Name: Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a gerar embriões parabióticos de zebrafish por fusão cirúrgica de blastulas em desenvolvimento. Este método permite investigar funções autônomas versus não autônomas de genes candidatos em Danio rerio.

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Agradecemos a Julie R. Perlin pelos comentários úteis sobre o manuscrito. D.I.S. é apoiado por doações da Sociedade Americana de Hematologia, da Cooley's Anemia Foundation e do NIH (K01DK085217 e R03DK100672). E.J.H. é membro do Howard Hughes Medical Institute da Helen Hay Whitney Foundation. B.L. é Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. é apoiado por uma bolsa Irvington do Cancer Research Institute e um Young Investigator Prêmio da Conquer Cancer Foundation da ASCO. L.I.Z. é apoiado por doações do NIH (R01CA103846, P01HL032262 e R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute e é investigador do Howard Hughes Medical Institute.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Hospital Infantil de Boston. Este protocolo é modificado de um método previamente publicado a 15. 1. Preparação de Reagentes (dias ou semanas de antecedência) <ol><li> Prepare 1,5% pratos revestidos por agarose. Adicionar 1,5 g de agarose a 100 ml de meio de Zebrafish E3 em uma garrafa de Erlenmeyer. Calor, dissolver a agarose, e depois verter em aproximadamente 5 ml de 100 mm de diâmetro x 20 mm de placas de petri profundas. Nota: Estes são usados ​​para dechorionation de embriões (Etapa 3.1) e para a cirurgia parabiótica (Passo 3.3). Armazenar pratos de agarose revestidas a 4 ° C durante algumas semanas; levá-los para fora do frigorífico e aquecimento à temperatura ambiente na manhã do dia da cirurgia parabiótica. </li><li> Prepare a 4% de metil-celulose. Dissolve-se 4 g de pó de celulose de metilo em 100 ml de E3, em um balão de Erlenmeyer com uma barra de agitação. Colocar o balão sobre uma placa de agitação a 4 ° C, definida para a velocidade mais baixa, e deixá-lo misturarpor até 2 dias. <ol><li> Intermitentemente use uma espátula para quebrar aglomerados brancos de metil-celulose. Os cristais de metil celulose não se dissolve totalmente nesta concentração. Quando a solução se torna claro e parece homogénea, sem grumos brancos restante, parte alíquota da solução em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e congelamento a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Nota: as concentrações mais baixas de metilcelulose pode ser utilizado; No entanto, esta percentagem mais elevada, metilcelulose mais viscoso produziu os melhores resultados. </li></ol></li><li> Preparar a solução de cálcio elevado Ringer (HCR). Para fazer 400 ml de solução HCR, mistura 8 mL de 5M NaCl (116 mM final), 400 ul de KCl 3M (2,9 mM final), 800 ul de 5M de CaCl2 (10 mM final) e 2 mL de HEPES 1 M (5 mM final) com 390 ml de meio E3. Nota: A solução da loja HCR a 4 ° C durante algumas semanas; aquecimento à temperatura ambiente na manhã do dia da cirurgia parabiótica. </li><li> Prepare 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para a transferênciatocar blástula pares. Resumidamente aquecer a extremidade da pipeta ao longo de um bico de Bunsen. Em seguida, usando uma pinça grandes, dobrar a extremidade da pipeta para aproximadamente 45 ° C, enquanto ele ainda está quente. <ol><li> Para garantir que não existem arestas cortantes que possam danificar embriões, segure a ponta da pipeta brevemente na chama por cerca de 3 segundos. Isto irá suavizar / polonês a extremidade da pipeta. Esta pipeta de Pasteur de vidro modificado é utilizado em conjunto com uma pipeta 10 ml de bomba (Figura 1) no passo 3.5 a seguir. </li></ol></li><li> Preparar as ferramentas de seringas de vidro para costura cirúrgica de pares de blástula. Puxe 2 - 3 agulhas de vidro como se fez para microinjeção de embriões de peixe-zebra. Use laboratório de película para corrigir cada agulha de vidro para o final de uma agulha provocação lenha ou de plástico de cabo (Figura 1A). Usando fórceps, parta a ponta da agulha com um diâmetro de cerca de 20 - 30 | im. Use um micrômetro estágio para orientar esta etapa (Figura 1B). Nota: O tamanho do NEponta edle é importante. Se a ponta for muito grande, torna-se difícil de controlar com precisão e pode causar danos excessivos. Se a ponta é demasiado pequeno, é difícil para os embriões suficientemente enrolada. </li></ol> 2. Criação de casais reprodutores de Zebrafish e colheita de embriões (dia -1 para o Dia 0) <ol><li> Configurar casais reprodutores de peixe-zebra adulto. Configurar peixes na noite anterior à cirurgia parabiosis deve ser conduzida. Use divisórias para separar machos e fêmeas. Para aumentar as chances de que os embriões desejados serão obtidos, criados vários pares de cada linha. Nós achamos que tipicamente 20 - 50% dos pares vão aparecer. </li><li> Na manhã seguinte, retire os divisores e permitir o acasalamento. Recolher qualquer embriões usando um chá coador de malha fina, em seguida, transferi-los para uma placa de Petri contendo meio embrião E3 18. </li><li> Embriões micro-injectar como desejado (por exemplo, com 25 pg de DNA de plasmídeo, 200 pg de ARNm, ou com 1-6 ng morfolino) dentro de 1 hora da recolha. Permitir-lhescrescer até o estágio de 256 células. Se a construção de expressão de ADN é colocado sob o controlo de um promotor de choque térmico (por exemplo, hsp70, Figura 4B), controlar o momento da expressão do gene pelo calor chocar os parabionts a 37 ° C, numa fase posterior (por ex., Em 36 HPF ). Nota: Como uma alternativa para um transgene fluorescente, dextrano fluorescente pode ser adicionado ao DNA, RNA, ou mistura de injecção morfolino (por exemplo, dextrano, azul cascata a 2 mg / ml). O corante de dextrano não irá interferir com o desenvolvimento normal e permitirão que para o embrião injectada a ser identificado sob a luz fluorescente apropriado após a fusão parabiótica. Alternativamente, o parabiose de uma estirpe pigmentado (por exemplo, AB), com uma estirpe não-pigmentadas (por exemplo, Casper) poderia ser usado para identificar o embrião injectado em fases posteriores. </li><li> Incubar os embriões a 28,5 ° C.Use um estereoscópio para acompanhar o seu desenvolvimento periodicamente conforme eles se aproximam o dev de 256 célulasestágio elopmental (aproximadamente 2,5 hpf). Nota: Se necessário, deslocar embriões a diferentes temperaturas para garantir fase correspondência entre os parceiros parabiótica (por exemplo, os embriões injetados-morfolino desenvolvem frequentemente mais lento do que os seus homólogos com injecção de un Mudando os embriões injetados pela ONU para RT enquanto os embriões injetados-morfolino são colocados. a 28,5 ° C resultará em seus estágios alinhando depois de um par de horas de desenvolvimento). </li></ol> 3. Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas <ol><li> À medida que os embriões se aproximar da fase de 256 células (aproximadamente 2,5 HPF), transferir os embriões a partir de cada fundo genético (isto é, mutante genética, linhas transgénicas e / ou manipulação genética) em placas revestidas com agarose separadas (por exemplo, um prato para morfolino- embriões injetados e um segundo prato de embriões de controle). Em alternativa, transferir os embriões para limpar, copos de vidro sem riscar ou placas de Petri de vidro. Nota: Evite o uso de pratos de plástico não revestidos, como os embriões vai ficar com o plástico e ser danificado uma vez fora de seus córions. </li><li> Decantar os meios E3 até que apenas permanece líquido suficiente para cobrir os embriões (aproximadamente 7 - 10 ml). Adicionar 200 ul de 50 mg / ml de mistura de proteases isoladas a partir do fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteases). Agitar os embriões suavemente a cada dois minutos. <ol><li> Quando 50% dos embriões têm de sair de suas córions, que normalmente leva 5 - 10 min, lavá-los três vezes com um volume generoso (cerca de 15 - 20 ml) de meio E3 embrião fresco. <ol><li> Dechorionate quaisquer embriões restantes em seus córions delicadamente sua elaboração para a pipeta Pasteur de vidro modificado e, em seguida, delicadamente desfazendo-los. Uma vez que os embriões foram dechorionated e lavou-se, substitua a mídia E3 com uma solução de HCR. Como uma alternativa a proteases, remover os córions manualmente utilizando uma pinça fina. Objectivo de ter 60-100 dechorembriões ionated disponíveis para cada condição experimental. Nota: Este é várias vezes mais do que acabará por ser utilizado, mas muitos embriões são susceptíveis de ser danificado durante o manuseamento ou a cirurgia para parabiose. Uma vez que os embriões são dechorionated, mantê-los submersa e não permitir que eles para tocar a superfície da água, como a tensão superficial vai levá-los a ser destruído. Tenha em mente que a utilização de uma dose mais elevada de proteases permite que os embriões para sair dos seus córions mais cedo e de forma mais sincronizada. Quando se utiliza uma dose inferior de proteases, os embriões demorar mais tempo a sair do seu córions e fazê-lo de uma forma síncrona menos, o que pode resultar em uma porção dos embriões ser danificada por exposição prolongada a proteases. </li></ol></li></ol></li><li> Descongelar o metilcelulose (feita no Passo 1.2 acima) e centrifugar em uma centrífuga de mesa na velocidade máxima de 10 min para sedimentar cristais não dissolvidos que irá danificar os embriões ou ruptura, os seus gemas. <ol><li> Após centrifugação, utilizar a fracção superior clara (aproximadamente 75% do volume). Transferir 1 - gotas com diâmetro de 1,5 cm de metil celulose em uma placa de Petri de 1,5% de agarose-revestido. Tome cuidado para evitar a elaboração de qualquer um dos cristais peletizadas a partir do fundo do tubo. </li><li> Use um marcador para predeterminar a posição de cada gotícula no lado inferior do prato. Coloque 12 - 15 gotas (2 - no valor de 3 alíquotas &#39;) de metil celulose por 100 milímetros de diâmetro prato de petri. Prepare como muitos pratos como necessários por experimento. Nota: Use cada gota para a fusão de um único par de blástula. A marca irá designar a localização de cada gota uma vez que a mídia é acrescentado no ponto em que as gotas se tornam quase invisíveis. </li></ol></li><li> Preparar 40 ml de uma alíquota de solução de HCR suplementado com antibiótico por prato revestido-agarose, preparada antes no passo 3.3. Para cada 40 ml de aliquota de HCR adicionar penicilina-estreptomicina a 50 U / ml de ampicilina, a 50 U / ml e canamicina a 0,5 ug/ Ml. <ol><li> Quando estiver pronto para executar blástula fusões, preencher cuidadosamente cada uma das placas contendo gotículas de celulose de metilo com 40 ml da solução de HCR suplementado com antibiótico. Se a solução HCR for adicionada muito rapidamente, pode perturbar as gotículas. </li></ol></li><li> Anexar a pipeta Pasteur de vidro modificado (feita no Passo 1.4 acima) para uma bomba de pipeta de 10 ml. Sob um estereoscópio recolher um embrião dechorionated de cada fundo (por exemplo, um embrião com injecção de morfolino e um tipo selvagem de embriões). <ol><li> Antes de fornecer as duas embriões, utilizar a pipeta de Pasteur para fazer uma pequena depressão no meio da queda de metil celulose, então suavemente depositar ambos os embriões para a depressão. Nota: Durante o processo de transferência, transformar a pipeta de Pasteur ligeiramente para cima de modo que os embriões se adaptar à curvatura da pipeta de Pasteur de modo a evitar o seu contacto tomada com a superfície do líquido, na parte superior ou inferior da pipeta (o que pode levar para theiruptura r). </li></ol></li><li> Imediatamente após a deposição dos embriões em que a celulose de metilo, usar uma agulha provocando a lenha ou plástico tratado com uma ponta de pipeta de gel de carga na extremidade (Figura 1A) para reposicionar cuidadosamente os embriões dentro da metil-celulose de tal modo que os seus pólos animais são directamente tocando um ao outro. <ol><li> Utilize movimentos arrebatadores suaves através da metil-celulose perto dos embriões para reposicioná-los sem tocá-los diretamente. Deixe os embriões sentar-se por 5 minutos para que o metil celulose vai se estabelecer em torno deles. Durante este tempo, carregar o próximo par em outra queda. Nota: Evite o contato direto com os embriões e ter um cuidado especial para não tocar qualquer parte do saco vitelino, que facilmente se romper. </li></ol></li><li> Usando a ferramenta de agulha de vidro, cuidadosamente enrolado cada embrião no seu ponto de contato. Com um movimento suave costura, células a partir do primeiro embrião pode ser puxado para dentro do segundo embrião e, em seguida, novamente.No final deste movimento, segure a agulha no lugar de 2-3 segundos e depois desenhá-lo afastado muito lentamente. Nota: Não é um período de cerca de 2-3 segundos após os embriões são feridos em que os dois tecidos parecem ser mais aderentes e mais provável para anexar a um outro. Assim, acreditamos que segura a agulha no lugar brevemente após o ferimento ajuda a manter os tecidos feridos de cada embrião em contacto durante o período inicial de tempo imediatamente após o ferimento. </li><li> Permitir que esses embriões para se sentar por 10 - 15 min a RT. Nesse meio tempo, continuar a costurar novos pares em outras gotas de metil-celulose. Após 10 - 15 minutos, avaliar se o primeiro par permaneceu ligada (Figura 2A). Nota: Se os embriões são mais tempo ligado, repetir o processo de costura, enquanto os embriões são mais jovens do que em torno da fase epiboly 30%. Normalmente, isso permite até três tentativas para costurar os embriões juntos. Se os embriões parecem ter mantido um anexo mas o cONEXÃO não é substancial, executar costura adicional na extremidade da ligação para o reforçar. Evitar agitar ou mover pratos durante os períodos de cirurgia e de incubação parabiótica. Nota: Apesar do seu estádio de desenvolvimento precoce e fragilidade percebido, as massas de células dos embriões pode tolerar uma quantidade substancial de manipulação (ou seja, ferindo e costura), e ainda se desenvolvem normalmente. A gema, no entanto, pode romper-se, apenas o menor toque, matando o embrião. Quando costurando os dois blástulas com a agulha de vidro, não de fazer contato com a interface entre a massa celular e gema de cada embrião. </li><li> Incubar os embriões O / N a 28,5 ° C no mesmo prato e meios de comunicação (não altere a mídia). Na manhã seguinte, os embriões ter saído das gotículas metil celulose principalmente dissolvidos. Remova todos os embriões que não foram fundidas com sucesso. Decantar a mídia e substituir por um novo 25 ml E3. Nota: Se trabalhar com umestirpe pigmentada, adicionar 500 ul feniltioureia 0,15% (50x) (PTU) para uma concentração final de 0,003% para bloquear a pigmentação. Embriões terá de permanecer continuamente em PTU para manter a supressão de pigmentação. </li></ol> 4. Setup microscópio, aquisição de imagens, processamento e análise <ol><li> Prepare 0,8% de agarose de baixo ponto de fusão (LMP): Adicionar 0,8 g LMP agarose a 100 ml E3 e calor até que esteja totalmente dissolvido. Enquanto quente, alíquota de 1 ml de agarose LMP em 1,5 ml tubos de microcentrífuga em um bloco de aquecimento C 37 °. A agarose LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Adicionar 40 ul de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaina a cada alíquota de 1 ml de agarose LMP a 37 ° C. Nota: Se estiver trabalhando com uma cepa pigmentada, adicionar 20 mL de 0,15% (50x) PTU para cada alíquota de 1 ml. <ol><li> Armazenar a agarose LMP restante durante vários meses em tubos de 50 ml selados a 4 ° C. </li></ol></li><li> Anestesiar embriões parabiótica a ser trabalhada pela adição de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricainapara os 25 ml de E3 que os embriões se encontra. </li><li> Agite suavemente o prato de modo que os embriões serão piscina no meio. Em seguida, usando uma pipeta de plástico de largura de ponta elaborar os embriões em tão pouco de líquido possível. Vire a pipeta na posição vertical e gentilmente saltar os embriões para que eles se depositam no fundo da pipeta. <ol><li> Com os embriões na parte inferior da pipeta, transferi-los para uma aliquota de 1 ml de agarose LMP por tocar levemente a ponta da pipeta para a superfície da agarose. Evitar a transferência de líquido em excesso, pois isso irá diluir a agarose. </li></ol></li><li> Depois de expulsar o excesso de líquido da pipeta, use a pipeta para misturar delicadamente os embriões dentro do agarose, em seguida, use a pipeta para transferir todo o agarose e embriões para o bem de um-fundo de vidro (No. 1.5 lamela), 6- bem placa. Nota: Certifique-se de descartar a pipeta após a transferência dos embriões para a placa de imagem. agarose residual irá definir dentro da pipeta, rendering-lo ineficaz para uso posterior. Em vez disso, utilizar uma pipeta de novo de cada vez. </li><li> Sob um estereoscópio, utilizar uma ponta de pipeta de gel de carregamento fixado na extremidade de uma agulha de provocação de cabo de madeira para posicionar os embriões para baixo para a tampa de vidro (para assegurar que estão dentro da distância de trabalho do objectivo microscópio) e na orientação desejada para imagiologia. Nota: Reposicionar continuamente até que a agarose foi totalmente definida. Tome o cuidado de montar os embriões parabiótica segundo a qual embrião do par está a ser trabalhada. Dada a orientação aleatória dos embriões conjugados, para alguns pares pode ser difícil para a imagem ambos os embriões. Neste cenário, recuperar os embriões a partir da agarose usando uma pinça e uma pipeta de plástico de largura de ponta e remontar para geração de imagens a partir de uma perspectiva diferente. </li><li> Uma vez que a agarose definiu, cobrir com 2 - 3 ml de E3 suplementadas com tricaina (PTU e, se necessário). </li><li> Imagem dos embriões usando um grande campo de epi-fluorescência invertido, laser-varredura confocal, ou girando disco microscópio confocal. Seleccionar o objectivo mais adequado para a imagem desejada. Para um campo de todo o embrião de vista, use um objectivo de 4x. Seleccionar uma ampliação mais elevada, tal como uma objectiva de 20x, a imagem de um tecido específico 16, 19. Nota: Se estiver usando um microscópio vertical, montagem em LMP agarose (semelhante ao anterior) em uma lamela de vidro. Inverter a lamela de vidro sobre uma lâmina de microscópio de vidro que tem um anel de graxa de vácuo preenchido com o mesmo E3-tricaina-PTU 16, 19. </li><li> Processo de aquisição de imagens usando pacotes gratuitos de software de análise de imagem, tais como NIH Imagem J / FIJI 16, 19. Nota: Contagem o número de células e quantificar a dinâmica como a migração celular e divisão celular usando segmentação e rastreamento algoritmos 16, 19. </li></ol>

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Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Fusion parabiótica tem sido uma ferramenta poderosa para investigar as funções celulares de genes candidatos em modelos murinos adultos e embriões de galinha 10-14. Mais recentemente, um método de fusão blástula foi descrito para a geração de embriões de peixe-zebra siameses 15. No presente protocolo, tutoriais em vídeo são usados ​​para demonstrar e descrever a metodologia para a criação de embriões de peixe-zebra parabiótica de diferentes origens genéticas para estudar funções temporais, células-...

Criação de mosaicos genéticos (quimeras) entre o tipo selvagem e animais geneticamente modificados é uma estratégia bem estabelecida e clássica para a investigação de células-intrínseca contra as funções das células-extrínseca de genes candidatos 1-6. Blástula transplante no peixe-zebra tem sido amplamente utilizada para gerar embriões quiméricos para estudos de célula-autonomia 7-9. Dependendo do tecido de interesse, no entanto, pode ser um desafio para segmentar previsivelmente células do doador para o tecido desejado (por exemplo, sangue) 1-3, 7-9. Geneticistas rato há muito utilizados métodos cirúrgicos parabiótica para gerar organismos siameses com uma circulação compartilhada 10-14. Porque os animais parabiótica compartilhar uma corrente sanguínea comum, as interações entre células que se originou a partir de um animal com células do outro animal de um fundo genético diferente podem ser estudadas 10-16. Recentemente, o grupo de Karima Kissa demonstraram elegantemente a capacidade de crecomeu embriões de peixe-zebra siameses e depois usar este sistema para estudar tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) a migração 15. Além disso, parabiosis peixe-zebra foi recentemente utilizado para investigar o papel da caderina endotelial 5 em células-tronco hematopoiéticas (HSC) emergência e migração, 16 e estudar o papel das células do estroma no nicho HSPC durante o desenvolvimento do peixe-zebra 17. Ao contrário dos ratos, os embriões de peixe-zebra são transparentes e permitir a visualização directa das células durante o desenvolvimento parabiótica, tornando o sistema único e poderoso. O utilitário de parabiosis no peixe-zebra, no entanto, é limitada por uma curva de aprendizagem, e cirurgia parabiótica sobre os embriões delicados pode ser tecnicamente desafiadora, sem instruções detalhadas e demonstração visual. O objetivo deste protocolo é fornecer um conjunto de instruções claras, passo-a-passo para acompanhar tutoriais em vídeo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabiótica para estudartemporal de células-intrínseca, ou funções das células-extrínseca de um gene (s) candidato por fusão cirúrgica de desenvolver blástulas tetra. modificações importantes e recomendações adicionais para aumentar a sobrevida parabiont e novas aplicações experimentais estão incluídos.

<table><tbody><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Componentes individuais para E3/HCR:</td><td></td><td>Para 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (cloreto de sódio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (cloreto de potássio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (cloreto de cálcio di-hidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (sulfato de Magnessium heptahidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M) solução tampão</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Catálogo Número</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco da Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina de Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Nome </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase de Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>vidro capilar usado para agulhas (Vidro capilar & Filamentos)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de provocação com cabos de madeira</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta de 10 ml (verde) (Pipete de bomba de pipeta)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico de 100 mm de diâmetro / 20 mm de profundidade (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, TRANSPARENTE, COM ABERTURAS, DESIGN PESADO, 15 UNID./SACO)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, aniônico, lisina fixável</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. o estoque de trabalho é de 0,003% (50x é 0,15%). para 500 ml, 0,75 g de N-feniltioureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (pó) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)</td> <td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)</td> Pipeta de transferência de plástico <td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>(apenas a de ponta larga, eu acho)</td> <td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços com fundo de vidro usadas para imagens</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>ponta de carregamento de gel ocidental de plástico fixada na extremidade de uma agulha de dissecação com cabo de madeira (pontas GELoader)</td> <td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de cobertura de vidro, lâminas e graxa a vácuo se estiver montando para um microscópio vertical:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Graxa de vácuo ( Dow Corning&reg; graxa de silicone de alto vácuo incolor, peso 5,3 oz (tubo) )</td> <td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas</td> <td>de cobertura de vidroCiências da Vida Corning</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de parabiótica embriões zebrafish por fusion cirúrgica de desenvolvimento blástulas

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

parabiosis cirúrgica de dois animais de diferentes origens genéticas cria um cenário único para estudar células-intrínseca contra papéis de células-extrínseca para genes candidatos de interesse, comportamentos migratórios de células e sinais de secretada em configurações genéticas distintas. Porque os animais parabiótica compartilhar uma circulação comum, qualquer sangue ou fator transmitidas pelo sangue de um animal serão trocadas com o seu parceiro e vice-versa. Assim, as células e os factores moleculares derivadas de um fundo genético pode ser estudado no contexto de um segundo fundo genético. Parabiose de ratinhos adultos tem sido amplamente utilizado para a pesquisa do envelhecimento, cancro, diabetes, obesidade, e desenvolvimento do cérebro. Mais recentemente, parabiose de embriões de peixe-zebra foi usado para estudar a biologia do desenvolvimento da hematopoiese. Em contraste com os ratinhos, a natureza transparente de embriões de peixe-zebra permite a visualização directa das células no contexto parabiótica, tornando-se um método único e poderoso para a investigação de fmecanismos celulares e moleculares undamental. A utilidade desta técnica, no entanto, é limitado por uma curva de aprendizagem para gerar os embriões de peixe-zebra parabiótica. Este protocolo fornece um método passo-a-passo sobre como cirurgicamente fundir o blástulas de dois embriões de peixe-zebra de diferentes origens genéticas para investigar o papel de genes candidatos de interesse. Além disso, os embriões de peixe-zebra parabiótica são tolerantes ao choque térmico, tornando o controlo temporal da expressão do gene possível. Este método não requer um sofisticado set-up e tem amplas aplicações para estudar a migração de células, especificação de destino, e diferenciação in vivo durante o desenvolvimento embrionário.

Consistente com os estudos anteriormente publicados 15, parabiótica fusão bem sucedida de embriões de peixe-zebra depende do armazenamento temporário e da orientação dos dois embriões e a concentração de metilcelulose. Com apenas alguns simples, ferramentas de baixo custo, blástulas tetra desenvolvimento cirurgicamente fundidos foram gerados que cresceu em embriões parabiótica com circulação compartilhada. Estas ferramentas incluída uma pipeta Pasteur modificado, uma bomba de ...

Este protocolo fornece instruções passo a passo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabióticos de diferentes origens genéticas. Quando combinado com os recursos de imagem incomparáveis do embrião de peixe-zebra, esse método fornece um meio excepcionalmente poderoso para investigar funções autônomas e não autônomas de células para genes candidatos de interesse.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

O objetivo geral deste método é gerar embriões de peixe-zebra parabióticos, que podem ser utilizados para estudar funções intrínsecas à célula versus extrínsecas à célula para genes candidatos de interesse. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre autonomia celular. Por exemplo, no sistema hematopoético, defeitos vitais na migração de CSHs são intrínsecos às próprias CSHs ou ao microambiente nicho.A principal vantagem deste protocolo é a capacidade aprimorada de gerar com sucesso embriões de peixe-zebra parabióticos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois os embriões em desenvolvimento são extremamente frágeis e facilmente danificados. A demonstração visual deste método é essencial, já que os passos de sutura cirúrgica podem ser difíceis de aprender, pois exigem alto grau de exatidão e precisão.Aqui fornecemos instruções passo a passo para gerar embriões de peixe-zebra parabióticos por meio da fusão cirúrgica de blastulas em desenvolvimento. Este método demonstra como aumentar a eficiência das fusões parabióticas e melhorar a sobrevivência dos embriões conjugados. Após preparar os reagentes e ferramentas de acordo com o protocolo descrito, prepare duas a três pipetas Pasteur modificadas aquecendo brevemente a extremidade da pipeta sobre um bico de Bunsen.Em seguida, utilizando pinças grandes, enquanto ainda estiver quente, dobre a extremidade da pipeta em aproximadamente 45 graus. Para garantir que não haja bordas afiadas que possam danificar os embriões, mantenha a extremidade da pipeta sobre um bico de Bunsen por um a dois segundos. Utilizando DNA plasmídico, mRNA ou morpholino, injete microscópicamente os embriões dentro de uma hora após a coleta e permita que eles se desenvolvam até a fase de 256 células.À medida que os embriões se aproximam do estágio de 256 células, transfira cada background genético para placas revestidas com agarose, béqueres de vidro sem riscos ou placas de Petri separados. Após a descorionação dos embriões de acordo com o protocolo descrito, descongele a metilcelulose previamente preparada e utilize uma centrífuga de bancada em velocidade máxima para formar um pellet com os cristais não dissolvidos, os quais podem danificar os embriões ou romper as gemas. Enquanto isso, usando uma caneta marcadora, marque de 12 a 15 pontos predeterminados no lado inferior de uma placa de Petri de 100 mililitros revestida com agarose.Em seguida, após a centrifugação, utilizando a fração superior clara da metilcelulose, transfira gotas de um a 1,5 centímetro para os pontos marcados na placa de Petri. Depois, prepare uma alíquota de 40 mililitros de solução de Ringer com alto teor de cálcio, ou solução HCR, para cada placa recoberta com agarose acabada de preparar. A cada alíquota, adicione os antibióticos listados aqui.Quando estiver pronto para realizar as fusões de blástula, use as alíquotas de HCR com antibióticos para preencher cuidadosamente cada placa contendo as gotas de metilcelulose, tomando cuidado para não perturbar as gotas. Acople uma pipeta de vidro de Pasteur modificada, preparada anteriormente, a uma pipeta automática de 10 mililitros. Em seguida, sob um estereoscópio, colete um embrião descorionado de cada linhagem genética.Antes de dispensar os dois embriões, use a pipeta de Pasteur para fazer uma pequena depressão no centro da gota de metilcelulose. Em seguida, deposite os dois embriões na depressão. Agora, usando uma agulha de dissecação com ponteira para carregamento de géis na extremidade, realize movimentos suaves de varredura sem tocar diretamente nos embriões, reposicionando-os cuidadosamente dentro da metilcelulose, de modo que seus polos animais estejam em contato direto um com o outro.O correto posicionamento dos embriões em desenvolvimento determina como eles irão se fundir e se desenvolver. Para fusões cabeça com cabeça, certifique-se de que cada fusão esteja alinhada nos seus polos animais. Deixe os embriões em repouso por cinco minutos para que a metilcelulose se acomode ao redor deles.Neste período, carregue o próximo par em outra gota. Para realizar a cirurgia, utilizando a ferramenta de agulha de vidro, ferite cuidadosamente cada embrião no ponto de contato. Em seguida, com um movimento suave de costura, puxe as células do primeiro embrião para o segundo embrião e depois novamente de volta.No final do movimento, mantenha a agulha no lugar por dois a três segundos antes de retirá-la muito lentamente. A precisão com a agulha de vidro é fundamental para garantir que os embriões sejam corretamente costurados. É necessário ter cuidado para não danificar os sacos vitelinos, mantendo ao mesmo tempo uma conexão suficiente para uma fusão bem-sucedida.Deixe os embriões em repouso por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, costure pares adicionais de embriões. Após a incubação, verifique se os embriões permaneceram fixados e repita a etapa de lesão, se necessário.Incube os embriões no mesmo recipiente e meio a 28,5 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, os embriões terão saído da metilcelulose, que estará em grande parte dissolvida. Remova os embriões que não se fundiram com sucesso.Em seguida, decante o meio e utilize 25 mililitros de E3 para substituí-lo. Para obter imagens dos embriões fusionados, prepare agarose de ponto de fusão baixa a 0,8%. Enquanto ainda estiver quente, alíquota 1 mililitro da agarose em tubos microfuga de 1,5 mililitro colocados em um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius.Anestesie os embriões parabióticos adicionando um mililitro de tricaina a quatro miligramas por mililitro, pH 7,0, ao meio E3 de 25 mililitros contendo os embriões. Gire suavemente o recipiente para que os embriões se concentrem no centro. Em seguida, utilizando uma pipeta de transferência plástica de ponta larga, aspire os embriões com o menor volume de líquido possível.Em seguida, posicione a pipeta na posição vertical e movimente suavemente os embriões para que assentem completamente no fundo da pipeta. Então, transfira os embriões para uma alíquota de 1 mililitro de agarose de ponto de fusão baixa tocando levemente a ponta da pipeta na superfície da agarose. Descarte qualquer líquido excedente da pipeta e use a pipeta para misturar suavemente os embriões na agarose.Em seguida, com a pipeta, transfira o agarose e os embriões para o poço de uma placa de seis poços com fundo de vidro. Sob um estereomicroscópio, utilize uma ponteira para carregamento de gel fixada à extremidade de uma agulha de dissecação para posicionar os embriões próximos ao cubre-objeto e na orientação desejada para a aquisição de imagens. Após o agarose ter solidificado e o meio com tricaina ter sido adicionado aos poços, utilize um microscópio confocal de varredura a laser invertido com epifluorescência de campo amplo ou um microscópio confocal de disco giratório para adquirir as imagens.Para um campo de visão de embrião inteiro, utilize uma objetiva de 4X. Use uma objetiva de 20X para imagens de um tecido específico. Processe as imagens de acordo com o protocolo descrito no texto.Como mostrado aqui, após orientar duas blástulas com seus polos animais voltados um para o outro, os embriões foram cuidadosamente lesionados no ponto de contato. Um grau maior de lesão aumentou a probabilidade de os embriões manterem uma conexão que resultasse em uma fusão bem-sucedida, sem defeitos morfológicos adicionais ou desenvolvimento atrasado. Como demonstrado nesta figura, ao orientar as duas blástulas com seus polos animais diretamente alinhados, foram obtidas fusões confiáveis de cabeça com cabeça ou de saco vitelino com saco vitelino, com circulação compartilhada.Na maioria dos casos, os embriões possuíam dois corações bombeando uma circulação comum compartilhada. Para confirmar que os embriões realmente compartilhavam sua circulação, embriões transgênicos fundidos que tinham eritrócitos positivos para GFP foram fundidos a embriões que tinham células endoteliais vasculares positivas para mCherry. Como visto neste vídeo, 48 horas após a fertilização, eritrócitos positivos para GFP foram observados circulando pelo embrião parceiro Flik 1 HRAS mCherry.Por fim, para investigar o controle temporal da expressão gênica, um dos dois embriões foi injetado com um construto de DNA hsp70 EGFP. Após um breve choque térmico de 30 minutos a 37 graus Celsius, um sinal claro de GFP foi estabelecido em um dos embriões, e em alguns casos, células positivas para GFP foram observadas circulando no embrião parceiro não injetado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco horas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado ao unir os dois blastocistos e de repetir as fusões caso a cirurgia não tenha sido bem-sucedida na primeira tentativa. Após este procedimento, métodos adicionais, como o imageamento de células vivas, podem ser utilizados para responder outras questões, como se HSCs do tipo selvagem podem funcionar normalmente em um nicho mutante ou, inversamente, se HSCs mutantes podem funcionar em um nicho do tipo selvagem. Esta técnica fornece um método poderoso para pesquisadores na área de hematologia estudarem a regulação do desenvolvimento sanguíneo em peixe-zebra.Não se esqueça de que a tricaina pode ser perigosa e precauções, como o uso de vestimentas de segurança apropriadas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após assistir a este vídeo e seguir nossas técnicas recomendadas, esperamos que você consiga gerar embriões de peixe-zebra bióticos com maior sucesso.

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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