Name: Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a separar eletroforeticamente mucinas de alto peso molecular usando eletroforese em gel de agarose e western blot. Este método permite quantificar mucinas e avaliar seus estados poliméricos em amostras biológicas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. John Sheehan e à Dra. Lubna Abdullah por sua orientação e orientação que foram fundamentais para a conclusão deste trabalho. Este trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde (P01HL108808, UH2HL123645) e da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey é apoiada por uma bolsa de pesquisa em início de carreira do NHMRC.

1. Prepare tampões para mucina Gel Western Blotting <ol><li> Prepare 1 litro de tampão 50x TAE (Tris-acetato-EDTA). <ol><li> Em 700 ml de água destilada (dH2O) adicionar 242 g de Tris base (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso líquido) (0,2 M) e 14,61 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (50 mM). </li><li> Ajustar o pH para 8,0 e perfazer o volume a 1 litro com dH2O </li></ol></li><li> Preparar 10 ml de 10x tampão de carga. <ol><li> Prepare 5 ml de tampão 1 x TAE. Para fazer isso, adicionar 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), e 100 mg de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (1%). </li></ol></li><li> Prepare 2 litros de tampão 20x citrato de sódio solução salina (SSC). <ol><li> Em 1,5 litros de dH2O, adicionar 350,6 g de NaCl (3 M) e 176,4 g de citrato trissódico (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Ajustar o pH para 7,0 e levar o volume a 2 litros com dH 2 O. </li></ol></li><li> Prepare 1 litro de tampão 1 x TAE-SDS a 0,1%. <ol><li> Adicionar 20 ml de 50x TAE a 980 ml ​​de dH 2 O. Adicionar 1 g de SDS para fazer uma solução de SDS-TAE a 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. TAE-SDS Agarose Gel de Preparação <ol><li> (. Isto é, 150 ml) Pour volume suficiente de TAE 1X-SDS a 0,1% de tampão em um balão de Erlenmeyer de microondas para fazer uma 5 - gel de sete milímetros de espessura. Adicionar 0,8% (1,2 g) pó de agarose. </li><li> frasco de micro-ondas em intervalos de 30 seg com agitação intermitente, até estar completamente dissolvido de agarose (normalmente 1-3 minutos). Use almofadas de mão quentes durante este processo. Tenha cuidado com a fervura enquanto agita. </li><li> Permitir que a solução de agarose para esfriar por 5 - 10 min. Nota: A solução de agarose estará pronto para ser derramado quando fundo do balão pode ser deixado na palma da mão durante 5 seg. </li><li> Prepare a bandeja de fundição de electroforese (10 x 15 cm) por meio de selagem com as arestas da fita e colocando assim pentear em posição. </li><li> Pour solução de agarose lentamente em tele fundição bandeja para evitar a formação de bolhas. Remova as bolhas usando uma ponteira. Aguarde até que o gel para esfriar e completamente solidificar. Uma vez solidificado, remover o pente lentamente para evitar o colapso dos poços por sucção e remova a fita a partir das bordas do tabuleiro. </li><li> Coloque gel de agarose na caixa de gel e encher a unidade de electroforese com tampão% SDS 1x-0,1 TAE até que o gel é totalmente coberto. </li></ol> 3. Amostra de carga e Eletroforese Separação Nota: Em nosso laboratório, nós geralmente usam amostras de mouse e os seres humanos, incluindo fluido de lavado broncoalveolar (LBA; ambas as espécies), lavagem de células a partir de células humanas epiteliais brônquicas (HBE), e amostras de saliva e escarro humanos. As amostras podem ser desnaturada em ureia 6 M no momento da recolha ou armazenada por curtos períodos de tempo (6 horas) por adição de cocktail inibidor de proteinase. <ol><li> Preparar as amostras para carregar pela adição de 10% de corante de carregamento de cada amostra (isto é., 30 ul de amostra e trêsul de corante). Homogeneizar amostras pipetando cima e para baixo. Resumidamente girar tubos a 5000 rpm para recolher gotas. </li><li> carregar cuidadosamente igual volume de amostras nas cavidades. <ol><li> dicas pré-molhados e / ou utilizar pipetas de deslocamento positivo para facilitar o carregamento de amostras altamente viscosas. Lentamente aspirado de 80 - 90% de solução de amostra-corante (ou seja, 27-30 ul) para evitar bolhas de pipetagem. </li><li> carregar lentamente no fundo dos poços e mover progressivamente a ponta da pipeta para cima. Para as amostras que permanecem ligados à ponta da pipeta, dispensar a um ângulo de 45 ° e alongar linear acima do poço ou suavemente usar o lado do poço para quebrar o muco viscoso. Não sobrecarregue os poços. </li></ol></li><li> Ligar os eléctrodos a partir da caixa do gel para o gerador de energia electroforese. Assegurar que os eletrodos estão ligados correctamente (ie., Chumbo vermelho ligado à saída positiva do gerador) para permitir carregados negativamente mucinas a correr para o lado positivo<html> eléctrodo. </li><li> Submeter o gel a 80 volts durante 90 min para um único gel de pente, ou 60-75 minutos para um gel de pente duplo para evitar sobreposição entre as duas linhas. </li><li> Desligue a alimentação do gerador e desconectar os eletrodos da fonte de alimentação. </li><li> remover cuidadosamente o gel a partir da caixa do gel com uma mão em cada lado da bandeja de vazamento para assegurar o gel permanece no lugar. </li></ol> 4. Reduzir Agarose Gel para Transferência de mucina Eficiente <ol><li> Com cuidado, coloque o apartamento gel em um recipiente de vidro. Lavar o gel com dH2O para remover vestígios de tampão TAE-SDS. </li><li> Prepare 1 litro de tampão SSC 4x por adição de 200 ml de 20x SSC em 800 ml de dH 2 O. Adicione 200 ml de 10 mM de ditiotreitol (DTT) 4x SSC solução por adição de 309 mg de DTT fresco em 200 ml de tampão SSC 4x. </li><li> Mergulhe o gel com tampão e cobertura TDT-4x SSC. Agite suavemente durante 20 minutos (10 rotações por minuto). Lavar o gel com tampão de 4x SSC TDT-free. </li></ol>&quot;&gt; 5. Vácuo Assembleia Blotter e Transferência de exemplo a um Nitrocellulose Membrane <ol><li> Prepare mata-borrão de vácuo para a transferência. <ol><li> Cuidadosamente corte membrana de nitrocelulose em dimensões ligeiramente maior do que o gel (ie., 10 x 15 cm). </li><li> Esteira porosa molhado com dH2O e colocá-lo liso-lado-up no mata-borrão. </li><li> membrana de nitrocelulose molhado com tampão SSC 4x DTT-livre e colocá-lo no centro do tapete poroso. </li><li> Cubra a esteira porosa com a junta de borracha, deixando a abertura da junta precisamente alinhada com a membrana de nitrocelulose. Se esteira porosa é ainda visível, ajuste cuidadosamente a membrana para garantir que não haja lacuna permanece entre a junta e membrana. </li></ol></li><li> Coloque cuidadosamente o gel de agarose na parte superior da membrana. Certifique-se de formas de gel de uma vedação estanque com a junta e os poços do gel estão posicionados sobre a membrana de transferência. <ol><li> Evitar a formação de bolhas entre a membrana e o gel. Para minimizar oformação de bolhas, esguiche algumas gotas de 4x SSC tampão sobre a membrana e o gel deslizar de cima para baixo para lavar quaisquer bolhas formadas. Evitar mover o gel na membrana como proteínas começarão a blot imediatamente. </li></ol></li><li> cobrir cuidadosamente o gel com tampão de 4x SSC. </li><li> Comece a transferência de mucina por sucção. <ol><li> Vire mata-borrão de vácuo ON e pressão fixado em 40 - 50 mbar. Adicionar algumas gotas de tampão SSC 4x no gel a cada 5-10 minutos para evitar que o gel seque. transferência de correr por 90 min. Opcional: Após a conclusão, marque os poços com um lápis para orientação. </li></ol></li><li> Elimine o gel e recuperar membrana de nitrocelulose usando uma pinça de plástico na extremidade da membrana. </li></ol> 6. O bloqueio da membrana e Detecção <ol><li> Lavar membrana imediatamente com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS). Não deixe que a membrana secar. </li><li> Imergir a membrana em 50 mL de 3% de leite-PBS, tampão e o local de bloqueio numa rocker à temperatura ambiente durante 1 h. Após a incubação, descartar o tampão de bloqueio. </li><li> Mergulhe membrana na solução de anticorpo primário 1% de leite-PBS. Incubar a membrana na solução de anticorpo primário durante a noite num agitador rotativo a 4 ° C. Após a incubação, descartar a solução de anticorpo primário. Dilui-se os anticorpos primários para uma proporção de 1: 2000 de uma solução de anticorpo de tampão de bloqueio. Nota: Para as amostras provenientes de ratinhos, usamos UNC 222 de coelho anti-MUC5B e de cabra anti-Proteína Fluorescente Verde (GFP). Para amostras provenientes de seres humanos, usamos anticorpos primários H300 anti-MUC5B e 45M1 anti-MUC5AC. </li><li> membrana Lavar 3 vezes com PBS durante 10 min num agitador rotativo. </li><li> Imergir membrana em solução de anticorpo secundário 1% de leite-PBS. Dilui-se a anticorpos secundários para uma proporção de 1: 7500 de solução de anticorpo para tampão de bloqueamento e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora num agitador rotativo (por exemplo, 700 anti-coelho e anti-cabra 680.). Proteger da luz através da incubação de uma co não transparententainer. Descartar a solução de anticorpo secundário após 1 h. </li><li> membrana Lavar 3 vezes com PBS durante 5 min. Enxágüe membrana com dH2O para remover o sal. </li><li> Leia a membrana de um sistema de fluorescência de infravermelhos de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol>

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<li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+%7Bbeta%7D-epithelial+Na%2B+channel-overexpressing+mice%3A+role+of+TNF-%7Balpha%7D+and+IL-4R%7Balpha%7D+signaling%2C+influence+of+neonatal+development%2C+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li>
<li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li>
<li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li>
<li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li>
<li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm qualquer conflito de divulgar.

O protocolo de mucina transferência de Western descrito neste vídeo combina técnicas convencionais utilizados em biologia molecular para separar e transferir grandes macromoléculas, tais como ADN, com técnicas normais para a detecção da proteína, isto é., Imunotransferência. A mesma técnica pode ser aplicada para estudar a biologia dos glicosaminoglicanos complexas, tais como a desagregação de alta peso molecular do ácido hialurónico 18. Embora esta técnica poderia ser utilizada numa vasta gama de en...

As mucinas são normalmente produzidos por superfícies mucosas que revestem as cavidades expostas ao ambiente exterior (por exemplo., Respiratório, digestivo, reprodutivo, extensões da superfície ocular), bem como os órgãos internos (por exemplo, pâncreas, vesícula biliar, glândulas mamárias). A presença destas glicoproteínas mantém a hidratação da superfície e forma uma barreira física contra os agentes patogénicos. Embora a produção de mucina é essencial para a saúde das mucosas, hiper-concentração de mucina e / ou as propriedades do muco aberrantes pode conduzir a obstrução do canal, a colonização bacteriana e inflamação crónica, o que pode causar danos irreversíveis. Uma cascata semelhante de eventos são observados em várias doenças, por exemplo., Fibrose cística 1, otite média crônica 2 e infecção cérvico-3. Portanto, é importante para entender o papel de mucinas na saúde e na doença e para estabelecer protocolos de rotina para a identificação de proteínas. A data, 19 genes mucinas foram identificados e codificam para cadeias polipeptídicas grandes que variam de 1.200 (por exemplo., MUC-1) a 22.000 (por exemplo, MUC16) aminoácidos. A família de genes de mucina pode ser dividido em dois subtipos: as mucinas associadas a membranas, envolvidas na sinalização celular e a superfície de blindagem, e as mucinas de formação de gel, responsáveis ​​pelas propriedades viscoelásticas dos geles de muco. mucinas associadas a membranas são principalmente monomérico e atribuem às superfícies das células através de um domínio que atravessa a membrana hidrofóbica. Em contraste, as mucinas de formação de gel possui vários domínios -como e rica em cisteína do factor de von Willebrand (vWF), que são essenciais para a formação de redes poliméricas dinâmicas. Grandes glicanos estão ligados a serina e treonina distribuídos por todo o apomucin. Estes oligossacáridos ligados em O densas pode contribuir-se para 80% do peso molecular 4. Intra- e inter-molecular de ligações dissulfureto que ligam os monómeros de mucina assegurar a integridade do gel de mucina network. Como resultado de glicosilação pesada e multimerização, mucinas encontram-se entre as moléculas maiores no mundo animal e não podem ser analisados ​​por electroforese em gel padrão através de gel de SDS-PAGE de poliacrilamida convencional e escadas de proteína padrão. Estes métodos / resolver proteínas separadas com pesos moleculares menores do que 250 kDa, enquanto os monómeros de mucina pode atingir até 2 MDa no caso de MUC16. No entanto, as escadas de proteína de alto peso molecular podem ser utilizados para estudar pequenas monómeros de mucina (isto é., A MUC1). Uma variedade de técnicas pode ser aplicado para estudar tamanho mucina, conformação e interacção. Tradicionalmente, a caracterização bioquímica das mucinas é realizado por mucina isolamento através de centrifugação isopícnica em gradiente de densidade em tampão de desnaturação, seguida de cromatografia de exclusão de tamanho e imunodetecção (por ex., Slot blotting) 5. e / ou dispersão de luz multi-ângulo dinâmico fornecer informações sobre o estado oligomérico de amostras ricas em mucina &lt;sup&gt; 1. Além disso, uma centrifugação zonal acoplado com imunodetecção e microscopia electrónica de transmissão são comumente usados ​​para determinar a conformação de macromoléculas de mucinas 6. A espectrometria de massa é também utilizado para quantificar as mucinas, detectar a clivagem proteolítica e analisar a composição 1,7,8 oligossacárido. Tais técnicas são dispendiosas, demoradas e frequentemente exigem grandes volumes e / ou altas concentrações de amostra. A metodologia aqui descrita, isto é., Mucina separação por electroforese, é reprodutível, de baixo custo e pode ser utilizado em estudos de alto rendimento para fornecer quantificação relativa e mucina investigar montagem polímero. No entanto, este ensaio necessita de alta afinidade, anticorpos de mucina de alta especificidade que pode não estar disponível para mucinas raras (ex., MUC19) ou certas espécies (por exemplo., Porco, furão). Western blotting de agarose é adequado para resolver uma grande variedade de amostras ricas em mucina com Concentrações que variam de 50 ug / ml (por exemplo., células de lavagens) a 5 mg / ml (por exemplo., expectoração). Este ensaio foi introduzida nos anos 1990 e só foi efectuado em alguns laboratórios especializados 9,10. Inicialmente, esta técnica permitiu identificar subpopulações de monómeros de mucina nas secreções respiratórias humanas 11,12 e confirmou o processo de oligomerização de células caliciformes, que consiste de formação de dímeros no retículo endoplasmático seguido por dímero de multimerização no aparelho de Golgi 13. Mais recentemente, a geração de anticorpos policlonais contra mucinas murino facilitou os estudos em modelos animais pequenos (por exemplo., Mucina modelos de ratos deficientes, βENaC, OVA-desafiado) e abriu um novo campo de pesquisa para estudos pré-clínicos compostos de teste farmacológico destinadas a remover o muco os pulmões 14-17. Como resultado de um crescente interesse em biologia mucina e a geração de novos, os anticorpos de mucina mais específicos, descrevemos herein a metodologia para separar mucinas por electroforese em gel de agarose, transferência para nitrocelulose e vácuo de duas cores detecção fluorescente no infravermelho.

<table><tbody><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6060-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-100g</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>L</td></tr><tr><td>Azul de Bromofenol</td><td>Sigma</td><td>114391-5g</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)</td> <td>Sigma</td><td>L6026-50g</td><td>50 g</td></tr><tr><td>20x SSC (Citrato Salino de Sódio) Tampão</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Citrato Trissódico (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>10 mM DTT (ditiotreitol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de leite em pó</td><td>Saco</td><td></td><td>Leite em pó instantâneo desnatado</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Anticorpo primário de cabra anti-GFP (amostras de camundongo)</td><td>Anticorpos e ensaios Rockland</td><td>600-101-215</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>UNC 222 Anti-Muc5b Anticorpo primário de coelho (amostras de camundongo)</td><td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários anti-MUC5B H300 (amostras humanas)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-20119</td><td>200 &#956; g</td></tr><tr><td>45M1 Anticorpos Primários Anti-MUC5AC (amostras humanas)</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td>100 &#956; g</td></tr><tr><td>Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0,5 mg</td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0,5 mg</td></tr><tr><td>Caixa de Gel de Eletroforese e Bandeja de Fundição</td><td>Sistemas de Separação</td><td></td><td></td>de Coruja</tr><tr><td>Caixa de Fonte de Alimentação</td><td>Biorad</td><td>Modelo 200/20</td><td></td></tr><tr><td>Papel Absorvente de Membrana</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>10600016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de papel e nitrocelulose Whatman</td><td>GE&nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Sistema de Fluorescência Infravermelha</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mucina agarose gel eletroforese: western blotting para glicoproteínas alta peso molecular

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucinas, as proteínas altamente glicosiladas que revestem as superfícies das mucosas, evoluíram como um componente chave da defesa inata, protegendo o epitélio contra patógenos invasores. O principal papel destas macromoléculas é facilitar aprisionamento de partículas e ao promover a lubrificação depuração da mucosa. Durante a síntese de proteínas, mucinas submetidos a intensa O-glicosilação e multimerização, o que aumenta drasticamente a massa e tamanho destas moléculas. Estas modificações pós-translacionais são essenciais para as propriedades viscoelásticas do muco. Como um resultado da natureza bioquímicas e biofísicas complexo destas moléculas, que trabalha com mucinas fornece muitos desafios que não podem ser superadas por meio de métodos convencionais de análise de proteína. Por exemplo, o seu elevado peso molecular evita a migração electroforética através de géis de poliacrilamida regulares e a sua natureza pegajosa promove a adesão a uma tubagem experimental. No entanto, a investigar o papel de mucinas na saúde(Por ex., Manter a integridade da mucosa) e doenças (por ex., Hiper-concentração, mucostasis, cancro) recentemente ganhou interesse e mucinas estão a ser investigados como um alvo terapêutico. Uma melhor compreensão da função e produção de mucina macromoléculas pode conduzir a novas abordagens farmacêuticas, por exemplo, inibidores da exocitose da mucina do grânulo e / ou agentes mucolíticos. Portanto, protocolos consistentes e confiáveis ​​para investigar a biologia mucina são fundamentais para o avanço científico. Aqui, descrevemos métodos convencionais para separar macromoléculas de mucina por electroforese usando um gel de agarose, a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose, e detectar o sinal com anticorpos específicos de mucina, bem como leitor de gel fluorescente no infravermelho. Estas técnicas estão amplamente aplicável para determinar a quantificação de mucina, a multimerização e para testar os efeitos dos compostos farmacológicos sobre mucinas.

Nós mostramos resultados representativos de expressão de mucina a seguir a electroforese em gel de agarose na LBA dos pulmões de ratinhos (Figura 1). Neste exemplo, utilizou-se o gel de agarose a mostrar sobre-regulação de produção de mucina na sequência de IL-13 de tratamento do modelo de ratinho Tg-MUC5AC. O Western blot mostra uma representação visual de expressão de mucina, o qual pode ser usado para a análise quantitativa de multímero ou intensidade de sinal de band...

Mucinas são glicoconjugados de alto peso molecular, com tamanho variando de 0,2 a 200 megadalton (MDa). Como resultado de seu tamanho, as mucinas não penetram nos géis convencionais de poliacrilamida e requerem poros maiores para separação. Fornecemos um protocolo detalhado para eletroforese em gel de mucina agarose para avaliar a quantificação relativa e estudar a montagem do polímero.

Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

O objetivo geral dessa técnica de western blot para glicoproteínas de alto peso molecular é separar eletroforeticamente as mucinas contidas em amostras ricas em muco. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia das mucinas, como investigar o estado polimérico e as concentrações relativas de mucinas específicas obtidas de diversas superfícies mucosas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de estabelecer, tem custo relativamente baixo e exige equipamentos laboratoriais mínimos.Demonstrará este procedimento Sophia Samir, especialista em pesquisa do meu laboratório. Inicie o experimento preparando o gel. Despeje 150 mililitros de tampão TAE 1x com SDS 0,1% em um erlenmeyer próprio para micro-ondas para fazer um gel com espessura de seis milímetros e adicione 1,2 grama de pó de agarose.Coloque o frasco no micro-ondas em intervalos de 30 segundos com agitação intermitente até que a agarose esteja completamente dissolvida. Deixe a solução de agarose esfriar por até 10 minutos. Em seguida, coloque uma bandeja de moldagem para eletroforese de 10 por 15 centímetros em um molde para géis.Despeje lentamente a solução de agarose e posicione os pentes. Remova quaisquer bolhas que possam ter se formado com a ponta de uma pipeta e, em seguida, deixe o gel esfriar e solidificar. Após o gel ter solidificado completamente, remova o pente lentamente para evitar que os poços desmoronem e retire a bandeja do moldador de gel.Coloque o gel na cuba e encha a unidade de eletroforese até que o gel esteja completamente coberto. Adicione 10% de corante de carregamento a cada amostra. Homogeneíze as amostras pipetando para cima e para baixo.Em seguida, centrifugue brevemente os tubos a 5000 RPM para recolher as gotículas. Depois, utilize pipetas de deslocamento positivo para facilitar o carregamento das amostras altamente viscosas. Aspire lentamente de 80 a 90 por cento da amostra para evitar bolhas durante a pipetagem.Carregue lentamente a partir da parte inferior do poço e mova progressivamente a ponta da pipeta para cima. Para amostras que permanecem aderidas à ponta da pipeta, libere em um ângulo de 45 graus e alongue diretamente acima do poço ou use suavemente a lateral do poço para romper o muco fibroso. O carregamento preciso de amostras viscoelásticas pode ser desafiador, pois o muco adere inerentemente às pontas de carregamento.Além disso, a força de flutuação exercida pelo tampão sobre o muco pode deslocar totalmente ou parcialmente o volume carregado para fora dos poços. Execute o gel a 80 volts durante 60 a 75 minutos para um gel com pente duplo, a fim de evitar sobreposição entre as duas fileiras. Após o gel ter corrido uma distância adequada, desligue a fonte de alimentação e desconecte os eletrodos da fonte de energia.Remova cuidadosamente o gel da caixa de eletroforese com uma mão em cada lado da bandeja de moldagem para garantir que o gel permaneça no lugar. Coloque cuidadosamente o gel em posição plana dentro de um recipiente de vidro. Em seguida, enxágue o gel com água destilada para remover traços do tampão TAE SDS.Encharque o gel com o tampão DTT 4x SSC previamente preparado e cubra o gel. Em seguida, agite suavemente o gel a 10 rotações por minuto. Após agitar por 20 minutos, enxágue o gel com tampão 4x SSC livre de DTT.Prepare o blotter a vácuo para a transferência cortando cuidadosamente a membrana de nitrocelulose um pouco mais larga que o gel. Umedeça um suporte poroso com água destilada e coloque-o com o lado liso voltado para cima no blotter. Umedeça e coloque duas camadas de papel Whatman no centro do suporte poroso.Umedeça uma membrana de nitrocelulose com tampão 4x SSC livre de DTT e coloque-a sobre o papel Whatman. Cubra a malha porosa com uma junta de borracha, deixando a abertura da junta alinhada precisamente com a membrana de nitrocelulose. Se a malha porosa ainda estiver visível, ajuste cuidadosamente a membrana para garantir que não reste nenhuma folga entre a junta e a membrana.Umedeça a membrana de nitrocelulose com meio SSC livre de DTT. Coloque cuidadosamente o gel de agarose sobre a membrana. Certifique-se de que o gel forme um selo hermético com a junta e de que os poços do gel estejam posicionados sobre a membrana para a transferência.Durante toda a transferência da proteína, certifique-se de manter um selo apertado entre o gel de agarose e a membrana de nitrocelulose. Uma vez que o gel é colocado sobre a membrana, não mova nem ajuste o gel e mantenha-o bem hidratado. Para minimizar a formação de bolhas, borrife algumas gotas de tampão 4x SSC sobre a membrana e deslize o gel de cima para baixo para remover quaisquer bolhas formadas.Cubra cuidadosamente o gel com tampão 4x SSC. Inicie a transferência de mucina ligando o blotter a vácuo por 90 minutos. Adicione algumas gotas de tampão 4x SSC sobre o gel a cada cinco a 10 minutos para evitar que o gel seque.Após a conclusão, marque os poços com um lápis para orientação. Descarte o gel e retire a membrana de nitrocelulose com pinças plásticas pela borda da membrana. Enxágue imediatamente a membrana com solução salina tamponada com fosfato 1x ou PBS.Imersa a membrana em 15 mililitros de tampão bloqueador de PBS com 3% de leite e coloque-a em um agitador na temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, descarte o tampão bloqueador. Em seguida, imersa a membrana em solução de anticorpo primário de PBS com 1% de leite e incube a membrana durante a noite em um agitador a quatro graus Celsius.Após a incubação, descarte a solução de anticorpo primário. Em seguida, lave a membrana com PBS sob agitação. Transfira a membrana para um recipiente opaco e imerja-a em solução de anticorpo secundário em PBS com 1% de leite, incubando a membrana à temperatura ambiente por uma hora em agitador.Após a incubação, descarte a solução de anticorpo secundário. Lave a membrana três vezes com PBS, durante cinco minutos cada. Por fim, enxágue a membrana com água destilada para remover o sal.Este ensaio de Western blot mostra a superexpressão das proteínas Muc5ac e Muc5b nos fluidos de lavagem broncoalveolar de camundongos desafiados com IL-13 em comparação com camundongos controle. Uma análise quantitativa mostra que a superexpressão foi 5,1 vezes maior em relação aos camundongos tratados com PBS. A eletroforese em gel de agarose para mucina foi utilizada para demonstrar a redução de polímeros de mucina em monômeros após tratamento com concentrações crescentes de DTT.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de confirmar a especificidade do anticorpo antes de estudar uma mucina específica. Para testes farmacológicos, é fundamental examinar o impacto que reagentes químicos podem ter no reconhecimento do epítopo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular amostras viscoelásticas e determinar o estado polimérico das mucinas e sua quantificação relativa.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo técnico descreve um procedimento de western-blotting usando o padrão disponível comercialmente NuPAGE sistema de eletroforese Mini-Gel da Invitrogen.

Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Este vídeo demonstra o procedimento de separação de sulfatos de heparano isolados de tecido pulmonar de camundongo usando eletroforese em gel de poliacrilamida.

Eletroforese em gel de poliacrilamida: uma técnica analítica para detectar sulfatos de heparano de diferentes comprimentos de cadeia isolados de tecido pulmonar de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica de separação desnaturante baseada em poliacrilamida para proteínas. Essa técnica auxilia na identificação preliminar de proteínas com base em seus pesos moleculares.

Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio para análise de proteínas: uma técnica para separar e visualizar proteínas com base no peso molecular

Neste vídeo, demonstramos um método de eletroforese em gel bidimensional que separa proteínas individuais de uma mistura complexa de proteínas obtida de tecidos tumorais de adenoma hipofisário humano não funcional (NFPA). As proteínas são separadas com base em sua carga elétrica na primeira dimensão e posteriormente separadas com base em pesos moleculares na segunda dimensão.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

O avanço do western blotting usando fluorescência permitiu a detecção de mudanças sutis na expressão de proteínas, permitindo análises quantitativas. Aqui descrevemos uma metodologia robusta para detecção de uma variedade de proteínas em uma variedade de espécies e tipos de tecido. Uma estratégia para superar problemas técnicos comuns também é fornecida.

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

Este artigo descreve um protocolo simples e rápido para avaliar o estado oligomérico da proteína GTPase MxA semelhante à dinamina de lisados de células humanas usando uma combinação de PAGE não desnaturante com análise de western blot.

Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

Aqui usamos a eletroforese em gel de agarose semi desnaturação bidimensional para confirmar a presença de amiloide-como fibras de tamanho heterogêneo e excluir a possibilidade de que a heterogeneidade de tamanho é devido à dissociação das fibras de amiloides durante o gel processo em execução.

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Este protocolo descreve vários métodos que podem ajudar no estudo da biologia da ATG9A, incluindo imunofluorescência seguida de análise de imagem, considerações de superexpressão transitória e investigação do estado de glicosilação da ATG9A usando western blot.

Imagem ATG9A, uma proteína de membrana multi-spanning

Aprenda a separar eletroforeticamente mucinas de alto peso molecular usando eletroforese em gel de agarose e western blot. Este método permite quantificar mucinas e avaliar seus estados poliméricos em amostras biológicas.

Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular

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