Um ensaio-Free Cell Usando
8 de agosto de 2016
Os mecanismos de escalonamento celular e intracelular permanecem indescritíveis. O uso de extratos de embriões de Xenopus tem se tornado cada vez mais comum para elucidar mecanismos de regulação do tamanho das organelas. Este método descreve a preparação do extrato de embrião e um novo ensaio de escala nuclear através do qual os mecanismos de regulação do tamanho nuclear podem ser identificados.
O objetivo geral deste procedimento é utilizar extratos de ovo e embrião de Xenopus para produzir um ensaio no qual núcleos maiores reduzem os menores. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia celular nuclear, como quais são os mecanismos que regulam o tamanho nuclear? A principal vantagem desta técnica é que a composição e as atividades do extrato livre de células de Xenopus podem ser facilmente manipuladas para avaliar os fatores que influenciam o tamanho nuclear.
Após preparar os extratos de ovo de Xenopus, espermatozoides desmembranados e núcleos montados de acordo com o protocolo descrito, colete ovos recém-postos segurando as rãs sobre um vidro, numa placa de Petri reutilizável. Estimule a postura dos ovos aplicando pressão suave na região inferior das costas, próxima à cloaca. Incline a placa em aproximadamente 45 graus para permitir que os ovos se acumulem ao longo da borda do recipiente.
Em seguida, remova o tampão em excesso e adicione quantidade suficiente de MMR um-terço X para cobrir levemente os ovos. Usando um pistilo bem ajustado, macere e homogeneíze um quarto de um testículo em um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de solução salina de Barth modificada com alta concentração de sal, ou MBS. Em seguida, adicione o testículo macerado aos ovos e permita que a fertilização ocorra à temperatura ambiente por 15 minutos.
Após a incubação, alague os ovos com um terço de X MMR. Então, cinco a dez minutos depois, confirme a fertilização verificando a contração do polo animal pigmentado escuro e a rotação dos embriões com seus polos animais voltados para cima. Usando uma pipeta plástica de grande diâmetro, remova cuidadosamente os ovos mortos, lisados ou não fertilizados e não clivados, pois eles induzirão rapidamente a morte dos embriões vizinhos.
Entre uma e 2,5 horas após a fertilização, desjele embrões em cisteína a dois a três por cento dissolvida em MMR a um terço de X, ajustada a pH 7,9. Antes da desjeleação, os embriões ocupam um volume relativamente grande. Realize duas trocas de tampão, com três a quatro minutos cada.
Em seguida, lave completamente os embriões com seis a 10 trocas breves de MMR a um terço para remover todos os vestígios de cisteína. Após a remoção do gel, os embriões se agrupam firmemente e ocupam um volume relativamente pequeno. A seguir, utilizando uma pipeta de vidro de grande diâmetro, transfira embriões saudáveis e fertilizados para uma placa de Petri contendo MMR fresco a um terço.
E, à temperatura ambiente, deixe-os desenvolver até a fase desejada. Continue removendo embriões mortos ou lisados, indicados pela ausência de primeira divisão ou por aparência esbranquiçada e inchada. Quando os embriões atingirem o estágio 11,5 a 12, transfira-os para MMR fresco na proporção de um terço X, suplementado com 0,5 milimolar de cicloheximida, e incube os embriões à temperatura ambiente por uma hora para detê-los na interfase tardia.
Com uma pipeta de vidro ou plástico de grande diâmetro, transfira um mínimo de 15 embriões em interfase parados para um tubo de microcentrífuga. Adicione um mililitro de tampão de lise de ovos, ou ELB, suplementado com um microlitro de solução estoque de LPC aos embriões. Inverta suavemente o tubo para lavar os embriões.
Em seguida, deixe os embriões sedimentarem no fundo do tubo. Antes de remover o tampão, repita a lavagem mais duas vezes. Re-suspenda os embriões em 500 microlitros de ELB, acrescidos de 0,5 microlitros do estoque de LPC, 5 microlitros de cicloheximida 19,7 milimolar e 5 microlitros de citocalasina D 35,5 milimolar para inibir a polimerização de actina.
Centrifugue as amostras em uma centrífuga de bancada a 200 vezes G durante um minuto, depois remova o excesso de tampão e use um pistilo para esmagar completamente os embriões. Coloque as amostras esmagadas em um rotor de cestos oscilantes e centrifugue a 10.000 vezes G e 16 graus Celsius por 10 minutos. Com uma ponteira de pipeta de 200 microlitros, perfure a camada lipídica a partir do topo e, usando uma ponteira de pipeta limpa, remova a camada citoplasmática de cor âmbar intermediária para um tubo de tamanho apropriado.
Suplemente o extrato de embrião com os seguintes reagentes. Em seguida, inverta suavemente o tubo para homogeneizar. Depois, após visualizar os núcleos embriônicos endógenos no extrato preparando um esmagamento conforme o protocolo descrito no texto, remova os núcleos do extrato adicionando primeiro um volume igual de ELB contendo os reagentes listados aqui.
Inverta suavemente o tubo para homogeneizar. Centrifugue a amostra em rotor de balde oscilante a 17.000 × g a 16 °C por 15 minutos. Em seguida, colete o sobrenadante, tomando cuidado para evitar qualquer lipídio remanescente na parte superior, e deixe os núcleos em pellet no fundo sem perturbar.
Prepare uma abóbora conforme descrito no protocolo do texto para garantir que a maioria dos núcleos tenha sido removida. Em seguida, utilize o extrato fresco ou alíquota a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius. Isole os núcleos montados no extrato de ovo diluindo de 25 a 150 microlitros de núcleos pré-montados em um mililitro de ELB em um tubo de 1,5 mililitro.
Centrifugue a 1600 × g e quatro graus Celsius por três minutos. Em seguida, remova o tampão, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione ao pellet um volume de extrato de embrião equivalente ao volume original do extrato de ovo e bata suavemente no tubo para desagregar o pellet e ressuspender os núcleos.
Incube à temperatura ambiente por 90 minutos, batendo suavemente no tubo para misturar a cada 15 a 30 minutos. Após a incubação, bata no tubo para ressuspender os núcleos logo antes de adicionar 500 microlitros de ELB com 15% de glicerol e 2,6% de paraformaldeído. Inverta o tubo imediatamente e coloque-o em um rotador à temperatura ambiente por 15 minutos.
Prepare os tubos para centrifugação equipando tubos de vidro redondos de 15 mililitros com inserções plásticas de fundo redondo. Adicione 5 mililitros de tampão de amortecimento nuclear, depois coloque uma lamínula circular de 12 milímetros dentro do tubo, certificando-se de que ela fique plana sobre a inserção plástica. Usando uma ponteira de pipeta de grande diâmetro, sobreponha suavemente a solução de núcleos fixados sobre o amortecimento nuclear.
Centrifugue em um rotor de balde oscilante a 1.000 × g e 16 °C por 15 minutos. Em seguida, use um aspirador para remover todo o tampão e segure o inserto plástico na parte superior do tubo. Depois, com um par de pinças finas, remova a lamínula, tomando cuidado para observar o lado da lamínula no qual os núcleos foram depositados.
O hospedeiro fixa a lamínula em metanol frio por cinco minutos à temperatura ambiente. Transfira a lamínula, com o lado dos núcleos voltado para cima, para uma folha de filme plástico de parafina que reveste uma placa de Petri grande e plástica. Em seguida, coloque lenços descartáveis umedecidos ao longo das bordas da placa para prevenir desidratação.
Com 500 microlitros de PBS NP40, reidrate os núcleos sobre a lamínula por cinco a 10 segundos e aspire. Em seguida, sobreponha cuidadosamente 75 microlitros de PBS com 3% de BSA sobre a lamínula e deixe bloquear à temperatura ambiente por uma hora ou à 4 °C durante a noite. Remova o tampão de bloqueio e incube com o anticorpo primário diluído em PBS com 3% de BSA.
Em seguida, lave as amostras com cinco trocas imediatas de PBS NP40. Repita esses passos de incubação e lavagem com anticorpos secundários. Incube com 10 microgramas por mililitro de Hoechst diluído em PBS 3% BSA por cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, lave cinco vezes com PBS NP40 e remova todo o excesso de tampão. Por fim, monte a lamínula sobre uma lâmina com cinco microlitros de meio de montagem antidesbotamento. Use esmalte incolor para selar a lamínula e realize imediatamente a imagem em um microscópio de epifluorescência ou armazene a 40 graus Celsius para imagens posteriores.
Esta figura mostra a montagem de núcleos em extrato de ovo. De 30 a 45 minutos após o início da reação, os núcleos espermáticos finos e em forma de S devem começar a se espessar, formando massas de cromatina com formato semelhante ao de lesmas. Após a montagem nuclear, a forma do núcleo deve tornar-se mais arredondada e o volume nuclear deve aumentar à medida que o envelope nuclear se expande e as proteínas nucleares são importadas.
Como mostrado aqui, uma preparação esmagada corada com Hoechst de uma pequena alíquota do extrato de embrião mostra muitos núcleos corados, indicando que a preparação do extrato foi bem-sucedida. Após a remoção dos núcleos por centrifugação, em comparação com a primeira preparação, deverá restar muito poucos núcleos no extrato, conforme revelado neste painel, garantindo que núcleos endógenos não interfiram na análise subsequente. Caso ainda haja núcleos presentes, uma segunda rodada de centrifugação é necessária.
Neste ensaio de encolhimento nuclear, núcleos de extrato de ovo ressuspendidos em extrato de embrião em estágio tardio tornam-se com êxito menores ao longo do tempo. No entanto, núcleos incubados com extrato de embrião inativado pelo calor não diminuem. Repetir o experimento várias vezes é importante para abordar a variabilidade inerente do ensaio.
Uma vez dominado, todo o protocolo pode ser realizado em dois dias, sendo que o próprio ensaio de encolhimento nuclear dura aproximadamente quatro horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar a qualidade dos ovos e embriões ao longo de todo o processo e ter muito cuidado para evitar a camada de pellet e a camada lipídica ao coletar o extrato citoplasmático após a centrifugação. Os resultados obtidos ao seguir este procedimento devem ser validados.
Por exemplo, a microinjeção de embriões ou a transfeção em cultura celular. Além disso, este método pode ser utilizado para investigar a regulação do tamanho de outras organelas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia celular nuclear explorarem os mecanismos regulatórios do tamanho nuclear e o papel funcional do tamanho nuclear no desenvolvimento e na carcinogênese.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar e isolar núcleos de extrato de ovo de Xenopus, gerar embriões de Xenopus e extrato de embrião, realizar o ensaio de encolhimento nuclear e visualizar os resultados.
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Visão Geral
Este estudo utiliza extratos de ovo e embrião de Xenopus para desenvolver um novo ensaio de escalonamento nuclear voltado para compreender os mecanismos que regulam o tamanho nuclear. O método permite a manipulação da composição do extrato livre de células para investigar a dinâmica do tamanho nuclear.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Dinâmica nuclear
- Sistemas modelo Xenopus
Contexto
- Compreender a regulação do tamanho do núcleo é essencial para a função celular.
- Extratos de embriões de Xenopus fornecem uma plataforma versátil para manipulação experimental.
- Estudos anteriores demonstraram variabilidade no tamanho do núcleo entre diferentes tipos celulares.
- A identificação dos mecanismos de escala nuclear pode aprimorar nosso conhecimento em biologia celular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio que demonstre como núcleos grandes podem encolher para tamanhos menores.
- Explorar os mecanismos regulatórios por trás do tamanho nuclear em células.
- Utilizar extratos de Xenopus para obter insights experimentais sobre a biologia nuclear.
Métodos Utilizados
- Preparação de extratos de ovo de Xenopus.
- Uso de espermatozoides desmembranados e núcleos montados.
- Coleta de ovos recém-postos de rãs.
- Aplicação de pressão suave para promover a postura dos ovos.
Resultados Principais
- O ensaio demonstra efetivamente a redução de núcleos grandes.
- A manipulação da composição do extrato revela informações sobre a regulação do tamanho nuclear.
- Os achados contribuem para a compreensão da dinâmica nuclear na biologia celular.
- O método mostra potencial para pesquisas futuras sobre mecanismos de escalonamento nuclear.
Conclusões
- O estudo fornece uma abordagem inovadora para investigar a regulação do tamanho do núcleo.
- Os extratos de Xenopus são uma ferramenta valiosa para a pesquisa em biologia celular.
- Estudos futuros podem se basear nestes achados para explorar mecanismos celulares adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a regulação do tamanho do núcleo fornece insights mecanicistas relevantes para a biologia do câncer, onde a morfologia nuclear alterada atua como biomarcador diagnóstico e prognóstico. Este ensaio livre de células baseado em Xenopus permite a dissecção bioquímica de fatores citoplasmáticos que impulsionam a escalação nuclear no desenvolvimento, apoiando a redução de riscos de alvos na fase inicial de descoberta. A adaptabilidade do ensaio à manipulação de extratos facilita a identificação de novos reguladores, aumentando a confiança preditiva em campanhas de triagem focadas em vias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de componentes citoplasmáticos que regulam o tamanho do núcleo, apoiando a validação funcional de alvos putativos em um sistema baseado em extratos escalonável.
- Valor Operacional: Facilita a perturbação bioquímica rápida de extratos de ovo e embrião para avaliar o engajamento e a atividade do alvo sem a complexidade celular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas da área superficial nuclear (redução de 20-60%) adequadas para triagem de alto conteúdo de compostos moduladores ou perturbações genéticas.
- Valor Operacional: Utiliza preparação padronizada de extrato de embrião para garantir reprodutibilidade entre ensaios, permitindo avaliação confiável de compostos em formato livre de células.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona fenótipos de encolhimento nuclear in vitro com relevância in vivo por meio da validação por microinjeção em embriões, apoiando a continuidade translacional.
- Valor Operacional: Oferece uma etapa mecanicista de redução de riscos antes da triagem fenotípica em modelos de animais inteiros, confirmando os efeitos mediados pelo alvo no tamanho nuclear.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial, onde informações mecanicistas obtidas pela modulação do tamanho nuclear orientam a validação de alvos e as etapas de identificação de compostos promissores antes do investimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre reguladores do tamanho nuclear ao isolar atividades citoplasmáticas que promovem o ajuste de escala nuclear em um sistema bioquímico definido.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio do encolhimento nuclear quantificável, possibilitando a comparação de condições de extrato ou tratamentos com compostos.
- Análises: Fornece alterações mensuráveis na área da superfície nuclear como leitura funcional para classificar a potência de moduladores ou a especificidade do alvo.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio de microinjeção em embriões, garantindo que os efeitos observados in vitro sejam traduzidos para um sistema vivo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para investigar a dinâmica nuclear em múltiplos alvos ou contextos de doenças com mínima reotimização.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em torno dos mecanismos de controle do tamanho nuclear.
- Valor Operacional: Promove padronização e escalabilidade por meio de protocolos definidos de preparação de extratos e isolamento nuclear.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avançar/não avançar ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos associados a alterações na morfologia nuclear em doenças.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer evidências mecanicistas para o avanço de alvos com base em fenótipos de escalonamento nuclear.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de embriões de Xenopus, preparação de extratos e técnicas de montagem nuclear.
- Depende do acesso a equipamentos de centrífuga, microscopia de fluorescência e reagentes para fixação e coloração nuclear.
- Necessita padronização entre equipes para o estadiamento de embriões, controle de qualidade dos extratos e métodos de quantificação nuclear.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o ensaio a sistemas não-Xenopus ou a medições alternativas de tamanho de organelas.
- Inclui limitações práticas, como a variabilidade inerente ao ensaio, que exige replicação, e a necessidade de validação in vivo para confirmar a relevância fisiológica.
