Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

O objetivo geral deste método é gerar embriões de peixe-zebra parabióticos, que podem ser usados para estudar funções intrínsecas celulares versus extrínsecas celulares para genes candidatos de interesse. Este método pode ajudar a responder a questões-chave de autonomia celular. Por exemplo, no sistema hematopoético, defeitos vitais na migração de HSCs são intrínsecos às HSCs ou ao microambiente de nicho.

A principal vantagem deste protocolo é uma capacidade aprimorada de gerar com sucesso embriões parabióticos de peixe-zebra. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque os embriões em desenvolvimento são extremamente frágeis e facilmente danificados. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de costura cirúrgica podem ser difíceis de aprender porque exigem um alto grau de exatidão e precisão.

Aqui, fornecemos instruções passo a passo para gerar embriões de peixe-zebra parabióticos por fusão cirúrgica de blástulas em desenvolvimento. Este método demonstra como aumentar a eficiência das fusões parabióticas e aumentar a sobrevivência de embriões siameses. Depois de preparar reagentes e ferramentas de acordo com o protocolo de texto, prepare duas a três pipetas Pasteur modificadas aquecendo brevemente a extremidade da pipeta em um bico de Bunsen.

Em seguida, usando uma pinça grande, enquanto ainda está quente, dobre a extremidade da pipeta aproximadamente 45 graus. Para garantir que não haja bordas afiadas que possam danificar os embriões, mantenha a ponta da pipeta sobre um bico de Bunsen por um a dois segundos. Usando DNA plasmático, mRNA ou morfolino, microinjete embriões dentro de uma hora após a coleta e permita que eles se desenvolvam até o estágio de 256 células.

À medida que os embriões se aproximam do estágio 256 celular, transfira cada fundo genético para placas separadas revestidas de agarose, copos de vidro sem arranhões ou placas de Petri. Após a descorionação dos embriões de acordo com o protocolo de texto, descongele a metilcelulose previamente preparada e use uma centrífuga de mesa na velocidade máxima para granular cristais não dissolvidos, o que danificará os embriões ou romperá as gemas. Enquanto isso, usando um marcador, marque de 12 a 15 pontos pré-determinados na parte inferior de uma placa de Petri revestida de agarose de 100 mililitros.

Em seguida, após a centrifugação, usando a fração superior clara da metilcelulose, transfira de uma a 1,5 centímetro gotas para os pontos marcados na placa de Petri. Em seguida, prepare uma alíquota de 40 mililitros de ringer com alto teor de cálcio ou solução de HCR por prato revestido de agarose recém-preparado. Para cada alíquota, adicione antibióticos conforme listado aqui.

Quando estiver pronto para realizar fusões de blástulas, use as alíquotas de HCR com antibióticos para preencher cuidadosamente cada prato contendo as gotículas de metilcelulose, tomando cuidado para não romper as gotículas. Conecte uma pipeta Pasteur de vidro modificada preparada anteriormente a uma bomba de pipeta de 10 mililitros. Em seguida, sob um estereoscópio, colete um embrião descorionado de cada fundo.

Antes de dispensar os dois embriões, use a pipeta Pasteur para fazer uma pequena depressão no meio da gota de metilcelulose. Em seguida, deposite os dois embriões na depressão. Agora, usando uma agulha de provocação com uma ponta de carregamento de gel na extremidade, use movimentos suaves de varredura sem tocar diretamente nos embriões para reposicionar cuidadosamente os embriões dentro da metilcelulose, de modo que seus pólos animais se toquem diretamente.

Orientar adequadamente os embriões em desenvolvimento determina como os embriões se fundirão e se desenvolverão. Para fusões frente a frente, certifique-se de que cada fusão esteja alinhada em seus pólos animais. Deixe os embriões descansarem por cinco minutos para que a metilcelulose se acomode ao redor deles.

Durante esse tempo, carregue o próximo par em outra queda. Para realizar a cirurgia, usando a ferramenta de agulha de vidro, enrole cuidadosamente cada embrião em seu ponto de contato. Em seguida, com um movimento suave de costura, puxe as células do primeiro embrião para o segundo embrião e vice-versa.

No final do movimento, segure a agulha no lugar por dois a três segundos antes de retirá-la muito lentamente. A precisão com a agulha de vidro é fundamental para garantir que os embriões sejam costurados adequadamente. Deve-se ter cuidado para não danificar os sacos vitelinos, mantendo conexão suficiente para uma fusão bem-sucedida.

Deixe os embriões descansarem por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, costure pares adicionais de embriões. Após a incubação, avalie se os embriões permaneceram presos e repita a etapa de ferimento, se necessário.

Incube os embriões no mesmo prato e meio a 28,5 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, os embriões terão saído da metilcelulose quase dissolvida. Remova todos os embriões que não se fundiram com sucesso.

Em seguida, transvase o meio e use 25 mililitros de E3 para substituí-lo. Para adquirir imagens dos embriões fundidos, prepare agarose de baixo ponto de fusão a 0,8%. Enquanto ainda estiver quente, alíquota de 1 mililitro da agarose em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro colocados em um bloco de aquecimento de 37 graus Celsius.

Anestesiar os embriões parabióticos adicionando um mililitro de quatro miligramas por mililitro de tricaína pH 7,0 aos 25 mililitros de meio E3 contendo os embriões. Gire suavemente o prato para que os embriões se acumulem no meio. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga, retire os embriões com o mínimo de líquido possível.

Em seguida, vire a pipeta na vertical e salte suavemente os embriões para que eles se acomodem no fundo da pipeta. Em seguida, transfira os embriões para uma alíquota de 1 mililitro de agarose de baixo ponto de fusão, tocando levemente a ponta da pipeta na superfície da agarose. Descarte qualquer excesso de líquido da pipeta e use a pipeta para misturar suavemente os embriões na agarose.

Em seguida, com a pipeta, transfira a agarose e os embriões para o poço de uma placa de seis poços com fundo de vidro. Sob um estereomicroscópio, use uma ponta de carregamento de gel afixada na extremidade de uma agulha de provocação para posicionar os embriões próximos à lamínula e na orientação desejada para a imagem. Depois que a agarose endurecer e o meio com tricaína for adicionado aos poços, use um microscópio confocal de varredura a laser de epifluorescência de campo amplo invertido ou um microscópio confocal de disco giratório para adquirir imagens.

Para um campo de visão de embrião inteiro, use uma objetiva 4X. Use uma objetiva de 20X para obter imagens de um tecido específico. Processe as imagens de acordo com o protocolo de texto.

Como mostrado aqui, depois de orientar duas blástulas com seus pólos de animais voltados um para o outro, os embriões foram cuidadosamente feridos em seu ponto de contato. Um maior grau de ferimento aumentou a probabilidade de os embriões manterem uma conexão que resultou em uma fusão bem-sucedida sem defeitos morfológicos adicionais ou atraso no desenvolvimento. Conforme demonstrado nesta figura, orientando as duas blástulas com seus pólos animais diretamente alinhados, fusões confiáveis de cabeça a cabeça ou saco vitelino a saco vitelino foram geradas com circulação compartilhada.

Na maioria dos casos, os embriões tinham dois corações bombeando uma circulação comum compartilhada. Para confirmar que os embriões realmente compartilhavam sua circulação, embriões transgênicos fundidos que tinham eritrócitos positivos para GFP foram fundidos a embriões que tinham células endoteliais vasculares positivas para mCherry. Como visto neste filme, 48 horas após a fertilização, eritrócitos positivos para GFP foram observados circulando através do embrião parceiro Flik 1 HRAS mCherry.

Finalmente, para investigar o controle temporal da expressão gênica, um dos dois embriões foi injetado com uma construção de DNA hsp70 EGFP. Após um breve choque térmico de 30 minutos a 37 graus Celsius, um sinal claro de GFP foi estabelecido em um dos embriões e, em alguns casos, células positivas para GFP foram vistas circulando no embrião parceiro não injetado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado ao costurar as duas blástulas e revisitar as fusões se a cirurgia não for bem-sucedida na primeira tentativa. Após este procedimento, métodos adicionais, como imagens de células vivas, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como se as HSCs do tipo selvagem podem funcionar normalmente em um nicho mutante ou, inversamente, se as HSCs mutantes podem funcionar em um nicho do tipo selvagem. Essa técnica fornece um método poderoso para pesquisadores no campo da hematologia estudarem a regulação do desenvolvimento sanguíneo no peixe-zebra.

Não se esqueça de que o tricaince pode ser perigoso e precauções como o uso de trajes de segurança adequados devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento. Depois de assistir a este vídeo e seguir nossas técnicas recomendadas, esperamos que você consiga gerar melhores embriões bióticos de peixe-zebra com maior sucesso.