Métodos para aguda e subaguda Murino dos membros posteriores Isquemia

O objetivo geral deste protocolo é modelar a doença arterial periférica humana por meio da colocação de suturas ou constritores ameróides na artéria femoral de camundongos para induzir isquemia aguda ou subaguda da extremidade posterior, respectivamente. A doença arterial periférica é um problema clínico importante, e essas técnicas utilizando modelos animais foram desenvolvidas para representar melhor a doença humana. A principal vantagem dessas técnicas é que a gravidade e o momento do início da isquemia da extremidade podem ser controlados pelo pesquisador.

O procedimento será demonstrado por Mike Padgett, um técnico do meu laboratório. Um a dois dias antes do procedimento, confirme que o camundongo está completamente sedado pela ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés e aplique pomada oftálmica. Em seguida, use uma pequena máquina elétrica de corte para retirar os pelos de ambas as patas traseiras.

Quando todo o pêlo tiver sido aparado, aplique creme depilatório pré-aquecido. Após um minuto, remova cuidadosamente o creme com uma compressa de gaze umedecida. Em seguida, coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação forrada com papel toalha vazia até que consiga manter a decúbito esternal.

No dia da cirurgia, posicione o camundongo completamente sedado sob um microscópio estereoscópico técnico em posição supina e fixe ambas as patas com fita cirúrgica. Se for utilizado um tapete aquecedor com controle de temperatura, conecte o sensor de temperatura e fixe-o na base da plataforma cirúrgica com fita cirúrgica. Em seguida, limpe a área cirúrgica com três aplicações alternadas de solução de poviodine e álcool, e cubra o animal com um campo cirúrgico estéril que tenha uma abertura no local da incisão.

Usando um bisturi, faça uma incisão inicial ao longo do centro da coxa medial, partindo do joelho em direção ao abdômen. Em seguida, use tesoura fina para alongar a incisão até aproximadamente um centímetro. Usando pinça, abra a incisão para expor a membrana que recobre o tecido adiposo inguinal.

Em seguida, utilize pinças fechadas para perfurar a membrana, penetrando no espaço entre o tecido adiposo e o abdômen. Libere suavemente a pressão sobre as pinças para separar o tecido adiposo dos músculos abdominais, expondo o feixe neurovascular. É fundamental que os principais vasos sanguíneos e seus ramos sejam adequadamente identificados antes da dissecção do feixe neurovascular.

Variações na localização dos constritores ou nos locais de ligadura podem alterar significativamente a gravidade da isquemia e levar a uma variabilidade substancial nos resultados. Insira um afastador na incisão e puxe o tecido abdominal em direção à cabeça do animal para expor o local proximal do constritor ameróide, que fica logo proximal à artéria femoral circunflexa lateral. Em seguida, insira um afastador medial e um lateral na parte distal da incisão para ampliar o campo cirúrgico, puxando o tecido adiposo inguinal em direção ao pé e afastando-o do local cirúrgico.

Os ramos proximal e superficial caudal da artéria femoral devem ser facilmente observados. A artéria femoral circunflexa lateral está localizada cerca de cinco milímetros proximal aos ramos caudais e pode estar obscurecida pela membrana. Agora, deslize suavemente a ponta de uma pinça sob a membrana que une os vasos para inserir metade da ponta entre a veia e a artéria.

Em seguida, feche a pinça e delicadamente remova a membrana. Quando toda a membrana tiver sido removida, insira a ponta da pinça fechada entre a veia e a artéria e libere a pressão sobre a pinça para criar um espaço entre os vasos. Para isquemia aguda do membro, deslize a ponta da pinça sob a artéria femoral para isolar o vaso do feixe neurovascular.

Use um segundo par de pinças anguladas para segurar a borda do constritor e guiar o constritor sob a artéria femoral. Em seguida, posicione a artéria dentro do entalhe do constritor. Depois, posicione o constritor distal sobre a artéria femoral imediatamente próximo ao ponto onde a artéria se bifurca nas artérias poplítea e safena, e coloque a artéria femoral no entalhe do constritor.

Para isquemia aguda dos membros, passe uma sutura 7-0 sob a artéria na mesma posição do constritor proximal e ligue a artéria. Em seguida, faça uma segunda ligadura cerca de um milímetro distal à primeira e use tesoura de mola para seccionar a artéria entre as duas ligaduras. Para o seccionamento arterial distal, posicione as ligaduras a cerca de um milímetro de distância uma da outra, logo proximal ao ponto em que a artéria femoral se bifurca nas artérias poplítea e safena.

Em seguida, feche a incisão com pontos separados de sutura de vicryl 5-0 e transfira o camundongo para uma placa aquecida a 37 graus Celsius sob um imagiador de perfusão por laser doppler. Agora, ligue o imagiador e inicie o software de captura de imagens. Clique no ícone Nova Imagem Única para abrir a janela de configuração do scanner e defina o tamanho da varredura como grande e a velocidade de varredura como quatro milissegundos por pixel.

Altere os valores de X e Y no painel Unidades da Área de Varredura para os valores apropriados, clique na guia Vídeo e Distância e posicione ambas as patas traseiras dentro da área de varredura. Clique em Distância Automática, depois clique em Avançar para abrir a janela Detalhes do Sujeito e insira as informações do sujeito. Clique em Avançar para prosseguir para a janela de varredura.

Em seguida, clique no botão Iniciar Medição para abrir a caixa de diálogo Confirmar ou Substituir Distância de Varredura e clique em OK para iniciar o processo de varredura. Quando a varredura estiver concluída, mova o animal para uma gaiola de recuperação vazia com monitoramento até que a recuperação seja completa. Além das variações inerentes aos estudos com animais, outros fatores podem introduzir variabilidade na imagem de perfusão por laser doppler, incluindo a temperatura corporal e a posição do animal.

O modelo de isquemia subaguda dos membros posteriores depende da qualidade dos constritores ameróides, que podem variar amplamente dentro de um mesmo lote. A imagem de perfusão por laser Doppler deve ser realizada imediatamente após o procedimento, enquanto o animal ainda está anestesiado, para demonstrar os efeitos da cirurgia e estabelecer um nível basal de perfusão pós-operatória. Deve-se observar uma perda completa da perfusão nos membros posteriores após a indução da isquemia aguda do membro, enquanto apenas uma diminuição leve na perfusão é tipicamente observada após a colocação do constrictor ameróide no modelo subagudo.

Estes procedimentos permitem explorar os efeitos de diferentes graus de isquemia sobre a remodelação vascular e a regeneração do músculo esquelético no camundongo como modelo da doença arterial periférica humana. Uma vez dominados, esses procedimentos podem ser concluídos em cerca de 15 minutos, se realizados corretamente. Ao realizar essas cirurgias, é importante lembrar-se de monitorar continuamente a temperatura corporal e a adequação da anestesia no animal.

Ajustando a posição das ligaduras ou dos constritores, pode-se modificar a gravidade da lesão isquêmica, o que pode ser uma variável importante dependendo do background genético do animal ou da presença de fatores de risco cardiovascular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir isquemia aguda e subaguda nos membros posteriores em camundongos, bem como de como definir a anatomia vascular para garantir um resultado adequado e a reprodutibilidade do procedimento.