Name: subtipagem de Campylobacter jejuni Ssp. doylei Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a subtipar cepas de Campylobacter jejuni ssp. doylei usando filoproteômica baseada em espectrometria de massa. Este método rápido e econômico auxilia na epidemiologia de infecções nosocomiais.

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Somos gratos a Hannah Kleinschmidt pelo excelente suporte técnico. Este artigo foi financiado pelo programa de apoio ao Acesso Aberto da Deutsche Forschungsgemeinschaft e pelo fundo de publicação da Georg August Universität Göttingen.

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Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais crítico no estabelecimento de um regime de MSPP é a determinação genética inequívoca de identidades biomarcador íon. Se não for possível identificar um biomarcador, sem dúvida, então ele deve ser excluído do regime 13. A C. ssp. doylei esquema jejuni inclui 14 diferentes íons de biomarcadores. Estes são menos 5 em comparação com o C. jejuni ssp. esquema jejuni MSPP 13 .A diferença mais significativa entre o detec...

Durante a última década, laser assistida por matriz dessorção ionização espectrometria de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF MS) tem avançado para ser um método padrão altamente valorizado por género microbiana e identificação de espécies em microbiologia clínica 1, 2. A identificação da espécie é baseada no registo de impressões digitais pequenas proteínas de células intactas ou de lisados ​​celulares. A faixa de massa típica para um espectrómetro de massa usado em microbiologia clínica de rotina é 2-20 kDa. Além disso, o espectro resultante pode ser utilizado para discriminar estirpes com as espécies e abaixo-abaixo-subespécies de nível três. Estudos pioneiros iniciais identificaram iões de biomarcadores específicos para um subgrupo particular de estirpes de Campylobacter jejuni 4, 5 Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, e Escherichia coli 10-12. A combinação de várias massas de biomarcadores para variáveis ​​correspondentes isoformas alélicas oferece a opção de subtipagem mais profunda. Anteriormente, foi implementado com sucesso um método para converter essas variações nos perfis de massa em relações phyloproteomic significativos e reprodutíveis chamados massa phyloproteomics baseados espectrometria (MSPP) em um C. ssp jejuni. coleção isolado jejuni 13. MSPP pode ser usado uma espectrometria de massa equivalente a técnicas de subtipagem baseada na sequência de DNA como digitação sequência multilocus (MLST). Espécies de Campylobacter são a principal causa de gastroenterite bacteriana em todo o mundo 14, 15. Como consequência da Campilobacteriose sequela pós-infecciosa, ou seja, síndrome de Guillain Barré, artrite reactiva e doença inflamatória intestinal pode surgir 16. As principais fontes de infecção sãocarne de gado contaminado de frango, peru, suínos, bovinos, ovinos e patos, leite e água de superfície 15, 17. Portanto, estudos de vigilância epidemiológica regulares no contexto da segurança alimentar são necessários. MLST é o &quot;padrão ouro&quot; na tipagem molecular de espécies Campylobacter 18. Uma vez que a sequenciação de Sanger-base MLST método é um trabalho intensivo, que consome tempo e relativamente cara, é restrito MLST tipagem de relativamente pequenas coortes isolados. Por conseguinte, existe uma necessidade de métodos de subtipagem barata e mais rápida. Essa necessidade pode ser satisfeita através de métodos de espectrometria de massa como MSPP. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para MSPP-digitação usando uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolados e comparação de seu potencial com MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Autoflex III TOF/TOF 200</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td> GT02554 Padrão de teste bacteriano de <td>espectrômetro de massa</td><td>G201</td></tr><tr><td>BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>263564</td><td>Pacote de software</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>8290190</td><td>5 tubos</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Coleção coordenada de microrganismos da Bélgica/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; cepa 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Coleção coordenada de microrganismos da Bélgica/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Base de ágar Columbia</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bússola para FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>Pacote de</td><td>Software</td>251419</tr><tr><td>sangue de ovelha desfibrinado&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Alemanha</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>02854 Ácido</td> fórmico Fluka <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matriz HCCA</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes papel tissue</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>Pacote de</td><td>software</td></tr><tr><td>259935 Frascos de mastro Cryobank Mast</td><td>Diagnostica, Reinfeld, Alemanha</td><td>Alvo de aço polido CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>insulina humana recombinante</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>água, grau de biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtipagem de<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; isolados utilizando phyloproteomics baseados em espectrometria de massa (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS oferece a possibilidade de diferenciar algumas bactérias não só ao nível de espécies e subespécies, mas ainda abaixo, a nível da estirpe. isoformas alélicas dos íons de biomarcadores detectáveis ​​resultar em deslocamentos de massa específica do isolados. phyloproteomics à base de espectrometria de massa (MSPP) é um nova técnica que combina as massas espectrometria de massa de biomarcadores detectáveis ​​em um esquema que permite a dedução de relações phyloproteomic de deslocamentos de massa específicos do isolado em comparação com uma estirpe de referência do genoma sequenciado. As sequências de aminoácidos deduzidas são então usados ​​para calcular dendrogramas baseados em MSPP. Aqui nós descrevemos o fluxo de trabalho de MSPP digitando um ssp Campylobacter jejuni. Doylei coleção isolado de sete cepas. Todas as sete cepas eram de origem humana e multilocus digitação sequência (MLST) demonstraram a sua diversidade genética. MSPP-digitação resultou em sete tipos de seqüência MSPP diferentes, refletindo suficientemente sua phyrelações logenetic. A C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP inclui 14 diferentes íons de biomarcadores, proteínas principalmente ribossômicas na faixa de massa de 2 a 11 kDa. MSPP pode, em princípio, ser adaptado para outras plataformas de espectrometria de massa com uma faixa de massa estendida. Portanto, esta técnica tem o potencial para se tornar uma ferramenta útil para nível de tensão tipagem microbiana.

Anteriormente, nós estabelecemos com sucesso um esquema MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. Aqui, o objetivo foi estender o método para o irmão subespécie C. ssp jejuni. doylei. Neste cenário específico, sete C. jejuni ssp. doylei isolados foram adquiridos a partir da coleção belga de microorganismos / Laboratório de Microbiologia UGent BCCM / LMG Ghent, Bélgica. Todos os sete isolados utilizados para noss...

Massa phyloproteomics à base de espectrometria (MSPP) foi usado para digitar uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isola a nível da estirpe em comparação com digitação sequência multilocus (MLST).

subtipagem de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

O objetivo geral deste procedimento de espectrometria de massas, chamado MSPP ou Filoproteômica baseada em Espectrometria de Massas, é subtipar bactérias no nível de linhagem. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais nas áreas de Microbiologia, Epidemiologia e Higiene. Por exemplo, pode ser usado para analisar situações de surto ao visualizar a relação filoproteômica.Em comparação com outros métodos de tipagem, o MSPP é barato por amostra e muito rápido. Infecções nosocomiais são uma questão de importância crescente, e esperamos que nosso esquema MSPP possa ser estendido para a tipagem epidemiológica de outras bactérias, ou até mesmo fungos. Nosso esquema MSPP fornece informações sobre a relação entre cepas, portanto, para a predição de fenótipos relevantes, como resistência a medicamentos ou até virulência, faz sentido aplicá-lo quando esses fenótipos se correlacionam com genótipos específicos.Para iniciar este procedimento, prepare dois tubos de solução matriz dissolvendo 2,5 miligramas de HCCA em 250 microlitros de uma mistura de solvente orgânico, 50%isonitrila. Adicione insulina humana recombinante como padrão interno a um deles, seguido de 47,5%águ

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Embora a cultura das fezes para Campylobacter seja imprecisa, ela ainda é considerada o padrão-ouro para identificação. Métodos para determinar o limite de detecção e sobrevivência em meios de transporte de C. jejuni em fezes humanas são descritos e comparados com um novo imunoensaio com melhor precisão.

Métodos de Cultura para determinar o limite de detecção e sobrevivência em mídia de transporte de Campylobacter Jejuni em espécimes fecais humanos

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana transmitida por alimentos em todo o mundo. Apesar de os estabelecimentos adotarem medidas para reduzir a prevalência em todas as suas instalações, os produtos contaminados chegam consistentemente aos consumidores. A técnica desenvolvida nos últimos doze anos aborda as limitações dos métodos existentes para isolar e detectar Campylobacter spp.

Detecção e Isolamento de Campylobacter spp.

Este protocolo permite uma avaliação rápida e econômica da composição microbiana em produtos lácteos, combinando culturomics com MALDI-TOF MS. Ele fornece resultados de taxonomia comparáveis ao sequenciamento de rRNA 16S com um tempo de resposta mais curto do que os métodos tradicionais de cultura.

Avaliação da segurança microbiana de laticínios usando perfil proteômico bacteriano via abordagem MALDI

Aprenda a subtipar cepas de Campylobacter jejuni ssp. doylei usando filoproteômica baseada em espectrometria de massa. Este método rápido e econômico auxilia na epidemiologia de infecções nosocomiais.

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