pressão-volume (PV). Nós inicialmente favoreceu uma colocação retrógrada do cateter através do bloco da aorta. Embora tecnicamente viável, que encontramos a ser muito mais simples e conveniente para colocar o cateter PV através de punção transapical. Deve ser tomado cuidado para monitorizar a posição do cateter ao longo da duração da experiência, como por vezes o cateter pode mover-se dentro ou para fora do ventrículo esquerdo. Isto pode ser feito através da monitorização do pressuRe e traçados de volume ao longo do tempo. Finalmente, os cuidados devem ser tomados para garantir que a solução KHB é criado fresco para cada experimento. É possível pesar os constituintes de KHB e armazená-los em tubos cônicos em forma de pó antes do tempo. No dia da experimentação, estes podem ser misturados com água estéril, filtrada, dióxido de carbono / oxigénio, e, em seguida, adição de cálcio à mistura. É também importante para lavar o sistema com um detergente em pó activo da enzima, tais como Tergazyme (ou semelhante) e substituir o filtro perfusato regularmente. Vários limitações desta preparação experimental, devem ser observadas. Primeiro, semelhante a todas as preparações de Langendorff perfundido-cristalóides, KHB e outras perfusatos asanguinous têm um oxigênio diminuiu significativamente a capacidade de carga em relação ao sangue. Embora esta é parcialmente compensada através da vasodilatação coronária e fluxo coronário suprafisiológica, a preparação não é inteiramente physiologiC por esta razão. Em segundo lugar, devido à conformidade quase infinita da câmara Windkessel utilizado no presente instrumento, as pressões sistólica e diastólica são apenas minimamente separada (ver Figura 2A) e, assim, a pressão de perfusão coronária é não fisiológica. Isto pode ser superado em modelos futuros através da incorporação de um componente Elastância ao bloco de pós-carga. Em terceiro lugar, como com todas as preparações de coração isolado, o coração passa por um período definido (2-3 min) de isquemia quente, que é susceptível de criar lesão miocárdica ou disfunção. Minimizando esta lesão através da prática da técnica é de extrema importância para resultados representativos. Além disso, embora necessário para o bem-estar animal, os anestésicos inalados pode servir como um supressor do miocárdio no início do processo de reperfusão, embora seja esperado que este efeito é rapidamente abolida como o coração é reperfundidos com KHB. O sistema descrito permite trabalhar o coração para uma ampla variedade de Physiolinvestigações OGIC relevantes para a assistência ao paciente, pesquisa e ensino. Com algumas modificações adicionais, o sistema também pode ser utilizado para simular a fisiologia importante relevante para a doença cardíaca congénita, incluindo a hipertensão pulmonar e fisiologia único ventrículo. As limitações incluem a que é uma preparação ex vivo, que o coração está a ser perfundido por um tampão, em vez de um sangue de conteúdo de oxigénio mais elevado.

O estudo dos órgãos isolados permite o controle das condições fisiológicas além do que é possível in vivo. Ex vivo preparações de coração foram descritos pela primeira vez por Otto Langendorff, 1, que descreveu um modelo isolado com perfusão retrógrada. Posteriormente, outros descreveram o modelo &quot;working heart&quot;, em que o miocárdio executa tanto o trabalho de pressão e volume. 2 Estas preparações têm sido fundamentais para elucidar os mecanismos de ação do miocárdio, 3 metabolismo miocárdico, 4-6 e efeitos de medicamentos cardiotônicos. 7- 9 O uso de medicamentos que melhoram a contratilidade miocárdica é comum em pacientes criticamente enfermos. No entanto, poucos dados disponíveis comparando os efeitos relativos desses medicamentos na contratilidade e do consumo de oxigênio pelo miocárdio, os dados que podem ser úteis no tratamento de pacientes com sinais clínicos de insuficiência cardíaca de no cenário pós-operatória. 10 No entanto, porque a maioria dos medicamentos cardiotônicos afectam não só o miocárdio, mas também a resistência arteriolar, capacitância venosa 11, e da taxa metabólica de um paciente, 12 ex vivo modelos em corações isolados continuam a ser os meios ideais pelos quais a estudar os efeitos de tais medicamentos no miocárdio adequada. Descreve-se a utilização de um modelo ex vivo para o estudo independente da carga de fármacos inotrópicos na função do miocárdio e do consumo de oxigénio. Corações de ratos Sprague Dawley foram canulada usando um ventrículo esquerdo trabalhando modelo de coração e perfusão usando um perfusato Krebs Henseleit modificado. pressões da aorta e átrio esquerdo foram controlados. Pressão-volume cateteres de impedância foram colocadas no ventrículo esquerdo através de punção apical para a monitorização contínua da função sistólica e diastólica. O consumo de oxigênio foi continuamente medida como a diferença indexada no teor de oxigénio entre perfus do átrio esquerdocomeram e o efluente da artéria pulmonar. Os medicamentos a serem testados foram infundidas no bloco do átrio esquerdo, e alterações no metabolismo do desempenho cardíaco e oxigénio foram medidos e comparados com uma linha de base imediatamente anterior.

<table><tbody><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>8,401 g/4 L</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>0,744 g/4 L</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>1,580 g/4 L</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>0,578 g/4 L</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>0,220 g/ 4 L</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>27,584 g/4 L</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>7,208 g/4 L</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>1,470 g/4 L</td></tr><tr><td>Modelo de coração de trabalho biventricular</td><td>Harvard Apparatus</td><td>IH-51</td><td></td></tr><tr><td>Cateter de volume de pressão</td><td>Millar, Inc</td><td>SPR-944-1</td><td>Cateter com espaçamento de 6 mm usado</td></tr><tr><td>LabChart Pro 8</td><td>AD Instruments</td><td>Versão 8.1</td><td></td></tr></tbody></table>

roedor trabalho modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Modelos isolados de coração funcional têm sido usados para entender os efeitos das condições de carga, frequência cardíaca e medicamentos no desempenho miocárdico de maneiras que não podem ser realizadas in vivo. Por exemplo, os medicamentos inotrópicos geralmente também afetam a pré-carga e a pós-carga, impedindo avaliações independentes da carga de seus efeitos miocárdicos in vivo. Além disso, esse modelo permite a amostragem do efluente do seio coronário sem contaminação pelo retorno venoso sistêmico, permitindo a avaliação do consumo de oxigênio do miocárdio. Além disso, o advento de cateteres de pressão-volume miniaturizados permitiu a quantificação precisa de marcadores de desempenho sistólico e diastólico. Descrevemos um modelo no qual o ventrículo esquerdo pode ser estudado durante a realização de trabalho de volume e pressão sob condições controladas. 
Nesta técnica, o coração e os pulmões de um rato Sprague-Dawley (peso 300-500 g) são removidos em bloco sob anestesia geral. A aorta é dissecada livre e canulada para perfusão retrógrada com tampão de Krebs oxigenado. As artérias e veias pulmonares são ligadas e os pulmões removidos da preparação. O átrio esquerdo é então incisado e canulado usando uma cânula venosa separada, conectada a um bloco de pré-carga. Uma vez que isso é determinado como livre de vazamentos, o coração esquerdo é carregado e a perfusão retrógrada é interrompida, criando o modelo de coração funcional. A artéria pulmonar é incisada e canulada para coleta de efluentes coronários e determinação do consumo de oxigênio do miocárdio. Um cateter de pressão-volume é colocado no ventrículo esquerdo retrógrado ou por punção apical. Se desejado, fios de estimulação atrial podem ser colocados para um controle mais preciso da frequência cardíaca. Este modelo permite o controle preciso da pré-carga (usando um bloqueio de pressão do átrio esquerdo), pós-carga (usando um bloco de pós-carga), frequência cardíaca (usando fios de estimulação) e tensão de oxigênio (usando misturas de oxigênio dentro do perfusato).

Um diagrama esquemático de um coração totalmente instrumentada em perfusão retrógrada (Figura 1A) e no coração de trabalho ventricular esquerda (Figura 1B). Aórticas típica, átrio esquerdo e pressão ventricular esquerda e de volume traçados são mostrados na Figura 2A -. D A pressão típica diastólico final é de cerca de 3 - 5 mm Hg neste modelo, e o pico de pressão sistólica é de cerca de 100 mmHg Figura 2E mostra a mudança. no lado esquerdo rastreio fibrilação quando a cânula LA é movido para longe do septo atrial durante a colocação e posicionamento da cânula. Nestas experiências, a pressão aórtica foi fixado em 90 mm Hg, e a pressão LA foi ajustado para 10 mmHg. Para testar os efeitos das catecolaminas, cada parâmetro fisiológico (derivado principalmente a partir do cateter de pressão-volume e software associado) foi comparado com o que precede imediatamente<html> período de referência. No exemplo mostrado, a dopamina foi infundida a 15 ng / kg / min para dentro do bloco átrio esquerdo. Embora a pressão diastólica final é idêntica nas duas condições (dada a pressão atrial corrigido neste modelo), o volume diastólico final do ventrículo esquerdo diminui em 2,5%, e o volume sistólico final do ventrículo esquerdo diminui 4,9%, obtendo-se um aumento do volume sistólico (Figura 3A). Em comparação com as infusões de placebo, o trabalho ventricular esquerda acidente vascular cerebral, identificada como a área dentro da curva de pressão-volume, um aumento de 32% durante o tratamento com a dopamina (Figura 3B, P &lt;0,001, teste t, n = 10 por grupo). Isto foi associado com um maior aumento no consumo de oxigénio do miocárdio em relação ao placebo infusões (Figura 3C). Desta forma, os custos de energia e potência relativas de diferentes medicamentos cardiotónicos e doses pode ser comparado a um outro independente dos seus efeitos sobre as condições de carga. conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de Fluxo em um coração totalmente instrumentada em retrógrado perfusão e Modo Coração de Trabalho (Painel A: modo de Langendorff; Painel B:.. Modo de coração a trabalhar no modo retrógrado, KHB é infundida a uma pressão de ajuste de perfusão na raiz da aorta. este modo é utilizado para recuperar o miocárdio seguinte tempo de isquemia e durante a instrumentação. ao trabalhar modo de coração, perfusato flui através do coração esquerdo antes de perfusão da circulação coronária. neste modo, o miocárdio deve gerar sua própria pressão de perfusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" /> FIGURA 2: Pressão Representante e Desconto traçados obtidos durante as medições da linha de base. (A) Pressão na raiz aórtica, (B) a pressão atrial esquerda, (C) a pressão ventricular esquerda e (D) traçados volume ventricular esquerdo durante uma medida de referência são exibidos. O volume sistólico, trabalho acidente vascular cerebral, o débito cardíaco, tau, e outros parâmetros podem ser automaticamente calculado e exibida em tempo real pelo software. Um traçado embotada átrio esquerdo (E) associada a um débito cardíaco pobre no modo coração de trabalho pode ser um indício de que a cânula é mal posicionado no átrio esquerdo. Note que o v onda de destaque no traçado de pressão do átrio esquerdo bem colocado é comum, provavelmente devido a uma diminuição da complacência atrial esquerda no animal totalmente instrumentada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3: Efeito da dopamina. Sobre a pressão-volume Curva da infusão de dopamina resulta em um deslocamento para a esquerda na curva de PV (A), incluindo um aumento do volume da pulsação, diminuiu terminar volume sistólico, em comparação com as medições da linha de base. Note-se que a forma de alguns componentes destas curvas PV diferem daqueles tipicamente medida in vivo (ver Figura 4), ​​devido à ausência de pressão arterial e Elastância venosa. (B) relativa a uma linha de base imediatamente anterior, o trabalho de acidente vascular cerebral aumentou significativamente mais durante as infusões de dopamina do que o placebo (**, P = 0,0017, teste t), assim como o consumo de oxigénio do miocárdio (*, P = 0,013, t-teste, C). Usando esse modelo, o consumo de oxigênio do miocárdio médio na linha de base foi de 0,22 ± 0,02 mmol O2 / grama de tecido / minuto, utilizando um dissolv estimadoEd teor de oxigénio de 165 nmol / L em solução salina a 40 ° C. Tais medições podem ser usados ​​para comparar o consumo de oxigênio do miocárdio de vários medicamentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" /> Figura 4: Análise de Loops Desconto Pressão. The Loop Pressão-Volume teórico Mostrado descreve o ciclo normal cardíaca após o fechamento da válvula aórtica (AV) (1), a contração isovolêmica ocorre (1 - 2). Como a pressão ventricular cai abaixo da pressão atrial. A duração desta fase está representada por Tau. A válvula mitral (MV), em seguida, abre simultaneamente com a sístole auricular, o enchimento do ventrículo (2-3). Sístole, em seguida, começa com contracti isovolêmicaem (3-4) até que a pressão ventricular exceder a pressão arterial diastólica, momento em que o abre AV. Volume sistólico é a diferença entre as linhas 1 - 2 e 3 -. 4 trabalho acidente vascular cerebral é a área dentro da 1 - 2 - 3 -. Curva 4 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Modelos de coração de trabalho isolados podem ser usados para medir o efeito das condições de carga, frequência cardíaca e medicamentos no desempenho miocárdico e no consumo de oxigênio. Descrevemos métodos para a preparação de um modelo de trabalho do coração esquerdo de roedores que permite o estudo do desempenho sistólico e diastólico e do consumo de oxigênio sob várias condições.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo de coração isolado esquerdo em funcionamento que permita um controle preciso das condições de carga ventricular em roedores. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na fisiologia cardiovascular, incluindo os efeitos de medicamentos sobre a contratilidade miocárdica, desempenho têxtil e consumo de oxigênio. A principal vantagem desta técnica é que as condições de carga do coração podem ser controladas com precisão.A demonstração visual deste método é essencial, pois a dissecação e isolamento da aorta, granulação do átrio esquerdo e isolamento das veias pulmonares exigem habilidade e prática para serem dominados. Após sedação, analgesia e anticoagulação adequadas com heparina, inicie a cirurgia no rato doador. Primeiro, puxe a pele para longe da cavidade abdominal com pinça e use tesoura para incisar a cavidade peritoneal.Seguindo a curvatura do diafragma até o ângulo posterior das costelas. Assim que o diafragma ficar visível, use uma tesoura para cortar ao longo da superfície anterior do diafragma, alinhado aos cortes anteriores, a fim de acessar a cavidade torácica. Estenda cada corte ao longo da linha axilar bilateralmente até a axila.Em seguida, retrair a caixa torácica anteriormente a partir do processo xifoide usando pin&ccedil;as. Depois, fazer uma incis&atilde;o no peric&aacute;rdio e na pleura. Proceder com efici&ecirc;ncia, pois a ventila&ccedil;&atilde;o fica comprometida assim que o diafragma &eacute; incisado.Identifique a veia cava inferior e a aorta logo acima do diafragma e use pin&ccedil;as rombas para retrat&aacute;-las anteriormente. Em seguida, com tesouras curvas grandes, corte rapidamente a veia cava inferior e a aorta. Sem cortar a aorta ascendente, corte o es&ocirc;fago, a traqueia, as art&eacute;rias braquiocef&aacute;licas e as veias cefaladas.Em seguida, excise esses tecidos timicos juntamente com o coração e os pulmões sobre a placa. Imediatamente imerja o coração e os pulmões em KHB gelado e transfira para o aparelho de Langendorff. Coloque o conjunto coração-pulmão em uma cuba plana e oriente o coração com o timo e os grandes vasos voltados para o pesquisador.E o aspecto posterior dos pulmões voltado para a mesa. Em seguida, separe os dois lobos do timo e identifique a origem das artérias braquiocefálicas a partir da aorta. Agora, posicione a aorta sobre a borda do recipiente.Em seguida, usando tesoura pequena, seccionar a aorta aproximadamente cinco milímetros acima da válvula aórtica, logo proximal à origem da artéria subclávia direita. É necessário um corte transversal circular. Repetir o corte até que um corte adequado seja realizado.O microscópio por vídeo a seguir esclarece uma parte crítica deste procedimento, a dissecação e secção da aorta em preparação para a canulação. Conforme mostrado aqui, o timo deve ser dividido ao meio e se separará facilmente. Utilize movimentos suaves com pinças curvas para dividir o pericárdio e separar os tecidos ao redor da aorta.Evite o uso de força excessiva. O coto da artéria inominada deve ser identificado e segurado como um ponto de tração na aorta. Em seguida, a aorta deve ser incisada transversalmente com tesoura fina e afiada no ponto médio entre a válvula aórtica e a origem da artéria subclávia.Se o corte for feito muito alto, a aorta torna-se redundante e pode causar torção do coração ao redor da cânula. Alternativamente, o tampão de crampo pode vazar de um coto braquiocefálico. Se for muito curto, a ponta da cânula pode atravessar a válvula aórtica.Em seguida, com dois pares de pinças curvas, guie a aorta sobre a cânula aórtica, que deve estar gotejando KHB lentamente. A válvula aórtica deve ficar um a dois milímetros abaixo da ponta da cânula. Em seguida, reposicione as pinças perpendicularmente sobre a aorta para mantê-la no lugar.Uma pinça também pode ser usada. Em seguida, peça a um assistente que utilize fio de seda 4-0 para fixar a cânula com múltiplos nós em ambos os lados do coração. Agora, abra completamente a cânula para iniciar o fluxo aórtico retrógrado total.O coração deve bater com vigor. Uma das possíveis armadilhas é a ponta da cânula aórtica atravessar a válvula aórtica e penetrar no ventrículo esquerdo. Como mostrado aqui, se isso ocorrer, o coração parecerá pálido e a aurícula esquerda estará distendida.Isso deve ser imediatamente corrigido interrompendo brevemente o fluxo coronariano e reposicionando o coração sobre a cânula aórtica. Observe que o tecido aórtico é frágil em roedores e se rompe facilmente. Outra armadilha potencial é um vazamento na base da aorta, seja por um rompimento ou por um corte excessivamente alto na aorta, de modo que uma artéria braquiocefálica vaze KHB.Isso pode ser resolvido interrompendo o fluxo coronariano, removendo o coração da cânula aórtica e reposicionando. O objetivo desta etapa é criar um sistema fechado no qual toda a pressão do bloco de pré-carga seja transmitida às estruturas do coração esquerdo. A falha em ocluir completamente as veias pulmonares pode levar à perda de pré-carga, podendo criar uma preparação cardíaca instável ou falsificar os resultados.Gire manualmente a cânula aórtica para que a face posterior do coração esteja voltada para o operador. Agora, dissecione os vasos que levam ao pulmão esquerdo. Para facilitar o acesso aos vasos, use uma pinça para suspender o tecido do pulmão esquerdo.Em seguida, utilize um único clipe cirúrgico médio para ocluir a artéria e veia pulmonares esquerdas, bem como o brônquio. A seguir, resseque o pulmão esquerdo distal ao clipe. Repita agora o processo no pulmão direito.Quando ambas as artérias pulmonares estiverem completamente ocluídas, o átrio direito irá distender e o coração pode tornar-se bradicárdico. Conforme necessário, adicione clipes ou suturas adicionais para vedar vazamentos e trabalhe com eficiência. Agora, realize a incisão arterial pulmonar.Gire o cânula aórtica para acessar a face anterior do coração e identifique a artéria pulmonar. Usando uma tesoura pequena, faça uma incisão transversal cerca de três milímetros acima da válvula pulmonar. A artéria pulmonar poderá então ser cânulada em um passo posterior.Em seguida, cânule o átrio esquerdo. Ao visualizar o átrio esquerdo, use uma tesoura pequena para fazer uma incisão de dois a três milímetros na porção superior do átrio esquerdo, cerca de três milímetros acima do sulco átrio-ventricular. Em seguida, posicione a cânula do átrio esquerdo perpendicularmente ao plano da valva mitral, apontando em direção ao septo atrial.Abra a cânula anterior esquerda até que o KHB quente esteja visivelmente fluindo. Certifique-se de que o KHB esteja morno ao toque, pois caso contrário pode ocorrer hipotermia. Durante a cânulação, altere o fluxo do KHB para uma taxa de gotejamento.Agora, enquanto usa pin&ccedil;as para exercer tra&ccedil;&atilde;o contr&aacute;ria, insira a cânula atrial no corpo do &aacute;trio esquerdo. N&atilde;o use for&ccedil;a excessiva, pois o &aacute;trio &eacute; fr&aacute;gil. Posicione a cânula de modo que fique no centro do &aacute;trio, sem exercer tens&atilde;o sobre a parede atrial.Agora fixe a cânula ao átrio com um ponto de seda 4-0 colocado ao redor do corpo do átrio esquerdo, incluindo a região posterior do átrio esquerdo. Adicione pontos adicionais conforme necessário. Após selar, puxe a cânula de um a dois milímetros para trás, de modo que fique posicionada no centro do átrio, e não contra o septo atrial.Isso pode ser verificado observando a forma de onda do átrio esquerdo. Agora, abra completamente a válvula da cânula para administrar a pré-carga total ao átrio esquerdo. É fundamental monitorar a taxa de gotejamento do coração.Deve permanecer estável enquanto a cânula estiver aberta. Caso contrário, refaça o nó no átrio ao redor da cânula para selar o vazamento que provavelmente está causando o problema. Para medir substâncias no efluente coronariano, como gases, medicamentos ou citocinas, insira um tubo flexível na incisão na artéria pulmonar.Para permitir a medição contínua de pressão e volume, insira um cateter de condutância calibrado para pressão e volume no ventrículo esquerdo. O melhor método é de forma retrógrada, através da válvula aórtica. Embora, quando tecnicamente desafiador, também possa ser realizado por punção ventricular apical.O DPDT máximo deve ser de pelo menos 3500 a 4000 para um preparo adequado. Colete o efluente do seio coronário da artéria pulmonar e do coração em um cilindro graduado para quantificação temporal do fluxo coronariano. Agora, calcule o consumo miocárdico de oxigênio.Por fim, desligue a bomba aórtica retrógrada para transicionar para o modo de coração funcionando. Uma perfusão retrógrada foi preparada conforme descrito. Inicialmente, o fluxo foi retrógrado durante a configuração.Quando a bomba retrógrada foi desligada, o fluxo mudou para anterógrado, formando um coração funcional. A pressão típica ao final da diástole é de cerca de três a cinco milímetros de mercúrio neste modelo. E a pressão sistólica máxima é de aproximadamente 100 milímetros de mercúrio.Quando a cânula atrial esquerda foi afastada do septo atrial, pode-se detectar uma alteração no traçado do átrio esquerdo. Nestes experimentos, a pressão aórtica foi ajustada em 90 milímetros de mercúrio, e a pressão atrial esquerda foi ajustada em 10 milímetros de mercúrio. Em um experimento, dopamina foi infundida a 15 microgramas por miligrama por minuto no bloco atrial esquerdo.Embora a pressão diastólica final não tenha sido alterada, a dopamina causou uma redução de 2,5% no volume diastólico final do ventrículo esquerdo e uma redução de 4,9% no volume sistólico final do ventrículo esquerdo, resultando em um aumento do volume sistólico. Em comparação com infusões de placebo, o trabalho sistólico do ventrículo esquerdo, identificado como a área dentro da curva pressão-volume, aumentou em 32% durante o tratamento com dopamina. Isso também esteve associado a um aumento maior no consumo miocárdico de oxigênio.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 15 minutos se for realizada corretamente.

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