subtipagem de Campylobacter jejuni Ssp. doylei Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

O objetivo geral desse procedimento de espectrometria de massa, chamado MSPP ou Filoproteômica baseada em espectrometria de massa, é subtipar bactérias no nível da cepa. Este método pode ser usado para responder a questões-chave nas áreas de Microbiologia, Epidemiologia e Higiene. Por exemplo, pode ser usado para analisar situações de surto visualizando a relação filoprotômica

Comparado a outros métodos de digitação, o MSPP é barato por amostra e muito rápido. As infecções nosocomiais são uma questão de importância crescente, e esperamos que nosso esquema MSPP possa ser estendido para a tipagem epidemiológica de outras bactérias, ou mesmo fungos. Nosso esquema MSPP fornece informações sobre o parentesco de cepas, portanto, para a previsão de fenótipos relevantes, como resistência a medicamentos, ou mesmo virulência, faz sentido aplicá-lo onde esses fenótipos se correlacionam com genótipos específicos.

Para iniciar este procedimento, prepare dois tubos de solução de matriz dissolvendo 2,5 miligramas de HCCA em 250 microlitros de uma mistura de solvente orgânico, uma isonitrila a 50%. Adicione insulina humana recombinante como calibre interno a um deles, depois 47,5% de água destilada dupla e 2,5% de ácido trifluoroacético. Em seguida, espalhe uma quantidade do tamanho de uma cabeça de alfinete de uma colônia da cepa de referência, diretamente em uma placa alvo maldi.

Para determinar a massa exata do pico de calibração, coloque em microlitro do padrão de teste em outro local. Cubra cada ponto de bactéria e padrão com 1 microlitro de solução de matriz enriquecida com HCCA e deixe-os cristalizar à temperatura ambiente. Para cada cepa a ser analisada, repita a preparação do esfregaço.

Cubra cada ponto com 1 microlitro de solução de matriz HCCA enriquecida e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Alternativamente, as proteínas podem ser extraídas de células difíceis de mentir. Para isso, colha aproximadamente 5 colônias de uma cultura em placa de ágar com uma alça de inoculação.

Suspenda-os em 300 microlitros de água bidestilada em um tubo de reação de 1,5 mililitro e misture-os bem por pipetagem repetida até que as colônias bacterianas estejam completamente suspensas. Em seguida, adicione 900 microlitros de etanol absoluto e misture. Centrifugar a amostra a 13 000 g durante 1 minuto.

Depois de secar o pellet, suspenda-o pipetando para cima e para baixo em 50 microlitros de ácido fórmico a 70%. Em seguida, adicione 50 microlitros de aceto-nitrilo e misture. Remover os detritos por centrifugação a 13 000 g durante 2 minutos.

Quando terminar, transfira 1 microlitro do supernomeado para uma posição de amostra em uma placa alvo maldi. Depois de deixar a amostra secar, cubra cada ponto com um microlitro de solução de matriz HCCA e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Neste ponto, execute a análise MALDI-TOF reunindo 600 espectros em 100 etapas de disparo para cada ponto.

Primeiro, clique na guia de execução automática no software de configuração do espectrômetro de massa. Abra o método clicando com o botão esquerdo do mouse no botão do método e escolhendo o método no menu suspenso. Em seguida, clique com o botão esquerdo no botão editar para abrir o editor de método de execução automática.

Na guia de acumulação, defina o valor satisfatório da tacada para 100 e o valor da soma para 600. Para cada espectro, escolha o pico de calibrante na lista, clique em atribuição automática'e pressione OK'Depois de obter espectros de massa de cada ponto, determine experimentalmente a massa exata do pico de calibração, abrindo um espectro com o navegador de espectro e encontrando o pico na massa esperada em comparação com um espectro sem calibrante. Verificar se o pico de calibração não está obscurecido por qualquer outro biomarcador do organismo em causa.

A partir dos dados de sequenciamento do genoma da cepa de referência, calcule o peso molecular monoisotópico teórico de cada uma das proteínas codificadas, traduzindo a sequência de DNA na sequência de aminoácidos correspondente. Carregue o arquivo ou copie e cole essa sequência de proteínas na caixa de entrada do painel de recursos de bioinformática apropriado e calcule o ponto isoelétrico teórico e o peso molecular. Copie os resultados em uma planilha com uma coluna contendo o identificador do gene e outra coluna o peso molecular.

Classifique as linhas por peso molecular calculado, para facilitar a pesquisa de massas. Insira uma coluna adicional na planilha para o peso molecular da forma dematianada, subtraindo 135 dautons do peso molecular monoisotópico. Atribua cada massa de biomarcador medida principal às massas calculadas da cepa de referência, procurando a massa medida na tabela do genoma.

Em outra planilha, registre a massa e o identificador de cada íon biomarcador. Agora calibre os espectros de massa obtidos dos isolados de coleta como feito para a cepa de referência. Para um isolado por linha, identificar biomarcadores variantes nos espectros de massa, registar a massa medida para cada biomarcador e a isoforma prevista nas respetivas colunas.

O espectro de massa MALDI-TOF do doylei ATCC 49349 da subespécie C-Jejuni contém 14 íons biomarcadores singularmente carregados que podem ser identificados pela comparação das massas moleculares calculadas com o espectro de referência. Dentro da coleção, foram detectadas várias formas iso para L32 sem metionina, L33 e a proteína hipotética codificada por gil152939117, S20 M e S15 M. As massas restantes atribuídas aos íons biomarcadores foram invariáveis nos isolados testados. A substituição de aminoácidos correspondente ao deslocamento de massa foi identificada por amplificação por PCR e sequenciamento de sanger do gene específico usando os primers listados aqui.

As sequências de aminoácidos de todos os íons biomarcadores incluídos no esquema MSPP, bem como as isoformas alélicas detectadas, são indicadas aqui. O dendrograma UPGMA baseado em MLST construído a partir dos isolados de doylei da subespécie C jejuni examinada, mostra que cada isolado pertence a um tipo de sequência MLST diferente. E a linhagem LMG7790 tem a maior distância filogenética.

Como visto com o MLST alaysis, o isolado LMG7790 tem a maior distância filoprodômica na análise MSPP dos isolados de doylei da subespécie C jejuni examinada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia se for executada corretamente. Ao seguir este procedimento, é importante lembrar a toxicidade de algumas substâncias usadas durante o experimento.

Por exemplo, o aceto-nitrilo pode causar irritação na pele. Além disso, para o MSPP, outros métodos, como o sequenciamento de DNA, podem ser realizados para analisar outros parâmetros, como a presença de genes de resistência. O desenvolvimento dessa técnica abre caminho para que pesquisadores da área de microbiologia explorem a fotogenia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o MSPP funciona e como ele pode ser aplicado a questões específicas. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos violentos pode ser extremamente perigoso e precauções como equipamentos de laboratório S2 devem sempre ser tomadas.