Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico de transplante de células-tronco é gerar um novo modelo de camundongo quimérico com função hepática humana, utilizando células progenitoras hepáticas imaturas humanas que permitem a proliferação, maturação e diferenciação celular para a aquisição do metabolismo de fármacos. Este método fornece uma ferramenta poderosa para criar um microambiente que apoie a progação de células-tronco hepáticas doadoras humanas, permitindo sua expansão, diferenciação e reconstrução do fígado lesionado do camundongo receptor. A principal vantagem desta técnica é que as células proliferadas podem ser maduradas e utilizadas, e que o fígado é quase completamente repovoado.

Para começar, prepare uma solução estoque de toxina da difteria ou DT a um miligrama por mililitro adicionando um mililitro de solução fenolizada de cloreto de sódio 0,85% a um miligrama de DT. Realize uma injeção intraperitoneal de DT segurando um camundongo albtrek scid em posição de decúbito dorsal e abaixo da curvatura dos joelhos, à esquerda ou à direita da linha média, inserindo a agulha em um ângulo de 45 graus em relação ao corpo. Usando uma seringa de insulina, injete 100 microlitros de DT recém-preparada a 0,3 micrograma por mililitro por camundongo de 20 gramas. Quarenta e oito horas após a injeção de DT, coloque o camundongo em um dispositivo de contenção e aqueça a cauda em um banho-maria a 30 graus Celsius por aproximadamente 10 minutos para dilatar os vasos sanguíneos.

Em seguida, a dois centímetros da ponta da cauda, use uma lâmina de bisturi afiada para fazer um pequeno corte de um milímetro na cauda e utilize um tubo capilar para coletar o sangue. Centrifugue o tubo capilar microscópico contendo o sangue a 1500 × g por cinco minutos e colete o soro separando o sobrenadante do pellet celular. Pipete 50 microlitros de uma diluição de um para 20 do soro em lâminas GOT ASTP3.

Em seguida, utilizando um analisador automático multifuncional de química seca de acordo com o protocolo do fabricante, meça a absorbância do produto da reação em 650 nanômetros. Usando um classificador de células, isole células-tronco hepáticas humanas de células hepáticas fetais primárias humanas com os antígenos celulares CDCP1, CD90 e CD66 para obter uma subpopulação positiva para CDCP1, positiva para CD90 e negativa para CD66. Plaque as células em placas de cultura codificadas com colágeno IV e incube a 37 graus Celsius.

Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, use PBS para lavar as células uma vez. Em seguida, adicione tripsina 0,05% EDTA e incube à temperatura ambiente. Quando as células parecerem estar flutuando ou se movendo livremente ao microscópio, interrompa a digestão enzimática adicionando oito mililitros de DMEM-F12 contendo 10% de SBF.

Com uma pipeta serológica de 10 mililitros, suspenda lentamente as células antes de transferi-las para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 100 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Usando 10 mililitros de DMEM/F12 com 10% de FBS, ressuspenda cuidadosamente o pellet celular e utilize um instrumento de contagem celular para determinar o número de células.

Divida as células em alíquotas de um vezes 10 à sexta potência de células por 50 microlitros de PBS para cada camundongo e mantenha em gelo até o transplante. Após anestesiar um camundongo de acordo com o protocolo descrito, verifique a presença de reflexo apertando levemente a pata traseira. Em seguida, aplique pomada veterinária nos olhos para prevenir ressecamento.

Com uma tesoura elétrica, barbeie a área cirúrgica e aplique etanol 70% e iodopovidona para desinfetar. Faça uma incisão de um centímetro na pele no flanco esquerdo, logo abaixo da borda costal das costelas. Em seguida, faça uma incisão na parede abdominal esquerda, seguida por uma incisão no peritônio.

Em seguida, exponha cuidadosamente o baço. Depois, em um ângulo de cinco graus, insira uma seringa de microinjeção de 100 microlitros com uma agulha de 32 graus e meia polegada a uma profundidade equivalente à metade da espessura do baço e injete diretamente, de uma extremidade do órgão à outra, uma vez 10 à sexta potência de células-tronco hepáticas humanas em 50 microlitros de PBS no órgão e retire a agulha. Para prevenir o vazamento das células após a injeção, use um dedo para aplicar suavemente pressão durante dois minutos.

Coloque o baço de volta no corpo do camundongo e use uma sutura contínua normal para a musculatura e a pele, fechando a cavidade. Transfira imediatamente o camundongo, de lado, para uma gaiola pré-aquecida a 37 graus Celsius. Evite o contato entre a cama da gaiola e o local da cirurgia e monitore o animal de acordo com o protocolo descrito no texto.

Aos quatro a seis semanas após o transplante, após eutanasiar o camundongo de acordo com o protocolo descrito, use uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal cortando simultaneamente a pele e a fáscia. Usando a tesoura como afastador, dissecar o tecido conjuntivo acima do peritônio ao longo da linha alba para abrir a cavidade peritoneal. Com uma pinça, levante o esterno.

Em seguida, perfure o diafragma e corte cada lado do esterno até o cinturão cervical. Seccione a veia cava no lado torácico do fígado e puxe o esôfago através do fígado em direção anterior. Remova o diafragma e, usando-o como alça, comece a puxar o fígado para fora da cavidade abdominal.

A veia cava inferior estará mantendo o fígado no lugar. Portanto, corte a veia cava inferior tomando cuidado para não liberar prematuramente a glândula adrenal direita. Separe os lobos do fígado uns dos outros nas junções e incorpore-os em OCT de acordo com o protocolo do fabricante.

Congele a OCT contendo o tecido hepático nas grades metálicas do criostato. Com o criostato, corte seções de amostra com cinco micrômetros de espessura a menos 18 graus Celsius e monte-as em lâminas de microscópio à temperatura ambiente. Armazene o estoque a menos 80 graus Celsius.

Por fim, prepare as lâminas para coloração com H&E de acordo com procedimentos previamente descritos e para ELISA de acordo com o protocolo descrito no texto. Como mostrado nestas seções coradas com H&E, camundongos tratados com DT exibiram uma arquitetura hepática desorganizada e apresentaram correção da congestão com aumento da atividade sérica de AST. Seis semanas após o transplante, células derivadas de células-tronco hepáticas humanas reconstituíram a estrutura do fígado substituindo os hepatócitos residentes do camundongo.

Macroscopicamente, quatro dias após o transplante, foram detectados pequenos aglomerados hepáticos humanos uniformemente distribuídos ao redor do fígado. Aos 45 dias, os aglomerados haviam proliferado formando grandes aglomerados. Como visto aqui, a presença de hepatócitos humanos em fígados de camundongos foi inicialmente confirmada seis semanas após o transplante por meio de coloração com anticorpos contra núcleos humanos e citoceratina 8/18.

Hepatócitos humanos ALB positivos e CK19 negativos assemelhavam-se a hepatócitos funcionais, enquanto células que apresentaram dupla marcação positiva para ALB humano e CK19 exibiram capacidade bi-potencial de diferenciação em hepatócitos e colangiócitos. Detectou-se a presença de múltiplos agregados arredondados ao redor dos lóbulos hepáticos, com núcleos humanos evidentes e expressão de CK8/18, demonstrando a capacidade de formação de colônias das células-tronco hepáticas humanas nos fígados humanizados. Por fim, o nível de repovoamento atingiu até 90% um mês após o transplante, e a secreção de Albúmina humana foi detectada nos fígados de camundongos repovoados.

Uma vez dominada, a transplantação cirúrgica de células pode ser realizada em 10 minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a lesão hepática deve ser restrita ao fígado suplente. Em caso de vazamento celular, a transplantação de células deve ser evitada.

Combinado com este procedimento, outros métodos, como a transfeção gênica para reprogramação direta in vitro com células humanas, podem ser realizados a fim de explorar a convergência de células humanas com nosso modelo atual. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de hepatologia explorarem o metabolismo de medicamentos em humanos, interações entre medicamentos, toxicidade hepática e o vírus da hepatite em um modelo de fígado humanizado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e expandir a célula-tronco hepática, induzir lesão hepática e transplantar uma célula via baço para gerar um modelo de camundongo quimérico com função hepática humana.

Não se esqueça de que a toxina da difteria pode ser controlada e de que precauções importantes, como evitar a necrose do coração e do fígado, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.