Name: Um ensaio-Free Cell Usando Xenopus laevis Embryo Extrai para estudar mecanismos de regulação Tamanho Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio livre de células usando extratos de embriões de Xenopus laevis para estudar mecanismos de regulação do tamanho nuclear. Este método permite manipular a composição do extrato para investigar a dinâmica nuclear.

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Membros dos laboratórios Levy e Gatlin, bem como colegas do Departamento de Biologia Molecular, ofereceram conselhos e discussões úteis. Rebecca Heald forneceu suporte nos estágios iniciais de desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo NIH / NIGMS (R15GM106318) e pela American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Todos os procedimentos e estudos de Xenopus foram realizadas em conformidade com o Guia NRC para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 8ª edição. Protocolos foram aprovados pela Universidade de Wyoming Institutional Animal Care e Use Committee (Assurance # A-3216-01). 1. Preparação de X. Extrato laevis Egg (adaptado de 27,28) <ol><li> Prime X. feminina laevis rãs um mínimo de três dias e um máximo de duas semanas antes da coleta de ovos com um único IU injeção de gonadotrofina de égua prenhe (PMSG) 100. </li><li> Um dia antes do experimento, injetar rãs imunizadas com 800 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) e lugar a 16 ° C em 1 L por sapo de 1 / 3x toques modificados do Marc (MMR). Ver Tabela 1 para todas as composições de tampão. Nota: Algumas rãs não põem ovos ou põem ovos de má qualidade. Normalmente 2 - 3 rãs são injetados para garantir pelo menos um sapo vai colocar sufficiennúmeros t de ovos de boa qualidade. O sapo média põem ovos suficientes para produzir pelo menos 1 ml de extrato de ovo. </li><li> Prepare 1 G 1 / MMR 3x com água desionizada destilada fria (ddH2O), 500 ml de tampão B, 1 L de tampão C, 500 ml de tampão D e 100 mL de tampão E. </li><li> Transferência puseram ovos para um prato de cristalização de vidro (150 x 75 mm). Usando um plástico Pasteur pipeta com a ponta cortada, fazenda fora inchado activado ovos brancos ou ovos lisadas. reter apenas ovos com pólos animais escura distintos e iguais e pólos vegetais brancos. </li><li> Preparar 13 x 51 mm tubos de centrifugação com 1 ml de tampão E suplementado com 355 | iM de citocalasina D adicionado imediatamente antes da utilizao no passo 1.7. </li><li> Dejelly e lavar os ovos. <ol><li> Lavar os ovos brevemente com frio 1/3 x MMR em um copo de tamanho adequado, mudando o tampão 3 - 4 vezes. </li><li> Retire as peles de geléia de os ovos de incubação com tampão B. Isso vai demorar 3-10 min. Como os casacos de geléia nublados são liberados a partir do ovos, mudar o tampão. Nota: Dejellying é completa quando os ovos aparecem bem embalado no canto do prato quando inclinado e pólos vegetais são orientados para baixo. Os ovos são muito mais frágeis após dejellying, por isso não incubar os ovos com tampão B durante mais de lavagens necessárias e posteriores precisam ser realizadas com muito cuidado. </li><li> Lavar os ovos brevemente com 3 - 4 mudanças de tampão C. </li><li> Lavar os ovos brevemente com 2 mudanças de tampão D. </li><li> Lavar os ovos brevemente com 2 mudanças de tampão E. </li></ol></li><li> Preencha tubos de centrífuga com ovos usando uma ampla pipeta furo de vidro ou conta-gotas de plástico. Aspirar off tampão excesso. Para embalar os ovos e remover tanto tampão quanto possível, de centrifugação em rotor basculante a 212 xg durante 60 seg e em seguida a 478 xg durante 30 seg. Aspirar off tampão excesso. Nota: É importante remover tanto quanto possível o tampão em excesso neste passo para garantir o extracto de ovo é minimamente diluídos. </li><li> Numa oscilante<html> rotor de cesto, ultracentrífuga sob vácuo durante 15 min a 12000 xg e 4 ° C para esmagar ovos aberta e separar-se em camadas diferentes, com o citoplasma sendo a camada de cor âmbar no meio. Remover tubos de centrífuga e coloque imediatamente em gelo. </li><li> Recolher o extracto. <ol><li> Utilizando uma agulha de calibre 18 e seringa, perfurar o tubo de centrifugação imediatamente acima da camada pigmentada escura na parte inferior do tubo e remover a camada de cor âmbar citoplasmática meio. Não coletamos nenhuma da camada lipídica superior. Recolhe-se o citoplasma em um tubo adequadamente dimensionado. Nota: Geralmente, um sapo produz pelo menos 1 ml de extrato. </li><li> citoplasma suplemento com 1 / 1.000 o volume de 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 do volume de estoque LPC, e 1/50 do volume de 50x mix de energia. Inverta suavemente o tubo para misturar. Não excessivamente pipete o extrato. </li><li> Manter o extracto sobre gelo e usá-lo dentro de 3 horas de preparação para obter os melhores resultados. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 2. Preparação de Demembranated Sperm X. laevis (adaptado de 29) Nota: Os volumes de procedimentos aqui apresentados são para até 8 testículos. <ol><li> Remover 0,05% benzocaína (estoque benzocaína a 10% preparada em etanol e diluiu-se a 0,05% na água do tanque da rã) a partir de 4 ° C e aquecer até à temperatura ambiente. Anestesiar e sacrifício masculino X. laevis rãs em solução benzocaína à temperatura ambiente durante 20 - 30 min. Certifique-se de morte por ausência de batimentos cardíacos por examinar e sentir a área do peito, pela falta de resposta à estimulação mecânica, e / ou por decapitação. </li><li> Faça uma incisão em forma de U ao longo do abdómen. Retire a massa em tubo de corpos gordos amarelos. Na parte superior dos rins, testículos localizar as massas, que são cor de rosa pálido cerca de 1 cm de comprimento 29 de forma oval. Extirpar os testículos e juntá-las em papel absorvente para remover o sangue e outros tecidos. </li><li> Lavar testículos em tampão T. A utilização de um pilão apertado equipado para picar testículos com 1 ml de tampãoT em um tubo de 1,5 ml até ficar homogénea (10 golpes ou mais). Centrifugar 5 - 10 segundos num mini-centrifugador e recolher o sobrenadante, a remoção de grandes pedaços de tecido. Repetir a centrifugação mais uma vez e recolher o sobrenadante. </li><li> Transferir a solução contendo esperma a um tubo de plástico de 15 ml. Aumenta o volume a um total de 2 ml com tampão T. Centrifugar a 1.411 xg durante 10 min a 16 ° C para sedimentar o esperma. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão T. Centrifugar a 1.411 xg durante 10 min a 16 ° C. Repetir esta etapa uma vez ou duas vezes como necessário para limpar o pelete de glóbulos vermelhos e somáticas. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão T e 300 ul de tampão de S. incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Nota: Tampão S contém a lisolecitina, que é responsável pela demembranation. </li><li> Adicione três volumes de tampão R (preparada antes da utilização). Inverta tubo exatamente uma vez. Centrifugar a 1.411 xg durante 15 min a 16 &amp;# 176; C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão R e, em seguida, adicionar um adicional de 2 ml de tampão de R. Centrifugar a 1.411 xg durante 15 min a 16 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50 ul de tampão T. </li><li> Diluir 1 mL demembranated núcleos de esperma com 9 ul de tampão T. Aplique esta diluição para um hemocitômetro. Contar o número de núcleos finas de esperma em forma de S em uma grande grade 4 x 4, e multiplicar esse número por 100 para obter a concentração das ações em núcleos de esperma por mL. </li><li> Diluir o estoque para 100.000 núcleos de esperma por ul com tampão de T, resultando em um estoque 200x. Preparar 3 - 5 mL alíquotas. congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Montagem Nuclear <ol><li> Suplemento 100 ul de extracto de ovo com 1,5 mL de ciclo-heximida 35,5 mM (concentração final de ~ 0,5 mM), 6 ul de 20x solução de partida de cálcio (concentração final de ~ 0,6 mM), e 0,7 ul 200x esperma (concentração final ~ 700esperma núcleos / uL). Dimensionar o volume de reação cima ou para baixo, conforme necessário. Inverter ou bata suavemente para misturar. Nota: Extrato de um ciclo de metaphase em interfase fornece uma plataforma mais robusta e confiável para a montagem nuclear. </li><li> Incubar em um banho de água a 16-20 ° C durante 90 min. Misturar batendo suavemente a cada 15 min para assegurar núcleos permanecem suspensas no extracto. </li><li> Monitorar o progresso do conjunto nuclear a 45 min através da preparação de uma polpa como segue. <ol><li> Pipeta de 2 l de extracto numa lâmina de vidro e adicionar 2 ul correção núcleo. </li><li> Overlay com uma lamela de 22 mm2. Imagem em um microscópio de epifluorescência, utilizando água, óleo ou ar 20 - objetivos 100X e um filtro DAPI. Nota: Os núcleos podem ser visualizadas por imagiologia de campo brilhante, mas são muito mais fáceis de visualizar por fluorescência. </li><li> Use núcleos imediatamente ou alíquotas de flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Nota: A adição de 4% de glicerol ao pr núcleosIOR ao congelamento pode ajudar a manter a sua integridade. núcleos congelados são geralmente ainda viável e capaz de importação nuclear, no entanto, o processo de congelamento pode conduzir a núcleos frágeis rompidas ou mais estruturalmente. Os núcleos até um ano após a congelação pode ser usado. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de X. laevis Extrato de embrião <ol><li> Induzir X. feminina laevis rãs põem ovos como descrito em 1.1 e 1.2. </li><li> Isolar testículos de X. masculino rãs laevis, conforme descrito em 2.2. Submerge testículos em meios L15 suplementado com 50 UI / ml de penicilina e estreptomicina, em um vidro de 35 x 10 mm numa caixa de Petri. Armazenar a 4 ° C por até duas semanas. </li><li> Recolha e fertilizar ovos. <ol><li> Recolher ovos frescos, mantendo rãs sobre um vidro reutilizável placa de Petri e promover a postura de ovos, aplicando pressão suave para a parte inferior das costas perto da cloaca. Espremendo o sapo demasiado duro pode resultar em lesões, levando a um abdômen inchado e requiring eutanásia 29. </li><li> Prop o prato a um ângulo de aproximadamente 45 °, para recolher ovos permitir na borda do prato, remover todo o excesso de tampão, e adicionar suficiente um / 3x MMR para cobrir apenas os ovos. Fertilizar os ovos dentro de 15 min após a colheita. </li><li> Usar um pilão firmemente ajustado para macerar e homogeneizar 1/4 de um testículo em um tubo de 1,5 mL com 500 uL de elevado teor de sal de modificação salina de Barth (elevado teor de sal MBS). Adicionar testículos maceradas para os ovos e para permitir que a fertilização ocorra à temperatura ambiente durante 15 - 20 min, depois inundar ovos com 1 / 3x MMR. Nota: Eficácia dos testículos diminui com o tempo de armazenamento, por conseguinte, mais tecido testículos pode ser necessário para a fertilização bem sucedida quando se utiliza testículos que foram armazenados durante mais de uma semana. </li><li> Confirmar fertilização através da verificação de contracção do polo animal pigmentada escura e pela rotação dos embriões com os seus pólos animais voltado para cima, geralmente cerca de 20 - 30 min após a adição de Teste esmagados. Espere a primeira clivagem celular para ocorrer dentro de 90 min. </li><li> Usando uma ampla pipeta furo de vidro diligentemente remover mortos (branco e inchado ou distribuição desigual de gema e pigmento), lise, ou ovos não fertilizados (ou seja, não clivada), como eles vão rapidamente induzir a morte em embriões vizinhos. </li><li> Em qualquer lugar 1-2,5 horas após a fertilização, dejelly embriões em 2-3% de cisteína dissolvido em 1/3 x MMR e ajustada a pH 7,9 com 10 N de KOH. Realizar duas mudanças de tampão que são cada 3-4 min. Lave bem os embriões com 6 - 10 breves mudanças de 1 / 3x MMR para remover todos os vestígios de cisteína. Nota: os embriões Dejellied têm uma membrana vitelina e não são tão frágil como ovos dejellied. </li></ol></li><li> Usando uma pipeta de largura furo de vidro, transferência (ou seja, clivado) Embriões fertilizados saudáveis ​​para uma placa de Petri contendo um fresco / 3x MMR e permitir-lhes a desenvolver para a fase desejada, à TA ou, se é preferido o desenvolvimento mais lento, 16 ° C. Continuar para remover morto ou lyembriões sed indicado por falta de primeira divisão ou a aparência inchada branco. </li><li> Verificar o estágio dos embriões através da verificação de fechamento quase total do blastopore e por comparação com desenhos de embriões em estágios disponíveis em materiais de referência 24. Nota: Os embriões cultivados a 16 ° C irá atingir o estágio 11,5-12 em aproximadamente 12 horas. </li><li> Incubar etapa 11.5 - 12 embriões em fresco 1 / 3x MMR suplementado com ciclo-heximida 0,5 mM durante 1 hora à TA, a prender os embriões no final de interfase. </li><li> Transferir com vidro grande furo ou pipeta de plástico de um mínimo de 15 (de preferência 30 ou mais) embriões prendeu-interfase para um tubo de microcentrífuga. Nota: 15 embriões são suficientes para produzir cerca de 20 ul de extracto. Intensificar conforme necessário. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de lise de ovo (ELB) suplementado com 1 ml de estoque LPC. Inverter cuidadosamente para lavar os embriões, os embriões permitir a cair para o fundo do tubo, e remover o tampão. Repita este passo de lavagem mais duas vezes. &lt;/ Li&gt; <li> embriões ressuspender em 500 mL de ELB mais 0,5 ul de estoque LPC, 5 ul de cicloheximida 19,7 mM e 5 ul de 35,5 mM citocalasina D (para inibir a polimerização de actina). Centrifugar a 200 xg durante 1 min numa microcentrífuga de mesa. </li><li> Remover o excesso de tampão e usar um pilão para esmagar completamente os embriões. Centrifugar num rotor de balde oscilante durante 10 min a 10000 xg e 16 ° C. </li><li> Perfurar a camada de lido a partir do topo com uma ponta de pipeta de 200 uL. Com uma ponta de pipeta de 200 mL limpo, remover a camada de cor âmbar citoplasmática meio a um tubo de tamanho apropriado. </li><li> extracto de embrião suplemento com 1/50 do volume de mistura de energia 50x (para fornecer um sistema de regeneração de ATP), 1/100 do volume de 35,5 mM de ciclo-hexamida, 1/500 do volume de 19,7 mM de citocalasina D, e 1 / 1.000 o volume de estoque LPC. </li><li> Prepara-se uma polpa como descrito no ponto 3.3 para visualizar núcleos embrionárias endógenos presentes no extracto. Nota: extrato de embriões podem ser congelados com<html> os núcleos endógenos neste momento. Alíquota para reduzir a ciclos de congelamento / descongelamento e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para remover os núcleos a partir do extracto de embrião, dilui-se o extracto com um volume igual de ELB contendo 1/50 do volume de mistura de 50x de energia, o volume de 1/100 de 35,5 mM de ciclo-hexamida, 1/500 do volume de 19,7 mM de citocalasina D, e 1 / 1.000 do volume de estoque LPC. Centrifugar num rotor de balde oscilante a 17000 xg durante 15 min a 16 ° C. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante com cuidado para evitar qualquer lípido que permanece no topo. Não perturbe os núcleos sedimentados no fundo do tubo. Prepara-se uma polpa como descrito no ponto 3.3 para assegurar que a maioria dos núcleos foram removidos. Use o extrato fresco ou alíquota e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para inactivar pelo calor extracto de embrião para experiências de controlo, de calor 30 - 100 mL alíquotas de extracto a 56 ° C durante 30 min, utilizando um termociclador. Permitir que o calor extracto inactivado regressar até à temperatura ambiente antes de usar. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. Nuclear Shrinking Ensaio e Imunofluorescência <ol><li> Isolar núcleos montados no extracto de ovo por diluição de 25 - 150 ul de núcleos pré-montados em 1 ml ELB em um tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 1.600 xg durante 3 min a 4 ° C numa mesa de microcentrífuga. Remover o tampão, com cuidado para não perturbar o sedimento de núcleos frágil na parte inferior do tubo. </li><li> Ressuspender núcleos num volume de extracto de embrião igual ao volume original de extracto de ovo utilizado em 5.1. Uso ELB ou extracto inactivado por calor por reacções de controlo, conforme apropriado. </li><li> Bata levemente o tubo para quebrar o pellet e ressuspender os núcleos. Incubar à temperatura ambiente durante 90 minutos, suavemente batendo no tubo para misturar todos os 15 - 30 min. Nota: Na maior parte do encolhimento nuclear ocorre nos primeiros 30 min. </li><li> Monitorar o progresso de encolhimento nuclear, preparando um squash. <ol><li> Pipeta de 2 l de extracto numa lâmina de vidro e adicionar 2 ul correção núcleo. </li><li> Sobreposição com um 22 mm2 </sup&gt; lamela. Imagem num microscópio de epifluorescência. </li></ol></li><li> Toque no tubo para ressuspender os núcleos imediatamente antes da adição de 500 ul de fixador consiste em ELB, 15% de glicerol e 2,6% de paraformaldeído. Inverta imediatamente, e colocar o tubo num agitador rotativo durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare girar tubos equipando 15 ml tubos de vidro de fundo redondo com inserções de plástico de fundo redondo (desenho e esquemas disponíveis mediante solicitação). Adicionar 5 ml de tampão de almofada nuclear. Deixe cair uma lamela circular 12 mm no tubo, sendo certo que está na horizontal na parte superior da inserção de plástico. </li><li> Com cuidado, a camada de solução contendo núcleos fixos na parte superior da almofada nuclear utilizando uma ponta de pipeta de grande calibre. Centrifugar num rotor de balde oscilante durante 15 min a 1000 xg e 16 ° C. </li><li> Use de um aspirador para remover todo o tampão de puxar e a inserção de plástico para o topo do tubo. Remover a lamela com um par de fórceps finos, tendo o cuidado de observar o lado da tampaescorregar para o qual os núcleos foram centrifugadas. Pós-correcção em metanol frio (armazenada a -20 ° C) durante 5 min à TA. </li><li> Transferir lado do núcleo lamela em cima de uma folha de filme de parafina de plástico que reveste uma grande placa de petri de plástico. Coloque toalhetes descartáveis ​​molhado ao longo do lado do recipiente para evitar a desidratação. </li><li> Rehidratar núcleos sobre a lamela com 500 ul de PBS-NP40 (1x PBS mais 0,1% de NP40) e aspirado após 5 - 10 seg. </li><li> Cuidadosamente camada 75 ul de PBS-3% de Albumina de Soro Bovino (BSA) para a lamela. Deixa-se bloquear uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover solução de bloqueio, e incuba-se com anticorpo primário (por exemplo, mAb414 contra o complexo do poro nuclear, 1: 1000) diluída em PBS-BSA a 3% durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Lavar com cinco mudanças imediatas de PBS-NP40. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em PBS-BSA a 3% durante 1 h à TA. Lavar com cinco mudanças imediatas de PBS-NP40. </li><li> Incubarcom 10 ug / ml de Hoechst diluída em PBS-BSA a 3% durante 5 min à TA. Lavar cinco vezes com PBS-NP40. Remova todo o excesso de buffer. </li><li> Monte a lamela numa lâmina com meio de montagem 5 jul antifade. Selo com unhas polonês claro. Imagem imediatamente usando um microscópio de epifluorescência, com 20 - 100x objetivos ou armazenar a 4 ° C para imagens mais tarde. Nota: Execute quantificação como descrito anteriormente 23. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui é apresentado um novo método para estudar os mecanismos de regulação do tamanho nuclear durante o desenvolvimento de X. laevis . A progressão do desenvolvimento está associada a mudanças dramáticas na fisiologia celular, metabolismo, taxas de divisão e migração, bem como alterações nos tamanhos das células e estruturas intracelulares. Esses processos variados são complexos e essenciais, por isso é difícil estudar apenas um desses aspectos do desenvolvimento em um ambiente in vivo . O extrato de emb...

Os tamanhos de organelos celulares tipicamente dimensionado de acordo com o tamanho da célula, e esta tem sido talvez mais bem documentadas para o dimensionamento do tamanho dos núcleos com tamanho de célula de 1-10. Isto é particularmente verdadeiro durante a embriogénese e diferenciação celular, quando reduções dramáticas em ambos celular e tamanho nuclear são frequentemente observados 11,12. Além disso, o tamanho nuclear alterado é um parâmetro chave no diagnóstico e prognóstico do cancro 13-17. Mecanismos que contribuem para a regulamentação tamanho nuclear são pouco conhecidos, em parte devido à complexidade e à natureza essencial da estrutura e função nuclear. O método aqui descrito foi desenvolvido como um ensaio in vitro para o tamanho nuclear de escala que é propício à manipulação bioquímica e a elucidação dos mecanismos de regulação tamanho nuclear. Xenopus laevis extrato de ovo é um sistema bem estabelecido de recapitular e estudar processos celulares complexos em um in vitro </em&gt; Contexto. Esses extratos revelaram novas informações fundamentais sobre vários processos celulares, incluindo a montagem e função do fuso mitótico, retículo endoplasmático, e no núcleo 18-22. Uma vantagem chave do sistema extracto é que X. laevis extratos de ovos representam um citoplasma quase não diluído cuja composição pode ser facilmente alterado, por exemplo, através da adição de proteínas recombinantes ou imunodepleção. Além disso, é capaz de manipular processos essenciais através do emprego de tratamentos que poderiam ser letal num contexto in vivo. Modificações do procedimento de extracto de ovo permitir o isolamento de extratos de X. laevis embriões em vez de ovos, e estes extractos de embriões são igualmente passíveis de manipulação bioquímica 23. Durante X. laevis desenvolvimento, o embrião fertilizado de uma única célula (~ 1 mm de diâmetro) é submetido a uma série de doze divisões celulares rápidas (etapas 1-8) para gerar vários milhares de 50 μm de diâmetro e células menores, chegando a um estágio de desenvolvimento denominado transição midblastula (MBT) ou estágio agosto 24-26. O MBT é caracterizado pelo início da transcrição zigótica, migração celular, divisão celular assíncronos, aquisição de fases de hiato, e estabelecimento de tamanhos de estado estacionário nucleares em vez de expansão nuclear contínuo como no embrião pré-MBT. De estágio 4 a gastrulação (estádios 10,5-12), o volume de núcleos individuais, diminui em mais de 10 vezes 11. Aqui, o objetivo é identificar os mecanismos responsáveis ​​por estas reduções no tamanho nuclear durante a progressão do desenvolvimento. A abordagem é a primeira a montar núcleos em X. laevis extrato de ovo e isolar os núcleos do citoplasma do ovo / extract. Estes núcleos são então ressuspensas em citoplasma de embriões de fase de gástrula tardia. Após um período de incubação, os núcleos de extracto de ovo tornam-se menores no final de extrato fase de embrião. Nós fundamentado que este woulseria um ensaio útil para a identificação de componentes citoplasmáticos presentes em embriões em estágio final que contribuem para o desenvolvimento de escala de tamanho nuclear. Utilizando este ensaio, juntamente com a validação in vivo, demonstrou que a proteína quinase C (PKC) contribui para a redução do desenvolvimento em tamanho nuclear em X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Burro anti-rato IgG</td><td>Molecular Sondas</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP sal dissódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>quimostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de creatina dissódico</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>citocalasina D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>descartável toalhetes (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Prato cristalizador de vidro (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimida H 33342 tricloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Gonadotrofina Coriônica Humana&nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Mídia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lisolecitina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>de Paraformaldeído</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina + Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>TUBOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Filme plástico de parafina (parafilme)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Soro de Égua Grávida Gonadotrofina</td><td>Prospec</td><td>Hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pilão</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidro de fundo redondo, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário (Alexa Fluor 568 burro anti-rato IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (meio de montagem anti-desbotamento)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio-free cell usando<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embryo extrai para estudar mecanismos de regulação tamanho nuclear

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Uma questão fundamental em biologia celular é como tamanhos de células e organelas são regulados. Tem sido desde há muito reconhecido que o tamanho do núcleo geralmente escalas com o tamanho da célula, nomeadamente durante a embriogénese, quando ocorrer uma redução dramática tanto na célula e tamanhos nucleares. Mecanismos de regulação tamanho nuclear são em grande parte desconhecido e pode ser relevante para o cancro onde o tamanho nuclear alterada é um parâmetro de diagnóstico e prognóstico chave. In vivo abordagens para identificar reguladores tamanho nuclear são complicados pela natureza essencial e complexo da função nuclear. A abordagem in vitro descrito aqui para estudar o controlo tamanho nuclear aproveita as reduções de tamanho normal nucleares que ocorrem durante o desenvolvimento de Xenopus laevis. Em primeiro lugar, os núcleos são montados em X. laevis extracto de ovo. Em seguida, esses núcleos são isoladas e novamente suspensas em citoplasma de embriões de fase tardia. Depois de um período de 30 - 90 min de incubação, a área de superfície nucleardiminui em 20 - 60%, proporcionando um ensaio útil para identificar componentes citoplasmáticos presentes em embriões de fase tardia que contribuem para o desenvolvimento de escalonamento tamanho nuclear. Uma das principais vantagens desta abordagem é a relativa facilidade com que os extractos de ovos, bem como de embriões pode ser manipulado bioquimicamente, permitindo a identificação de novas proteínas e actividades que regulam o tamanho nuclear. Tal como acontece com qualquer uma abordagem in vitro, a validação dos resultados de um sistema in vivo é importante, e micro-injecção de X. embriões laevis é particularmente apropriado para estes estudos.

Montagem de núcleos em extracto de ovo Os primeiros passos deste protocolo estão a preparar X. extrato laevis ovo (Protocolo 1) e núcleos de esperma demembranated (protocolo 2). Estes reagentes são então usadas para montar os núcleos de novo (Protocolo 3). A Figura 1 mostra alguns dados representativos. Adição de cálcio conduz o extracto de ovo meioticamente preso em...

Os mecanismos de escalonamento celular e intracelular permanecem indescritíveis. O uso de extratos de embriões de Xenopus tem se tornado cada vez mais comum para elucidar mecanismos de regulação do tamanho das organelas. Este método descreve a preparação do extrato de embrião e um novo ensaio de escala nuclear através do qual os mecanismos de regulação do tamanho nuclear podem ser identificados.

Um ensaio-Free Cell Usando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrai para estudar mecanismos de regulação Tamanho Nuclear

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar extratos de ovo e embrião de Xenopus para produzir um ensaio no qual núcleos maiores reduzem os menores. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia celular nuclear, como quais são os mecanismos que regulam o tamanho nuclear? A principal vantagem desta técnica é que a composição e as atividades do extrato livre de células de Xenopus podem ser facilmente manipuladas para avaliar os fatores que influenciam o tamanho nuclear.Após preparar os extratos de ovo de Xenopus, espermatozoides desmembranados e núcleos montados de acordo com o protocolo descrito, colete ovos recém-postos segurando as rãs sobre um vidro, numa placa de Petri reutilizável. Estimule a postura dos ovos aplicando pressão suave na região inferior das costas, próxima à cloaca. Incline a placa em aproximadamente 45 graus para permitir que os ovos se acumulem ao longo da borda do recipiente.Em seguida, remova o tampão em excesso e adicione quantidade suficiente de MMR um-terço X para cobrir levemente os ovos. Usando um pistilo bem ajustado, macere e homogeneíze um quarto de um testículo em um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de solução salina de Barth modificada com alta concentração de sal, ou MBS. Em seguida, adicione o testículo macerado aos ovos e permita que a fertilização ocorra à temperatura ambiente por 15 minutos.Após a incubação, alague os ovos com um terço de X MMR. Então, cinco a dez minutos depois, confirme a fertilização verificando a contração do polo animal pigmentado escuro e a rotação dos embriões com seus polos animais voltados para cima. Usando uma pipeta plástica de grande diâmetro, remova cuidadosamente os ovos mortos, lisados ou não fertilizados e não clivados, pois eles induzirão rapidamente a morte dos embriões vizinhos.Entre uma e 2,5 horas após a fertilização, desjele embrões em cisteína a dois a três por cento dissolvida em MMR a um terço de X, ajustada a pH 7,9. Antes da desjeleação, os embriões ocupam um volume relativamente grande. Realize duas trocas de tampão, com três a quatro minutos cada.Em seguida, lave completamente os embriões com seis a 10 trocas breves de MMR a um terço para remover todos os vestígios de cisteína. Após a remoção do gel, os embriões se agrupam firmemente e ocupam um volume relativamente pequeno. A seguir, utilizando uma pipeta de vidro de grande diâmetro, transfira embriões saudáveis e fertilizados para uma placa de Petri contendo MMR fresco a um terço.E, à temperatura ambiente, deixe-os desenvolver até a fase desejada. Continue removendo embriões mortos ou lisados, indicados pela ausência de primeira divisão ou por aparência esbranquiçada e inchada. Quando os embriões atingirem o estágio 11,5 a 12, transfira-os para MMR fresco na proporção de um terço X, suplementado com 0,5 milimolar de cicloheximida, e incube os embriões à temperatura ambiente por uma hora para detê-los na interfase tardia.Com uma pipeta de vidro ou plástico de grande diâmetro, transfira um mínimo de 15 embriões em interfase parados para um tubo de microcentrífuga. Adicione um mililitro de tampão de lise de ovos, ou ELB, suplementado com um microlitro de solução estoque de LPC aos embriões. Inverta suavemente o tubo para lavar os embriões.Em seguida, deixe os embriões sedimentarem no fundo do tubo. Antes de remover o tampão, repita a lavagem mais duas vezes. Re-suspenda os embriões em 500 microlitros de ELB, acrescidos de 0,5 microlitros do estoque de LPC, 5 microlitros de cicloheximida 19,7 milimolar e 5 microlitros de citocalasina D 35,5 milimolar para inibir a polimerização de actina.Centrifugue as amostras em uma centrífuga de bancada a 200 vezes G durante um minuto, depois remova o excesso de tampão e use um pistilo para esmagar completamente os embriões. Coloque as amostras esmagadas em um rotor de cestos oscilantes e centrifugue a 10.000 vezes G e 16 graus Celsius por 10 minutos. Com uma ponteira de pipeta de 200 microlitros, perfure a camada lipídica a partir do topo e, usando uma ponteira de pipeta limpa, remova a camada citoplasmática de cor âmbar intermediária para um tubo de tamanho apropriado.Suplemente o extrato de embrião com os seguintes reagentes. Em seguida, inverta suavemente o tubo para homogeneizar. Depois, após visualizar os núcleos embriônicos endógenos no extrato preparando um esmagamento conforme o protocolo descrito no texto, remova os núcleos do extrato adicionando primeiro um volume igual de ELB contendo os reagentes listados aqui.Inverta suavemente o tubo para homogeneizar. Centrifugue a amostra em rotor de balde oscilante a 17.000 × g a 16 °C por 15 minutos. Em seguida, colete o sobrenadante, tomando cuidado para evitar qualquer lipídio remanescente na parte superior, e deixe os núcleos em pellet no fundo sem perturbar.Prepare uma abóbora conforme descrito no protocolo do texto para garantir que a maioria dos núcleos tenha sido removida. Em seguida, utilize o extrato fresco ou alíquota a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius. Isole os núcleos montados no extrato de ovo diluindo de 25 a 150 microlitros de núcleos pré-montados em um mililitro de ELB em um tubo de 1,5 mililitro.Centrifugue a 1600 × g e quatro graus Celsius por três minutos. Em seguida, remova o tampão, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione ao pellet um volume de extrato de embrião equivalente ao volume original do extrato de ovo e bata suavemente no tubo para desagregar o pellet e ressuspender os núcleos.Incube à temperatura ambiente por 90 minutos, batendo suavemente no tubo para misturar a cada 15 a 30 minutos. Após a incubação, bata no tubo para ressuspender os núcleos logo antes de adicionar 500 microlitros de ELB com 15% de glicerol e 2,6% de paraformaldeído. Inverta o tubo imediatamente e coloque-o em um rotador à temperatura ambiente por 15 minutos.Prepare os tubos para centrifugação equipando tubos de vidro redondos de 15 mililitros com inserções plásticas de fundo redondo. Adicione 5 mililitros de tampão de amortecimento nuclear, depois coloque uma lamínula circular de 12 milímetros dentro do tubo, certificando-se de que ela fique plana sobre a inserção plástica. Usando uma ponteira de pipeta de grande diâmetro, sobreponha suavemente a solução de núcleos fixados sobre o amortecimento nuclear.Centrifugue em um rotor de balde oscilante a 1.000 × g e 16 °C por 15 minutos. Em seguida, use um aspirador para remover todo o tampão e segure o inserto plástico na parte superior do tubo. Depois, com um par de pinças finas, remova a lamínula, tomando cuidado para observar o lado da lamínula no qual os núcleos foram depositados.O hospedeiro fixa a lamínula em metanol frio por cinco minutos à temperatura ambiente. Transfira a lamínula, com o lado dos núcleos voltado para cima, para uma folha de filme plástico de parafina que reveste uma placa de Petri grande e plástica. Em seguida, coloque lenços descartáveis umedecidos ao longo das bordas da placa para prevenir desidratação.Com 500 microlitros de PBS NP40, reidrate os núcleos sobre a lamínula por cinco a 10 segundos e aspire. Em seguida, sobreponha cuidadosamente 75 microlitros de PBS com 3% de BSA sobre a lamínula e deixe bloquear à temperatura ambiente por uma hora ou à 4 °C durante a noite. Remova o tampão de bloqueio e incube com o anticorpo primário diluído em PBS com 3% de BSA.Em seguida, lave as amostras com cinco trocas imediatas de PBS NP40. Repita esses passos de incubação e lavagem com anticorpos secundários. Incube com 10 microgramas por mililitro de Hoechst diluído em PBS 3% BSA por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, lave cinco vezes com PBS NP40 e remova todo o excesso de tampão. Por fim, monte a lamínula sobre uma lâmina com cinco microlitros de meio de montagem antidesbotamento. Use esmalte incolor para selar a lamínula e realize imediatamente a imagem em um microscópio de epifluorescência ou armazene a 40 graus Celsius para imagens posteriores.Esta figura mostra a montagem de núcleos em extrato de ovo. De 30 a 45 minutos após o início da reação, os núcleos espermáticos finos e em forma de S devem começar a se espessar, formando massas de cromatina com formato semelhante ao de lesmas. Após a montagem nuclear, a forma do núcleo deve tornar-se mais arredondada e o volume nuclear deve aumentar à medida que o envelope nuclear se expande e as proteínas nucleares são importadas.Como mostrado aqui, uma preparação esmagada corada com Hoechst de uma pequena alíquota do extrato de embrião mostra muitos núcleos corados, indicando que a preparação do extrato foi bem-sucedida. Após a remoção dos núcleos por centrifugação, em comparação com a primeira preparação, deverá restar muito poucos núcleos no extrato, conforme revelado neste painel, garantindo que núcleos endógenos não interfiram na análise subsequente. Caso ainda haja núcleos presentes, uma segunda rodada de centrifugação é necessária.Neste ensaio de encolhimento nuclear, núcleos de extrato de ovo ressuspendidos em extrato de embrião em estágio tardio tornam-se com êxito menores ao longo do tempo. No entanto, núcleos incubados com extrato de embrião inativado pelo calor não diminuem. Repetir o experimento várias vezes é importante para abordar a variabilidade inerente do ensaio.Uma vez dominado, todo o protocolo pode ser realizado em dois dias, sendo que o próprio ensaio de encolhimento nuclear dura aproximadamente quatro horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar a qualidade dos ovos e embriões ao longo de todo o processo e ter muito cuidado para evitar a camada de pellet e a camada lipídica ao coletar o extrato citoplasmático após a centrifugação. Os resultados obtidos ao seguir este procedimento devem ser validados.Por exemplo, a microinjeção de embriões ou a transfeção em cultura celular. Além disso, este método pode ser utilizado para investigar a regulação do tamanho de outras organelas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia celular nuclear explorarem os mecanismos regulatórios do tamanho nuclear e o papel funcional do tamanho nuclear no desenvolvimento e na carcinogênese.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar e isolar núcleos de extrato de ovo de Xenopus, gerar embriões de Xenopus e extrato de embrião, realizar o ensaio de encolhimento nuclear e visualizar os resultados.

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Research

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