Name: Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda uma técnica de Swiss-rolamento modificada para processar tecido intestinal de camundongo com fixação rápida e menos tóxica. Este método melhora a uniformidade da coloração histológica e a qualidade da imagem para análises de imunofluorescência.

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Gostaríamos de agradecer a Ainara Ruiz de Sabando por fornecer imagens de H&E. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (DK052230, DK093680 e CA172113) concedidas ao Dr. Vincent W. Yang.

1. Ratos <ol><li> Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Stony Brook University (IACUC). Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro 12:12 h. <ol><li> Comercialmente obter ratinhos C57BL / 6. Obter camundongos C57BL / 6 com alelos Klf5 flanqueadas por locais loxP (Klf5 f l / f l). Estes ratos foram previamente descritos 21 e graciosamente cedido pelo Dr. Ryozo Nagai. </li></ol></li><li> Comprar camundongos C57BL / 6 portadores do gene induzível recombinase Cre sob regulação do promotor Lgr5 (ratos Lgr5-EGFP / CreERT2). </li><li> Para estabelecer Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 f l / f l ratos, atravessar Klf5 fl / f l camundongos com ratos / creer T2 Lgr5-EGFP e depois retrocruzamento a prole para Klf5 fl / f l </sup&gt; ratos. </li><li> Camundongos deleite com tamoxifeno como por o protocolo previamente descrito 22. Injectar 8 semanas de idade, os ratinhos de controlo e experimentais por via intraperitoneal (IP) com 1 mg de tamoxifeno (10 mg / mL), dissolvidos em óleo de milho estéril, durante 5 dias consecutivos. </li><li> No dia 14 após a primeira injecção tamoxifeno, sacrificar os ratinhos utilizando asfixia com CO 2, colocando-os em uma câmara ligada ao CO 2 fonte de gás. Permitir que o gás flua para dentro da câmara até que os ratinhos são inconsciente e todo o movimento cessa. Para assegurar a eutanásia executar deslocamento cervical. </li></ol> 2. Preparação de tecidos e Swiss Rolamentos <ol><li> Utilizando fórceps de dissecção e uma tesoura, corte de uma incisão na pele do lado abdominal. Com um par de fórceps, segure a pele na incisão e puxe para fora do tecido do músculo abdominal. Utilizar um par de tesouras para cortar a pele abdominal e expor os músculos abdominais. </li><li> Segurar e puxar para cima o peritoneum com a pinça. Certifique-se de não estar segurando e puxando os intestinos. Cuidadosamente fazer uma incisão no tecido peritoneal e continuar a cortar afastado da pele para expor os músculos abdominais. Cuidadosamente fazer uma incisão nos músculos abdominais e continuar cortando-a para expor os intestinos. </li><li> Identificar os dois pontos e traço para a extremidade distai onde se junta o recto / ânus. Com um par de tesouras, cortar o mais próximo possível da abertura anal quanto possível. </li><li> Identificar o estômago e de rastreio, onde se junta com o intestino delgado. Com uma tesoura, corte libertar o intestino cerca de 1 cm de distância do estômago. Transferir todo o comprimento do intestino delgado e cólon libertado para uma placa de Petri limpa contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Com uma mão ou um par de fórceps, segure a extremidade distai do cólon e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do cólon a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica. </li><li> Identificar o ceco(Pequena bolsa entre o intestino delgado e grosso) e cortar onde o ceco e no cólon join (a extremidade proximal do cólon) para libertar no cólon. </li><li> Com uma mão ou um par de fórceps, segurar o intestino delgado e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do intestino delgado a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica. Cortar o ceco e descarte se não houver necessidade. Nota: O processo pode ser interrompido aqui por incubação dos intestinos dissecados em fixador de Bouin modificada (50% de etanol / 5% ácido acético em dH 2 O) durante a noite e continuar o procedimento no dia seguinte. </li><li> Manipulação de um segmento do intestino (intestino delgado ou do cólon), encher uma seringa de 10 ml com fixador de Bouin modificado e anexar uma agulha de gavagem a ele. Inserir a agulha cerca de meio centímetro na abertura anterior do segmento intestinal. </li><li> Segurar a agulha de gavagem no interior do segmento intestinal por aplicação de uma pressão firme com um instrumentono segmento intestinal. Com a outra mão segura a seringa, aplique pressão suave, mas consistente para liberar o conteúdo do segmento intestinal usando fixador modificado de Bouin. Este passo permite que a limpeza simultânea do segmento intestinal e fixação imediata. Use uma placa de Petri para recolher os resíduos de fluxo. A fixação pode ser observado pela cor cólon transformando opaco. Nota: Certifique-se de não aplicar muita pressão durante a lavagem ou o segmento intestinal poderia estourar aberto. </li><li> Com uma tesoura, cortar abrir o segmento intestinal longitudinalmente ao longo da linha mesentérica. Segure-o com um par de fórceps e lave-o brevemente em uma placa de Petri contendo PBS. <ol><li> Cortar o intestino delgado em 3 segmentos iguais: proximal, médio e distal. O segmento proximal é a um imediatamente a seguir ao estômago, e o segmento distai é a única imediatamente antes do cólon. O segmento proximal é equivalente para o duodeno, o meio para o jejuno, eo distalo íleo. </li><li> Para cada segmento de marcar as extremidades proximal e a extremidade distal. A extremidade proximal é a que foi inicialmente apontando para o estômago, e distal apontou para o cólon. </li></ol></li><li> Usar a parte superior de uma placa de Petri para colocar o segmento intestinal limpa e aberta. Colocar o segmento intestinal com o lado luminal voltada para cima. <ol><li> Para o cólon, identificar o lado luminal pelos variegations / nervuras correndo através da sua largura e estão presentes na extremidade proximal. As regiões médias e distais têm algumas variegations que correm longitudinalmente. Para o intestino delgado, identificar o lado luminal por a superfície áspera de aparência, que marca as vilosidades. Nota: Para o intestino delgado, não há a demarcação anatómica macroscópica externo proximal, médio e distal. No entanto, estas regiões podem ser podem ser identificados em secções sob o microscópio. As vilosidades são mais longa na região proximal e tornar-se gradualmente mais curto distally onde eles estãoo mais curto em comprimento. Microscopicamente, as criptas do cólon são mais curtos na região proximal que também pode ser identificado pela presença de saliências. As criptas colônicas são o mais alto no meio e mais curto na região distal e ainda mais alto do que na região proximal. </li></ol></li><li> Prossiga com a Swiss rolando o cólon: <ol><li> Manter o cólon plana aberta e puxá-lo com uma pinça a partir da sua extremidade proximal para a extremidade da placa de Petri. </li><li> Mantenha lado luminal voltado para cima e segure a extremidade proximal com a pinça com uma mão e com a outra mão segure um palito. </li><li> Enrole a borda da extremidade proximal em torno do palito usando a pinça e um pouco beliscar a ponta envolto contra o palito para segurá-la no lugar. </li><li> Suave e lentamente começar a rolar o palito com os dedos para rolar os dois pontos em torno do palito para formar um rolo suíço. </li><li> Uma vez que todo o comprimento do cólon tem sido enrolado, use um par de fórceps para deslizar cuidadosamente o cOlon Swiss roll off o palito e em um tecido de processamento / cassete Embedding. Coloque a gaveta em 10% de formalina tamponada durante a noite à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Prossiga com a Swiss rolando o intestino delgado: <ol><li> Manipulação de um segmento de cada vez, manter o segmento plano aberto com o lado luminal para cima e puxe-o com uma pinça de sua extremidade proximal em direção à borda da placa de Petri. </li><li> Continuar com a laminagem do Swiss tal como descrito para o cólon. </li></ol></li><li> Prosseguir com o processamento de tecidos fixados em formalina para inclusão em parafina. Proceda da seguinte forma: NOTA: Use um processador automatizado (ver Materiais e equipamentos para obter detalhes). <ol><li> Enquanto o tecido está na cassete, lavar o tecido com PBS até fixador é completamente removido. </li><li> Desidratar o tecido utilizando etanol na sequência seguinte: 50% de etanol durante 10 min, 70% de etanol durante 10 min, 80% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min , e 100% de etanol durante 10 min. </li><li> etanol Exchange com xileno na seguinte sequência: 2: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 2 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 100% de xileno para 10 - 15 min, 100% de xileno durante 10 - 15 min, e 100% de xileno durante 10 - 15 min. CUIDADO: O xileno é um perigo para a saúde, assim, o local de trabalho deve ser equipado com uma ventilação de exaustão local com um capuz adequada e o equipamento de protecção adequado deve ser usava por pessoal. </li><li> xileno intercâmbio com parafina. Executar os seguintes passos num forno de vácuo regulado para 54-58 ° C: 2: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 2 xileno: parafina, durante 30 min, 100% de parafina para 1 - 2 horas, e% de parafina 100 para 1 - 2 horas ou durante a noite. Nota: Não deixe que a parafina superior a 60 ° C por períodos prolongados de tempo, porque isso irá degradar os polímeros de parafina e torná-lo duro e quebradiço. </li><li> Incorporar no novo tecido parafina e oriental fresco como dedesejado antes da parafina endurece. Para os rolos suíços, seguindo parafinização tecido, é importante para reposicionar cada rolo no seu lado durante a inclusão em parafina. Isso garante que, durante o corte, vão ser produzidas secções de todo o comprimento de cada rolo. </li></ol></li><li> Para a coloração, corte 5 mm de espessura usando micrótomo. Recolher as secções em lâminas carregadas e secá-las (bake) em um 65 ° C forno durante a noite; deixe esfriar à temperatura ambiente e subsequentemente utilizado para a coloração. Nota: O tempo de cozedura pode ser reduzido para 1 - 2 horas dependendo de como acabada de cortar as lâminas são. Se menos de um mês desde o corte, então é aconselhável para assar durante a noite. Se ele tem sido mais de um mês, em seguida, 1-2 hr de bicarbonato é suficiente para poupar tempo. Se correndo contra o tempo, o apoio durante a noite pode ser sempre utilizado. </li></ol> 3. Análise histológica e por imunofluorescência Coloração Realizar a análise histológica e immunofluorescence coloração como descrito anteriormente 23,24, com modificações. Para reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) imunofluorescência: <ol><li> Coza os diapositivos num forno de 65 ° C durante 1 hora, para inactivar a actividade de fosfatase alcalina endógena e subsequentemente Desparafinar em xileno. </li><li> Incubar secções em um banho de 3% de peróxido de hidrogénio em metanol para bloquear peroxidases endógenas de tecido; em seguida, re-hidratados por incubação em série decrescente banho de álcool (100%, 95%, 70%), seguido por recuperação de antigénios em solução tampão de citrato (10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C durante 10 min usando uma câmara decloaking. </li><li> Desenhar um círculo em torno de secções de tecido utilizando pena de marcação que proporciona uma barreira hidrofóbica e incubar secções com um tampão de bloqueio (2,5% de albumina de soro bovino [BSA] em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, com o anticorpo primário contra EGFP (diluição 1 : 500) a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada, agitando suavemente.</li><li> Lave os cortes e incubar com o anticorpo secundário fluorescente marcada com a concentração apropriada, durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavagem das lâminas após tratamento com o anticorpo e mancha núcleos secundários com Hoechst e montar com meios de montagem. <ol><li> Para Klf5 / EGFP / Ki-67 co-coloração, as lâminas de processo como descrito nas etapas 3.1 - 3.3 e realização da coloração Klf5 por incubação com anticorpo Klf5 (diluição 1: 150) durante a noite. </li><li> Aplicar detecção de polímero AP coelho para slides como por protocolo. </li><li> Revelar KLF4 coloração com coloração imuno-histoquímica cromógeno, conforme o protocolo do fabricante. </li><li> Realizar a eluição do anticorpo utilizando o protocolo previamente descrito 25. Incubar as lâminas a 50 ° C em glicina-SDS (pH 2,0) solução com agitação durante 1 h. </li><li> Lave as lâminas cuidadosamente com água destilada e incubar com um tampão de bloqueio (2,5% de BSA em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar o Ki-67 (diluição 1: 500) e a EGFP (diluição 1:500) Anticorpos simultaneamente e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Realizar a detecção fluorescente com anticorpos secundários apropriados antes da coloração com Hoechst (dados não mostrados) e de montagem com meio de montagem. </li></ol></li><li> Observar a morfologia histológica dos tecidos na coloração seções 5 mícrons com hematoxilina e eosina (H &amp; E) 26. Para imagens fluorescentes, usar comprimentos de onda de emissão de 535, 646 e 700 para visualizar EGFP, Klf5 e Ki-67 coloração, respectivamente. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A técnica de laminação Swiss é um método poderoso para a preparação de tecido intestinal para avaliação histológica e morfológica em grande escala. Em contraste com a técnica Swiss-laminagem anteriormente descrita, que foi originalmente desenvolvido para preparação de secções congeladas 18,19, o processo aqui apresentado permite a preparação do tecido intestinal rápida e a fixação para a fixação de formalina e embebidos em parafina (FFPE). Em comparação com tecido congelado, o tecido FFPE tem muito maior vida...

O epitélio intestinal de mamífero compreende uma única camada de células colunares. No intestino delgado, as células proliferativas são confinados às criptas enquanto que as células diferenciadas ocupar a região da vilosidade. No entanto, porque não há nenhum vilosidades no intestino grosso, as células proliferativas são localizadas na parte inferior das criptas e células diferenciadas ocupar a região superior das criptas. O epitélio intestinal sofre reposição rápida (cerca de 3-5 dias) que é accionado por divisão contínua das células proliferativas nas criptas. As células proliferativas das criptas não são uma população homogénea e são ainda subdivididas em células estaminais e células-amplificação de trânsito (TA) 1. As células estaminais reside na parte inferior da cripta, dentro das primeiras 4 - 5 células a partir da parte inferior 2. O modelo atual suporta a existência de dois tipos de células-tronco: as células-tronco da cripta colunar base (CBC) e de reserva de células estaminais quiescentes. A CBC scélulas dez estão se proliferando de forma activa e são marcados por rica em leucina contendo repetição G-proteína receptor acoplado 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. Por outro lado, as células estaminais quiescentes de reserva são rotulados por Moloney site B específico da célula vírus da leucemia murina de integração 1 (Bmi1) 6, a telomerase rato transcriptase reversa (mTert) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, duplacortina-like e CAM Kinase -como 1 (Dclk1) 9, e leucina-ricos repete e do tipo imunoglobulina domínios 1 (Lrig1) 10. As células estaminais que proliferam activamente dar origem a células TA, em seguida, submetido a posterior diferenciação em células absortivas (enterócitos) e células secretoras (enteroendócrinas, caliciformes, células de Paneth e flocos). divisão celular contínua na zona proliferativa resulta em movimento ascendente de células epiteliais ao longo do eixo de cripta-vilosidade até atingirem a parte superior da vilosidade, onde eles sofrem apoptose e sãodescartadas a partir da superfície do epitélio. Os diferentes tipos de células epiteliais intestinais estão marcados pela expressão de proteínas diferentes (por exemplo, células caliciformes intestinais podem ser reconhecidos através de coloração com anticorpo contra células de Paneth MUC2 e com anticorpo contra lisozima). Nós estudar o papel de factores como Krüppel-(KLFs) na homeostase e patobiologia do epitélio intestinal 11-13. Os resultados aqui apresentados apoiar a viabilidade de uma técnica de laminagem Swiss modificado baseiam-se em estudos anteriores sobre o papel do factor-Krüppel como 5 (KLF5) na manutenção das proliferam activamente células estaminais epiteliais intestinais 14. KLF5 é um factor de transcrição dedo de zinco que é altamente expresso na haste intestinal activa e 12 alvéolos Ta. Estudos anteriores demonstraram que KLF5 é co-expressa com Ki-67, um marcador conhecido proliferativa nas criptas intestinais. O tr gastrointestinal<html> ato não é um tecido estruturalmente ou funcionalmente homogénea. O intestino delgado é dividido em duodeno, jejuno e íleo e o intestino grosso no ceco e no cólon, com esta última ainda divididas em segmentos proximal, médio e distal. Cada uma destas secções tem características histológicas únicas e desempenha papéis distintos 15. Como tal, os efeitos de insultos e o grau de resposta do epitélio intestinal pode depender da região de tecido estudado 16. Além disso, várias estirpes de ratos demonstrar a diversidade da resposta ao nível histológico com base no tipo de insulto utilizado nos estudos 16. Assim, condizente com a preparação do tecido é necessário para permitir histológico apropriado e análise molecular dos tecidos intestinais. Como tal, a-rolo suíço análise bolsas técnica de todo o comprimento do epitélio intestinal de uma só vez e, assim, verifica conclusões bem informadas com base numa informação global. e_content &quot;&gt; A técnica Swiss-rolo foi mencionado pela primeira vez por Magnus 17, e descrito em detalhe por Moolenbeck e Ruitenberg e Park et al., como um método para a preparação de tecidos e realizando análises histológicas do intestino roedor 18,19, respectivamente. O protocolo delineada na presente publicação apresenta uma versão melhorada do método original que permite a preparação do tecido oportuna e confiável para fins de diagnóstico. esta técnica modificada permite coleções e preparação do epitélio intestinal de técnicas universalmente utilizados, tais como imuno-histoquímica, imunofluorescência, bem eficientes como hibridação in situ (fluorescente e cromogénico 20). Além disso, o tecido modificado espécime método de preparação utiliza reagentes facilmente disponíveis e relativamente pouco dispendiosos, enquanto que oferecem um método de fixação rápida dos tecidos e permite a recuperação de proteína, ADN e ARN para a avaliação adicional. Tomados juntos, this técnica é excelente para avaliação abrangente dos aspectos histopatológicos, patológicas e moleculares do epitélio intestinal.

<table><tbody><tr><td>Kits de dissecação em aço inoxidável</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de desmontagem</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 10 ml</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td></td></tr><tr><td>de incorporação/processamento de tecidos com tampa</td><td>Simport</td><td>M515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides [tamanho: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coloração manual</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Prato de coloração verde</td><td>Prato de coloração Tissue-Tek/Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Branco</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de slides de 24 slides com alça destacável</td><td></td><td></td> Tecido <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 90i</td><td>Luz brilhante e fluoerescente, com objetivas: 10X, 20X</td></tr><tr><td>Caneta PAP Bloqueador de Super-Líquido Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova</td><td>AAPR</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>AAPR</td><td>281000ACS</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio a 25% em água</td><td>ACROS</td><td>202465000</td><td></td></tr><tr><td>formalina buferizada a 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fração V, choque térmico</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de gavagem</td><td>VWR</td><td>20068-624</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti Klf5 de coelho</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-22797</td><td>Diluição 1:150</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-EGFP de frango</td><td>Diluição de AB16901 Millipore 1:500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo</td> <td>anti Ki67 de coelhoKit</td><td>de</td> detecção de polímero AP de coelho <td>Mach3 de diluição de CRM325B</td>da Biocare Medical</tr> M3R533L <tr><td></td><td></td><td></td> Kit de cromogênio vermelho de urdidura Biocare Medical WR806 H <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Lgr5-EGFP/CreERT2 camundongos&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Labs</td><td>008875&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Processador automatizado</td><td>Leica</td><td>Leica TP1020</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Compreender o papel dos fatores que regulam a homeostase epitelial intestinal e a resposta à lesão e regeneração é importante. A literatura atual descreve várias abordagens metodológicas diferentes para obter imagens de tecidos intestinais para validação de dados. Neste artigo, delineamos um protocolo comum relacionado à derivação e processamento de tecidos intestinais de camundongos. A fixação adequada dos tecidos intestinais e as técnicas de rolo suíço que melhoram a morfologia epitelial intestinal são discutidas. O processamento pós-ressecção e a reorientação dos tecidos intestinais incorporados são críticos na obtenção de blocos embebidos em parafina que exibem características estruturais intestinais intactas após a secção. A técnica de rolamento suíço auxilia na avaliação histológica dos cortes intestinais ou colônicos completos examinados. A capacidade de diferenciar as características estruturais intestinais pode ser vital em medições quantitativas de inflamação intestinal e tumorigênese ao longo de todo o comprimento. Finalmente, as seções embebidas em parafina são ideais para processamento robusto usando métodos de detecção imuno-histoquímica e imunofluorescente. Cortes imuno-histoquímicos não fluorescentes fornecem uma imagem vibrante do tecido detalhando diferentes características estruturais celulares, mas não fornecem flexibilidade para experimentos de co-localização intracelular. Múltiplos canais fluorescentes podem ser utilizados adequadamente com detecção imunofluorescente para experimentos de co-localização, dando suporte a estudos mecanicistas.

A técnica de rolamento suíça em combinação com coloração imuno-histoquímica permite a análise abrangente do tecido intestinal pequeno ou grande. O exemplo de coloração de H &amp; E de um intestino grosso de um C57BL / 6 de ratinho (Figura 1) é uma ilustração da exequibilidade e a eficácia desta técnica. Como mostrado na Figura 1, a imagem é capaz de capturar todas as porções do cólon: proximal, médio e distal. Assim, permite a avaliação ...

A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

O objetivo geral dessa técnica é processar de forma eficiente longos segmentos de tecido intestinal de camundongo para obter uma coloração histológica uniforme ao longo de seu comprimento. Para obter cortes intestinais, podem ocorrer variações na coloração ao longo de todo o comprimento do intestino. Tentei utilizar a técnica padrão de enrolamento suíço, mas verifiquei que ela produz tecido intestinal muito rígido e difícil de abrir.Com alguns experimentos, desenvolvi um método rápido de fixação que utiliza produtos químicos menos tóxicos e que permite um enovelamento suíço muito melhor do tecido intestinal. O fixador modificado pode ser usado para fixar rapidamente outros tecidos espessos. Como preparação, eutanazie o animal de teste de acordo com o protocolo descrito e prepare o ambiente cirúrgico.Para começar, use pin&ccedil;as de disseca&ccedil;&atilde;o e tesoura para fazer uma incis&atilde;o lateral no meio do abd&ocirc;men, cerca de um a dois cent&iacute;metros abaixo da caixa tor&aacute;cica, dependendo do tamanho do camundongo. Em seguida, separe e corte suavemente a pele para expor os m&uacute;sculos abdominais. Depois, segure e levante os m&uacute;sculos sem tocar ou puxar os intestinos.Em seguida, faça cuidadosamente uma incisão i

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dextran sulfato de sódio (DSS), administrada na água de beber é um modelo de lesão inflamatória estabelecida murino de colite aguda. Este protocolo descreve o método para o tratamento DSS ea preparação dos tecidos.

Modelagem Colite murino utilizando Dextran Sulfato de Sódio (DSS)

Neste vídeo, demonstramos a preparação de toda a montagem do intestino do camundongo usando um dispositivo simples de incisão intestinal. As montagens resultantes são de qualidade superior e uniforme e podem ser usadas para análises histológicas.

Preparação de montagem inteira do intestino de camundongo: usando um dispositivo simples de incisão intestinal para preparar a montagem inteira

O uso de um dispositivo simples para cortar e 'rolar' intestinos de camundongos para preparar rapidamente preparações de montaria inteiras é descrito.

Um dispositivo simples de preparar rapidamente inteiras Mounts do mouse Intestino

Células-tronco do epitélio intestinal (ISC) são misturados com células de Paneth. Estas células são diferenciadas progênie do ISC, que suportam o ISC e fornecer proteção antibacteriana. Aqui demonstramos como nós usamos modelos de ratos transgénicos condicionais para estabelecer que as células de Paneth desempenham um papel crucial na manutenção dos epitélio intestinal.

Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Models

A pontuação sistemática da inflamação intestinal usando um sistema gratuito assistido por computador é uma ferramenta poderosa para comparar quantitativamente alterações histopatológicas em modelos de colite caracterizados pela presença de úlceras e alterações inflamatórias. A avaliação do escore da colite histológica fortalece as observações clínicas e facilita a interpretação dos dados.

Análise sistemática de pontuação para inflamação intestinal em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio murine dextran

O intestino é vital para a digestão e absorção. Cada região - duodeno, jejuno, íleo, cólon - tem funções distintas devido a estruturas celulares únicas. Estudar a fisiologia intestinal exige uma análise meticulosa do tecido. Este protocolo descreve a fixação e o processamento do tecido usando a técnica do rolo suíço, garantindo uma imunocoloração precisa por meio da preservação e orientação adequadas do tecido.

Protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina

Esse protocolo descreve um método de imunocoloração do estômago inteiro modificado a partir da técnica "Swiss roll" originalmente desenvolvida para o intestino murino.

Mapeamento Espacial Aprimorado das Camadas de Músculo Gástrico de Camundongos usando uma técnica modificada do Swiss Roll

Este é um guia para modificar a forma de micropipetas de vidro. Especificamente, usando calor e pressão de ar do cone é alargado, sem aumentar a abertura da ponta, levando a menor resistência da pipeta. Isto é fundamental para obter gravações de baixo ruído de pequenas células, mas é útil em muitas aplicações.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de camundongos adultos para quantificar duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta estratégia é útil para detectar renovação celular de longa duração tecidos, transformação oncogênicos, ou de trânsito ampliando-células.

Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário

A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

Aprenda uma técnica de Swiss-rolamento modificada para processar tecido intestinal de camundongo com fixação rápida e menos tóxica. Este método melhora a uniformidade da coloração histológica e a qualidade da imagem para análises de imunofluorescência.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

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