Implantação e Gravação do Wireless Eletrorretinograma e Visual Potencial Evocado em ratos conscientes

O objetivo geral deste procedimento é medir sinais ERG e VEP conscientes após a implantação cirúrgica de sondas de telemetria sem fio. Essa técnica pode ajudar a responder a questões-chave na região do campo da neurociência, como como os neurônios se comportam sem a limitação da anestesia geral em condições saudáveis e em estado de doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o registro simultâneo da eletrofisiologia para a retina e para o córtex visual em animais conscientes.

Para iniciar este procedimento, prepare os eletrodos ao microscópio. Para fazer isso, destorça um eletrodo de aço inoxidável de fita dupla com dois alicates de ponta fina. Apare um dos fios de aço inoxidável a aproximadamente um centímetro da ponta, deixando um único fio reto mais longo para moldar o eletrodo do anel.

Em seguida, dobre o único fio de aço inoxidável de volta para si mesmo e gire para formar um anel liso na ponta do eletrodo. Em seguida, molde um eletrodo ativo ERG torcendo a base do loop para formar um círculo com um diâmetro do ponto dois ao ponto cinco milímetros. Para os dois eletrodos inativos do ERG e um VEP inativo, faça o diâmetro do loop apontar oito milímetros.

Neste exemplo, prepare um ERG ativo e três eletrodos inativos. Depois disso, prenda o eletrodo ativo VEP circular em torno de um parafuso de aço inoxidável para que o eletrodo fique encostado na cabeça do parafuso. Em seguida, prenda os três eletrodos inativos em torno de um segundo parafuso de aço inoxidável.

O eletrodo de aterramento irá diretamente para a cavidade peritoneal e não há necessidade de fazer um laço na ponta. Depois de raspar e desinfetar o local cirúrgico de um animal anestesiado, faça uma incisão de 10 milímetros na cabeça ao longo da linha média entre as orelhas com um bisturi cirúrgico. Em seguida, faça uma incisão de cinco milímetros no abdômen através da camada de pele, ao longo da linha média abaixo do esterno.

Em seguida, tunelar uma cânula de cinco milímetros de diâmetro por via subcutânea, desde a incisão do abdome até a incisão da cabeça. Alimente os fios do eletrodo do tansmitter através da cânula do abdômen até a cabeça. Deixe o eletrodo de referência com a base do transmissor.

Em seguida, cubra todas as pontas dos eletrodos com gaze asséptica. Em seguida, prenda a cabeça do rato em uma plataforma estereotáxica. Estenda a incisão da testa para 30 milímetros com tesoura cirúrgica.

Em seguida, exponha uma área cirúrgica retraindo a pele com duas suturas. Raspe o periósteo que cobre o crânio para expor as suturas de bregma, lambda e linha média. Posteriormente, faça dois furos no crânio nas coordenadas estereotáxicas VEP ativa e ERG, VEP inativa.

Prenda os eletrodos ativos e inativos com parafusos de aço inoxidável ao crânio com cerca de um milímetro de profundidade. Para implantar os eletrodos ativos do ERG, use uma sutura para retrair temporariamente a pálpebra superior do olho. Em seguida, insira uma cânula de calibre 16 a 21 por via subcutânea por trás do olho através do fórnice conjuntival superior até a testa.

Em seguida, remova a agulha guia. Em seguida, alimente o eletrodo ativo através de um cateter plástico da testa em direção ao olho. Em seguida, remova o cateter de plástico.

Use uma sutura temporária, que é enfiada através do laço do eletrodo para evitar que o eletrodo se retraia de volta para o túnel. Depois disso, faça uma incisão pontual de cinco milímetros na conjuntiva superior um milímetro atrás do limbo. Use dissecção romba para expor a esclera subjacente.

Em seguida, implante uma sutura imediatamente atrás do limbo com metade da espessura escleral e tome cuidado para não perfurar o globo ocular. Em seguida, remova a sutura temporária do eletrodo ativo do ERG. Ancore o eletrodo ativo ERG à sutura de meia espessura escleral amarrando três nós consecutivos e certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja situada perto do limbo para uma boa relação sinal-ruído.

Se necessário, puxe o excesso de eletrodo para trás para que o eletrodo ativo não colida com a córnea. Em seguida, feche o retalho conjuntival usando uma a duas suturas interrompidas para cobrir completamente o eletrodo ERG. Depois, remova a sutura retrátil da pálpebra.

Repita o procedimento para o olho contralateral. Agora, aplique gel de cianoacrilato sobre o crânio para prender todos os parafusos de aço inoxidável e fios de eletrodo. Certifique-se de que os eletrodos ativos do ERG não sejam puxados com força antes de serem fixados para permitir os movimentos oculares.

Em seguida, feche a incisão usando suturas interrompidas. Em seguida, gire o roedor para expor a área abdominal. Estenda a incisão dérmica abdominal para 40 milímetros ao longo da linha alba com tesoura cirúrgica.

Depois disso, faça uma incisão de 35 milímetros através da parede muscular interna, para expor a cavidade abdominal interna. Usando duas suturas, prenda o corpo do transmissor à parede abdominal interna do animal à direita e evite entrar em contato com o fígado. Dobre o eletrodo de aterramento prendendo-o em um laço com duas suturas e coloque-o, flutuando livremente, na cavidade abdominal junto com os outros eletrodos.

Em seguida, feche o peritônio com uma sutura contínua. Em seguida, feche a incisão na pele usando suturas interrompidas. Para registrar sinais adaptados ao escuro, os animais são adaptados ao escuro por 12 horas e todos os procedimentos são realizados em uma sala escura com o auxílio de luz vermelha fraca.

Para fins ilustrativos, as gravações serão realizadas em condições normais de iluminação da sala aqui. Antes de registrar, aplique anestesia tópica e gotas dilatadoras na córnea do rato. Em seguida, guie o animal consciente para um limitador transparente e personalizado.

Coloque o rato na frente da tigela Ganzfeld com os olhos alinhados com a abertura da tigela. Ligue o transmissor interno passando um ímã a cinco centímetros dele. Verifique se o transmissor está ligado verificando a luz de status do LED na base do receptor.

Feche a gaiola de Faraday que abriga a almofada do receptor para melhorar a relação sinal-ruído. Em seguida, colete sinais em uma faixa de energias luminosas. Esta figura mostra as formas de onda ERG em ratos conscientes no sétimo dia após a cirurgia.

As respostas do ERG foram registradas na faixa de energia do estímulo com a resposta ao flash fraco mostrado na parte inferior e o flash mais brilhante na parte superior. No dia 28 após a cirurgia, essas formas de onda permaneceram semelhantes às do sétimo dia. Ao longo de quatro semanas, não houve efeito significativo no tempo para a amplitude e sensibilidade dos fotorreceptores.

Amplitude e sensibilidade da célula bipolar do bastonete. Amplitude da célula bipolar do cone. E tempo implícito.

Da mesma forma, as formas de onda VEP parecem ser comparáveis sete e 28 dias após a cirurgia. Com parâmetros de amplitude e tempo não mostrando efeito de tempo significativo. Esses resultados indicaram estabilidade robusta do sinal ERG e VEP.

Uma vez dominado, o componente cirúrgico da técnica será concluído em uma hora e meia a duas horas. O componente de gravação consciente, se pré-executado corretamente, pode ser concluído em 45 minutos. Após este procedimento, outros métodos como farmacológico ou manipulação de doenças também podem ser realizados.

Isso responderá a perguntas adicionais na descoberta de medicamentos, bem como em experimentos longitudinais crônicos. Além disso, este procedimento também pode ser realizado em outros animais, se necessário. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implantar cirurgicamente e, posteriormente, medir sinais de telemetria ERG e VEP conscientes.