Name: Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a realizar transdução eficiente de células epiteliais brônquicas humanas primárias usando lentivírus. Este método mantém alta eficiência durante a diferenciação em epitélio pseudoestratificado e pode ser adaptado para outros tipos celulares difíceis de transduzir.

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Agradecemos a Agência de Recuperação Vida Alliance Organ, da Universidade de Miami para fornecer pulmões. Agradecemos também o Dr. Lisa Künzi para a preparação de DNA utilizado para os experimentos mostrados na figura 2B e 3-D, Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak para o vírus mCherry utilizado para os experimentos nas Figuras 3A a C. Também agradecemos Gabriel Gaidosh a partir da instalação de imagem do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Miami. Este estudo foi patrocinado por doações do NIH, a Fundação CF eo hospedeiros de bordo Medical Research Institute com o Dr. Matthias Salathe.

1. Fase 1: Cultura da HEK 293T <ol><li> Prepare meios células HEK (referido como meio de HEK) por adição de 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a elevada glicose de Eagle Modificado Meio de Dulbecco (DMEM). </li><li> Bata de um prato de 10 cm de cultura de tecidos com colagénio I. Mistura de 30 ul de colagénio I, em 2 ml de água destilada. Espalhar a mistura sobre o prato e incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Remover a mistura e deixar secar o prato numa câmara de fluxo laminar durante 15 min. </li><li> Placa células HEK para a placa revestida a uma densidade de 1 x 10 6 células em 10 ml de meio de HEK e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Quando as células HEK são 50-60% confluentes (Figura 1a, 2-3 dias após o plaqueamento), prossiga para a fase 2. Visual avaliação da confluência é suficiente. Sem quantificação é necessária. Nota: as células HEK são cultivadas em meios de HEK (ver acima). Quando eles atingem a confluência, tEi pode ser dividido (por exemplo, 1/5) para baixo ou congelado para uma utilização posterior. </li></ol> 2. Fase 2: Produção e Concentração dos lentivírus (VEs) em células HEK Nota: Os protocolos devem ser executadas em conformidade com as normas institucionais e governamentais sob + condições (Enhanced BSL-2) nos EUA BSL-2. <ol><li> Transfectar utilizando um procedimento de precipitação de cálcio (lipofectamina e outros agentes de transfecção não fosse tão eficiente quanto o procedimento de precipitação de cálcio). O uso de um kit comercial de transfecção é recomendado para assegurar a reprodutibilidade, embora o processo é modificado como se segue. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente. Este é o dia 0. </li><li> Para cada placa de 10 cm de células HEK293, misturar 4,5 g de envelope de ADN PMD2-VSVG, 7,5 ug de embalagem ADN pMDLg / pRRE, 3,75? G de ADN de pRSV-Rev, 10 ug de ADN do vector de expressão de lentivírus, 86 ul de uma solução 2 M de cálcio , e água estéril num tubo de centrífuga de 15 ml para um volume final de 700 ul(As duas últimas soluções são fornecidas no kit de transfecção comercial). </li><li> Gota a gota, adicionar 700 ul de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS, fornecidas com o kit de transfecção) aquando da mistura (na câmara de fluxo laminar) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min (efectuar o passo 4, enquanto espera). </li><li> Durante o tempo de incubação inicial, depósito de 5 ul da mistura sobre uma lâmina. Verifique a gota sob um microscópio com uma objetiva de 10X, concentrando-se lentamente para cima e para baixo. Um precipitado fino deve ser visível, confirmando o processo de precipitação de fosfato de cálcio (Figura 1b). </li><li> Pare a precipitação após 30 minutos por adição de 10 ml de células HEK media e pipeta cima e para baixo para misturar. </li><li> Leve o prato de células HEK do passo 2,1-2,5, e remover o meio (dia 0). Adicionar a solução do passo 2.5 precipitado cuidadosamente e lentamente ao longo da borda do prato. </li><li> No dia seguinte (dia 1), remova e descarte o meio contendo o precipitado e substituí-lo wom 10 ml de meio de HEK. Verifique se o precipitado fino sob o microscópio: deve ser visível no prato em espaços vazios entre as células (Figuras 1C e D). </li><li> No dia 2, recolhe meios de comunicação com uma seringa, filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 um para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 3,8 ml de um polietileno-glicol 40% (PEG). Inverter 5x para misturar e armazenar a 4 ° C durante pelo menos 24 horas (para precipitar o PEG para formar, mas não mais do que 5 dias) até que todos os conjuntos de vírus estão completas. </li><li> Repita o passo 2.8 nos dias 3 e 4. No dia 4 não coloque meio HEK mas descontaminar com 10% de água sanitária e rejeitar a placa. </li><li> Centrífuga de todos os tubos de colheita (geralmente todas as coleções em conjunto no dia 5) a 1.650 g durante 20 min a 4 ° C para sedimentar o vírus. Retirar e descartar o sobrenadante, e girar novamente a 1.650 xg por 5 min a 4 ° C para recolher e remover qualquer remanescente de PEG sobrenadante. </li><li> Resuspend a pelete de cada tubo, em 200 ul de meio de crescimento epitelial brônquica (BEGM) sem anfotericina B 8. Reuni-los em conjunto e a aliquota de 200 ul. vírus armazenar a -80 ° C. Alíquota um adicional de 10 ul de realizar o ensaio ELISA Gag de HIV-1 (p24) antigénio. </li><li> Utilizando um kit de ELISA comercial, realizar um ensaio de antígeno p24 de acordo com o protocolo do fabricante. O ensaio dá uma estimativa da p24 viral em pg / ml. </li></ol> 3. Fase 3: células de cultura primária HBE <ol><li> Placa HBE células em 10 ml BEGM meios (100 ul com anfotericina B se 0 passagem células são usados ​​para eliminar a possibilidade de contaminação por fungos) a uma densidade de 1 x 10 6 células em colagénio I revestido 10 centímetros prato de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, remover o meio e substituir por 10 ml BEGM (com 100 ul de anfotericina B por células passagem 0) para um total de 4 dias. Voltar para incubadora. </li><li> Após 4 days, use apenas BEGM sem meios anfotericina B. Alterar a cada dois dias. </li><li> Quando as células são 80-90% confluentes (Figura 2a; ~ 7 dias após o plaqueamento), proceda com a transdução (preste atenção a 3,5 para preparação antes de transdução). Novamente, a avaliação visual de confluência é suficiente. Sem quantificação é necessária. </li><li> Antes de transdução, revestir os insertos de suporte permeável com uma solução de colagénio IV diluídos a 1/10 com água destilada estéril. Adicionar 200 mL de cada inserção e deixar secar durante a noite na câmara de fluxo laminar. </li></ol> 4. Etapa 4: Transdução de Células HBE <ol><li> Remover o meio, adicionar 3 ml de tripsina a 0,1% em ácido etilenodiaminotetracético 1 mM em salino tamponado com fosfato (EDTA / PBS) e incuba-se 5 minutos a 37 ° C e 5% de CO 2. Verifique sob o microscópio (objetiva de 10X) para ver se todas as células são separadas. Se não, voltar para a incubadora para um adicional de 5 min. </li><li> Quando todas as células são separadas, adicione 3ml de inibidor de tripsina de soja (SBTI 1 mg / ml), misturar e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml. Agregar as células por centrifugação a 460 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e pellet ressuspender em 3 ml de BEGM e prosseguir com a contagem. </li><li> Ressuspender as células (HBE agora uma passagem ou P1) a uma razão de 2 x 10 5 células por um suporte permeável a inserção de 12 mm de 400 ul de BEGM (ver Tabela 2). Extrapolar estes números com base na quantidade de pastilhas de suporte permeável que vai ser transduzidas. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Superfície </td><td> área de superfície </td><td> A contagem de células </td><td> meios de comunicação </td><td> Volume (media) </td></tr><tr><td> Placa de 10 cm </td><td> 52,7 cm 2 </td><td> 1 x 10 6 </td><td> BEGM </td><td> 10 ml </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> filtro de 12 milímetros </td><td> 1,13 cm 2 </td><td> 2 x 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> filtro de 24 milímetros </td><td> 4.52 cm 2 </td><td> 8 x 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 800 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Meios extrapolações por contagem de células. <ol start="5"><li> Usando uma multiplicidade de infecção fator (MOI) de 4, adicionar o volume apropriado de vírus à suspensão de células. </li><li> Adiciona-se brometo de hexadimetrina a um / ml de concentração final de 2 ug. </li><li> Dispense 400 ul da mistura (BEGM, HBE células, vírus e brometo Hexadimetrina) por inserção de suporte permeável no compartimento apical, e adicionar 1 ml de BEGM sozinho para o compartimento basolateral. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. Células Sempre placa HBE sem vírus como controle e seleção de teste puromicina se for o caso. </li><li> No dia seguinte, REMmídia apical e basolateral ove, lavar com PBS, e substituir os dois compartimentos com interface ar-líquido (ALI) media 8. </li><li> Quando as células estão confluentes, remover o líquido apical (conhecido como o estabelecimento de uma interface ar-líquido). Continuar a alterar o meio (ALI) no compartimento de fundo a cada dois dias até atingirem a maturidade plena; geralmente de 3 a 4 semanas mais tarde. Nota: Se o vector lentiviral que contém um gene de selecção tal como a puromicina, as células podem ser seleccionadas através da adição de puromicina de acordo com uma curva de concentração de selecção. Para as células HBE, uma concentração de 1 ug / ml foi determinado a ser ideal para a selecção de células transduzidas consistente. No entanto, esta concentração pode ser diferente para outras células ou condições e deve ser determinada por curvas de matar. A adição de puromicina pode começar tão cedo quanto um dia depois de os meios de comunicação foi substituída pela mídia ALI ou posteriores (2-3 dias) para permitir a plena expressão do gene de selecção. Certifique-se de adicionar puromicina a uma inserção que hcomo não foram transduzidas. Puromicina pode ser adicionado até que as células são totalmente diferenciadas. </li></ol>

<ol><li>Ding, B., Kilpatrick, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+production%2C+titration%2C+and+transduction+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons.</a> Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).</li>
<li>Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+development+of+improved+lentiviral+and+retroviral+vectors--design%2C+biosafety%2C+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production.</a> Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).</li>
<li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnol. 13, (2013).</li>
<li>Delenda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+optimization+of+packaging%2C+transduction+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression.</a> J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).</li>
<li>Gresch, O., Altrogge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+difficult-to-transfect+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).</li>
<li>Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+electroporation+conditions+in+primary+and+other+difficult-to-transfect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells.</a> J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).</li>
<li>Castillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+well-differentiated+human+airway+surface+epithelium+by+spheroid+and+lentivirus+vector-transduced+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells.</a> J Gene Med. 6, 846-856 (2004).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFulcher%2C+ML+%22Methods+Mol+Med%22">Methods Mol Med</a>. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+in+tight+junction+formation+between+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells.</a> Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).</li>
<li>Bals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+well-differentiated+airway+epithelium+by+recombinant+adeno-associated+virus+is+limited+by+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry.</a> J Virol. 73, 6085-6088 (1999).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).</li>
<li>Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+retrovirus+gene+transfer+efficiency+by+enhancing+receptor-independent+virus+adsorption+on+target+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes.</a> Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).</li>
<li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+Basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+apical+large+conductance%2C+Ca2%2B-activated%2C+and+voltage-dependent+K%2B+channels+are+required+for+maintenance+of+airway+surface+liquid+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume.</a> J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+cAMP-mediated+regulation+of+ciliary+motility+in+single+primary+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells.</a> J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).</li>
<li>Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta1+and+cigarette+smoke+inhibit+the+ability+of+beta2-agonists+to+enhance+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnol. 6, (2006).</li>
<li>Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+decreasing+the+toxicity+of+polyethylene+glycol+in+mammalian+cell+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization.</a> Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+is+localized+to+cilia+and+contributes+to+ciliary+beat+frequency+regulation+via+production+of+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP.</a> J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Surface+Dehydration+by+Transforming+Growth+Factor+beta+%28TGF-beta%29+in+Cystic+Fibrosis+Is+Due+to+Decreased+Function+of+a+Voltage-dependent+Potassium+Channel+and+Can+Be+Rescued+by+the+Drug+Pirfenidone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone.</a> J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-mediated+reduction+of+large-conductance%2C+Ca2%2B-activated%2C+voltage-dependent+K%2B+%28BK%29+channel+activity+in+airway+epithelial+cells+leads+to+mucociliary+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+adenylyl+cyclase+form+targets+to+axonemes+and+rescues+beat+regulation+in+soluble+adenylyl+cyclase+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).</li>
<li>Ransford, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+contributes+to+ATP+release+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito assegura perto de 100% de eficiência de transdução. No entanto, existem passos durante o processo, que são importantes para alcançar este objectivo. Por exemplo, durante o processo de transfecção, a presença de precipitados na mistura de transdução (gota) ou no prato do dia após a transdução (Figuras 1b e d) são ambos relevantes para uma boa transfecção. A ausência de um precipitado ou a presença de aglomerados pode ser devido a uma omissão de um dos reagentes ...

O desenvolvimento de lentivírus, pseudotipados replicação deficiente (LV) forneceu aos investigadores um método seguro e eficiente para entregar transgenes in vitro 1. Devido à sua expressão a longo prazo, estes LV também poderia ser utilizada para a entrega de agentes terapêuticos in vivo 2,3. A produção de LV requer a co-transfecção de células de rim embrionário humano (HEK) com vários plasmídeos: vector de transferência, gag / pol de empacotamento, rev embalagem, e envelope glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) plasmídeos. Sistemas de empacotamento de terceira geração são considerados mais seguros do que os sistemas de segunda geração, porque o gene rev é codificada num plasmídeo de empacotamento separada, reduzindo assim a possibilidade de recombinação para produzir um lentivírus competente de replicação. Embora os sistemas de embalagem de segunda geração deu cinco unidades de transdução totais mais elevados de dobra, a divisão do genoma viral original para criaro sistema de terceira geração diminuiu o nível de transdução de apenas minimamente 3,4. Enquanto linhas celulares podem ser transduzidas mais facilidade e eficiência, os investigadores mudaram seu foco para as células primárias, porque estes são mais representativos de tecidos in vivo 5,6. No entanto, as células primárias são refratários a transdução. Enquanto a transdução de células epiteliais das vias aéreas totalmente diferenciadas têm sido relatados, a eficiência global não excedeu 15% 7. Aqui descrito é um protocolo que permite a produção de LVS-de título elevado. Uma abordagem passo-a-passo é delineada para atingir quase 100% de eficiência de transdução em células HBE primários. Mais especificamente, o protocolo descreve as condições óptimas de cultura para ter sucesso 3 instrumentais. Resumidamente, as células HEK 293T são transfectadas usando o pCDH lentiviral vector de expressão com o promotor de EF-1 dirigindo a expressão de verde fluorescente melhoradaproteína (eGFP) ou mCherry, uma proteína fluorescente vermelha, e um sistema de empacotamento de terceira geração. LVs libertados para os meios de comunicação são coletadas de 24 a 72 horas mais tarde. As partículas de vírus são concentradas com polietilenoglicol (PEG), um método conveniente e fácil de concentração virai, antes da estimação título utilizando um kit de ensaio imuno antigénio p24 ligado a enzima (ELISA). Subsequentemente, as células HBE primárias indiferenciadas são transduzidas em meios de proliferação (meio de crescimento epitelial brônquica ou BEGM) 8, quando a montar (depois de ser tripsinizadas), a uma multiplicidade de infecção factor 4 (MOI), a adição de brometo de hexadimetrina e incubando durante 16 horas ( pernoite). As células são então deixadas diferenciar. Uma vez que o transgene é expresso viral a longo prazo (usando o promotor apropriado, ver discussão), expressão vai ser mantida durante toda a diferenciação em um epitélio das vias respiratórias pseudo ou pode ser induzida (utilizando um promotor indutível) após a diferenciação. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Este protocolo é de grande interesse para pesquisadores que desejam usar células HBE primários em vez de linhas celulares, e pode ser adaptável a outros difíceis de transdução de tipos de células.

<table><tbody><tr><td>HEK293T/17 células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Uso de Sigma</td><td>12306C</td><td>a 10%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (100x)</td><td>Uso de Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>a 1x</td></tr><tr><td>Colágeno I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>diluir 1:75 em água destilada</td></tr><tr><td>Calphos</td><td>Clontech</td><td>631312</td><td>Kit de transfecção contendo solução de cálcio 2 M, 2x solução tamponada com HEPES (HBS) e H2O estéril</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000</td><td>VWR scientific</td><td>101108-210</td><td>estoque de 40%</td></tr> <tr><td>de anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A9528</td><td>use em 1x</td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina de soja</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 12 mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Sigma</td><td>C7521</td><td>diluir 1:10 em água destilada</td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>estoque de 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Puromicina (10.000x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11138-03</td><td>uso em 1x</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td><td>System Biosciences</td><td>CD532A-2</td><td>vetor de expressão lentiviral</td></tr><tr><td>pMD2-VSVG</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>embalagem DNA</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td>embalagem DNA</td></tr><tr><td>pRSV-rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td>embalagem DNA</td></tr></tbody></table>

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Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

A cultura in vitro de células primárias humanas epiteliais brônquicas (HBE) usando condições de interface ar-líquido fornece um modelo útil para estudar os processos de diferenciação e função das células das vias aéreas. Nos últimos anos, o uso de vectores lentivirais para a entrega do transgene tornou-se prática comum. Embora existam relatórios de transdução de células epiteliais das vias respiratórias totalmente diferenciadas com certos lentivírus digitado pseudo-não-HIV, a eficiência global de transdução é geralmente inferior a 15%. O protocolo aqui apresentado proporciona um método fiável e eficiente para a produção de lentivírus e a transdução de células epiteliais brônquicas humanas primárias. Usando células epiteliais brônquicas indiferenciadas, transdução em meio de crescimento epitelial brônquica, enquanto as células fixar, com uma multiplicidade de infecção de factor de 4 fornece eficiências perto de 100%. Este protocolo descreve, passo-a-passo, a preparação e concentração dos vectores lentivirais de título elevado e thprocesso de transdução de e. Discute-se as experiências que determinaram as condições de cultura ideais para atingir transduções altamente eficientes de células epiteliais brônquicas humanas primárias.

A Figura 1 ilustra diferentes passos chave de avaliar células e soluções durante o processo de transfecção. A Figura 1A mostra a confluência óptimo das células HEK293T antes da transfecção para a produção de vírus. É importante que as células são distribuídos uniformemente ao longo do prato. Figura 1b revela o precipitado em uma gota da mistura de transfecção utilizando brilhantes óptica de campo e uma objectiva 10X. Quanto mais os preci...

As células epiteliais brônquicas humanas primárias são difíceis de transduzir. Este protocolo descreve a produção de lentivírus e sua concentração, bem como as condições ideais de cultura necessárias para obter transduções altamente eficientes nessas células durante a diferenciação para um epitélio pseudoestratificado.

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

O objetivo geral desta metodologia é obter uma transdução altamente eficiente de células epiteliais brônquicas humanas primárias utilizando lentivírus. Este método pode auxiliar pesquisadores que desejam utilizar células epiteliais brônquicas humanas primárias em vez de linhagens celulares e pode ser adaptável a outros tipos celulares difíceis de transduzir. A principal vantagem desta técnica é a alta eficiência de transdução mantida durante toda a diferenciação em um epitélio pseudoestratificado.O protocolo deve ser executado em conformidade com as regulamentações institucionais e governamentais sob condições BSL-2 aprimoradas nos EUA. Após preparar o meio HEK em uma placa revestida com colágeno I, conforme descrito no protocolo textual, utilize 10 mililitros do meio para semear um milhão de células HEK na placa revestida. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que as células atinjam de 50 a 60% de confluência.Isso será considerado o Dia 0. No Dia 0, em uma cabine de fluxo laminar, utilizando um kit comercial de transfeção, aqueça os reagentes à temperatura ambiente. Para cada placa de 10 centímetros de células HEK293, em um tubo cônico de 15 mililitros,

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

Aqui nós descrevemos um método detalhado para o cultivo primário células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes de tecido das vias aéreas brônquicas humanas incluindo o crescimento diferenciado em uma interface ar-líquido. Este método fornece uma fonte abundante de células primárias para investigar o papel do epitélio das vias aéreas pulmonares em saúde humana e doenças.

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Lentivírus são um valioso instrumento de pesquisa para explorar a função do gene, no entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de codificação lentivírus pantropic conhecida ou suspeita de oncogenes. Como alternativa, apresentamos um protocolo mais seguro para o uso de lentivírus ecotropic em células humanas modificadas para expressar o receptor mSlc7a1 ecotropic.

Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Este protocolo descreve um método para alcançar a integração estável de um gene de interesse no genoma humano pelo sistema transcriptionally regulado de Bela adormecida . Preparação da integração dos vetores de Lentivirus defeituosos, a transdução em vitro de células humanas e o ensaio molecular em células transduzidas são relatados.

Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

Apresentam-se aqui detalhados protocolos para a linha de celular de 32G/G-CSF-R precursor mieloide murino de cultivo, realizando a infecções virais e realizar ensaios de proliferação e diferenciação. Esta linha de celular é adequada para estudar o desenvolvimento de células mieloides e o papel dos genes de interesse no crescimento de células mieloides e diferenciação neutrofílica.

Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.

Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório

Aprenda a realizar transdução eficiente de células epiteliais brônquicas humanas primárias usando lentivírus. Este método mantém alta eficiência durante a diferenciação em epitélio pseudoestratificado e pode ser adaptado para outros tipos celulares difíceis de transduzir.

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

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