Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência
13 de julho de 2016
A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.
O objetivo geral desta técnica é processar com eficiência longas seções de tecido intestinal de camundongo para coloração histológica uniforme ao longo de seu comprimento. Para obter as seções intestinais, pode haver variações na coloração ao longo de todo o comprimento do intestino. Tentei utilizar a técnica padrão de rolamento suíço, mas descobri que ela produz tecido intestinal muito rígido e difícil de abrir.
Com alguma experimentação, criei um método de fixação rápida que usa produtos químicos menos tóxicos e que permite um rolamento suíço muito melhor do tecido intestinal. O fixador modificado pode ser usado para fixar rapidamente outros tecidos espessos. Na preparação, eutanasiar o animal de teste de acordo com o protocolo de texto e preparar o ambiente cirúrgico.
Para começar, use pinças de dissecção e tesouras para fazer uma incisão lateral no meio do abdômen cerca de um a dois centímetros abaixo da caixa torácica, dependendo do tamanho do mouse. Em seguida, separe suavemente e corte a pele para expor os músculos abdominais. Em seguida, segure e puxe os músculos para cima sem segurar ou puxar os intestinos.
Em seguida, faça cuidadosamente uma incisão inicial nos músculos abdominais e corte-os cuidadosamente para expor os intestinos. Agora identifique o cólon e trace-o até sua extremidade distal, onde se junta ao reto. Em seguida, usando uma tesoura, corte o cólon o mais próximo possível da abertura anal.
Em seguida, descubra onde o estômago se junta ao intestino delgado e, usando uma tesoura, corte os intestinos a cerca de um centímetro do estômago. Agora transfira todo o comprimento do intestino delgado e cólon livres para uma placa de Petri limpa contendo PBS. Em seguida, prenda a extremidade distal do cólon e desfie suavemente todo o comprimento do cólon, removendo quaisquer tecidos mesentéricos aderidos.
Em seguida, identifique o ceco e faça o transecto do intestino onde o ceco se junta ao cólon, isolando assim o cólon. Da mesma forma, desvende o resto do intestino delgado dos tecidos conjuntivo e adiposo mesentérico anexados. Em seguida, faça o transecto do intestino delgado onde ele se junta ao ceco.
O ceco pode então ser removido e descartado. Agora encha uma seringa de 10 mililitros com fixador de Bouin modificado e coloque uma agulha de gavagem. Insira a agulha cerca de meio centímetro na abertura anterior de um segmento intestinal.
Enquanto prende firmemente a agulha de gavagem dentro do segmento, lave lentamente o conteúdo do tecido com fixador. Tenha cuidado, pois muita pressão estourará o segmento. Se o intestino delgado parecer muito longo para manusear, você pode cortá-lo em três segmentos iguais primeiro e lavar cada segmento separadamente.
A fixação fará com que a cor do segmento intestinal se torne opaca. Em seguida, usando uma tesoura, corte o segmento longitudinalmente ao longo da linha mesentérica e, em seguida, enxágue brevemente o segmento em um prato de PBS, mantendo-o aberto com uma pinça. Agora corte o intestino delgado em três segmentos iguais, proximal, médio e distal, que correspondem aproximadamente ao duodeno, ao jejuno e ao íleo.
Macroscopicamente, não há características exigentes para cada seção. Certifique-se de fazer uma marca para identificar a extremidade proximal da extremidade distal em cada segmento. Em seguida, coloque um segmento com o lado luminal voltado para cima na tampa de uma placa de Petri.
No segmento do cólon, identifique o lado luminal pelas cristas que percorrem sua largura na extremidade proximal. As regiões média e distal têm algumas variegações que correm longitudinalmente. No intestino delgado, identifique o lado luminal pela superfície mais áspera que marca as vilosidades.
O exame microscópico mostra que as vilosidades são mais longas nas regiões proximais de cada segmento, enquanto as criptas colônicas são mais curtas nas regiões proximais e são mais altas na seção média. Prossiga com o rolamento suíço do cólon. Com o cólon aberto e o lado luminal para cima, puxe-o com uma pinça de sua extremidade proximal em direção à borda da placa de Petri.
Mantendo o lado luminal para cima, segure a extremidade proximal com a pinça e enrole a borda da extremidade proximal em volta de um palito e aperte firmemente a borda enrolada contra o palito. Em seguida, role suave e lentamente o cólon ao redor do palito para formar um rolo suíço. Depois que todo o comprimento do cólon estiver enrolado, use outro par de pinças para deslizar cuidadosamente o rolo em um de processamento de tecidos.
Em seguida, transfira o para formalina tamponada a 10% e deixe-o incubar durante a noite em temperatura ambiente. Para enrolar um segmento do intestino delgado, abra-o com o lado luminal para cima e puxe-o com uma pinça de sua extremidade proximal em direção à borda de um prato. Em seguida, use a mesma técnica mostrada com os dois pontos para fazer o rolo suíço e fixá-lo em formalina.
Usando os métodos descritos, a coloração HND para o intestino grosso de um camundongo C57 preto 6 revelou todas as porções do cólon para uma avaliação histológica abrangente. Em seguida, a preparação foi usada para camundongos que expressam EGFP impulsionado pelo promotor LGR5, que é ativo apenas em criptas intestinais periféricas. Este transgene EGFP tem apenas cerca de 5 a 10 por cento de penetrância, mas as regiões de interesse podem ser facilmente encontradas.
Usando os mesmos camundongos com expressão de EGFP LGR5, KLF5 e KI67 foram corados. Primeiro camundongos controle com expressão normal de LGR5 foram estudados. As células positivas para EGFP são marcadas com setas azuis e as células negativas para EGFP são marcadas com setas brancas.
Em seguida, os mesmos transgenes foram expressos em um camundongo knockout KLF5. A co-coloração de KLF5 e KI67 está ausente nas células-tronco EGFP positivas, mas permanece presente nas criptas negativas para EGFP. Claramente, a qualidade da preparação para a coloração multi fluoro force é muito boa.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de 15 minutos por camundongo se você estiver coletando o intestino delgado e o cólon. Não se esqueça de que trabalhar com o fixador de Bouin pode ser extremamente perigoso para os olhos. Precauções como proteção adequada para os olhos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
Obrigado por assistir e boa olhada com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo foca no processamento eficiente de tecido intestinal de camundongo para obter coloração histológica uniforme. Destaca a importância de métodos adequados de fixação para melhorar a qualidade das amostras de tecido para imagem e análise.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Histologia
- Processamento de Tecidos
Antecedentes
- A identificação precisa de células epiteliais é fundamental para definir linhagens celulares.
- A análise de tecidos intestinais requer métodos ideais de processamento.
- Pode haver variações na coloração ao longo do comprimento do intestino.
- Técnicas convencionais podem produzir tecidos rígidos, o que complica a análise.
Objetivo do Estudo
- Delinear métodos ideais para o processamento de tecidos intestinais de camundongo.
- Aprimorar a uniformidade da coloração histológica.
- Desenvolver um método de fixação que utilize substâncias químicas menos tóxicas.
Métodos Utilizados
- Utilização de uma técnica suíça de inclusão modificada.
- Experimentação com um método rápido de fixação.
- Preparação de condições cirúrgicas para coleta de tecidos.
- Aplicação do fixador modificado em tecidos espessos.
Resultados Principais
- O método de fixação modificado permite um enovelamento suíço mais eficiente do tecido intestinal.
- Produtos químicos menos tóxicos melhoram a segurança do processo de fixação.
- A coloração histológica uniforme pode ser obtida com o novo método.
- A técnica pode ser adaptada para outros tecidos espessos.
Conclusões
- Técnicas de fixação aprimoradas melhoram o processamento de tecidos para histologia.
- Métodos eficientes são essenciais para imagens e análises precisas.
- Pesquisas futuras podem expandir a aplicação dessas técnicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O processamento eficiente do tecido intestinal permite uma avaliação histológica consistente em todo o comprimento do órgão, apoiando a análise quantitativa da inflamação e da tumorigênese. A técnica aprimorada de enrolamento suíço melhora a preservação da morfologia tecidual, facilitando a detecção imuno-histoquímica e imunofluorescente confiável. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao reduzir a variabilidade no preparo das amostras.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da homeostase do epitélio intestinal e da resposta a lesões e regeneração.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da melhoria da avaliação histológica de seções intestinais completas.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, garantindo características estruturais intestinais intactas após o corte em seções.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio da coloração histológica uniforme ao longo do comprimento do tecido.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia sistemas relevantes para doenças ao permitir a diferenciação de características estruturais intestinais vitais para medições quantitativas.
- Valor Operacional: Aprimora o alinhamento de biomarcadores translacionais por meio de processamento robusto utilizando métodos de detecção imuno-histoquímica e imunofluorescente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A técnica integra-se aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta ao aprimorar o processamento de tecidos para análise histológica e apoiar a identificação de compostos líderes por meio da avaliação confiável de compostos em modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a avaliação da morfologia do epitélio intestinal.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio de resultados quantitativos obtidos a partir de análises imuno-histoquímicas e imunofluorescentes.
- Análises: Destaca medições de inflamação intestinal e tumorigênese ao longo de todo o comprimento do tecido.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de sistemas relevantes à doença e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para o processamento de tecidos espessos além de amostras intestinais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução da ambiguidade mecanicista na análise de tecido intestinal.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de processamento de tecidos.
- Valor Estratégico: Decisões mais assertivas de prosseguir ou interromper por meio de validação aprimorada de alvos e redução de riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco mediante maior confiabilidade dos modelos pré-clínicos.
Considerações de Implementação
- Expertise científica obrigatória em histologia e técnicas de processamento de tecidos.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica para fixação, inclusão e corte.
- Requisitos de padronização entre equipes para execução consistente da técnica de enrolamento suíço.
- Considerações de adaptação em diferentes sistemas modelo utilizando o fixador modificado de Bouin.
- Limitações práticas incluem o manuseio de produtos químicos perigosos, exigindo proteção ocular adequada.
